一种冬虫夏草提取物、制备方法及其用途与流程

1.本发明涉及药物领域，具体涉及一种冬虫夏草提取物、制备方法及其作为免疫抑制剂在预防或治疗免疫相关疾病中的用途。


背景技术：

2.脑苷脂(cerebroside or glycoceramide)属于糖基鞘脂类(glycosphingolipids)，主要存在于动物界，植物和微生物中也有分布。脑苷脂由糖基、脂肪酸链和鞘氨醇链三部分组成。该类化合物虽然都是由糖基、脂肪酸链和鞘氨醇链三部分组成，但因糖的种类、糖苷键、脂肪酸链和鞘氨醇链的长度及支链化程度、羟基和双键的个数与位置等不同，具有结构多样性(j.nat.prod.2017,80,6,1734
–
1741)。化合物结构不同，往往具有不同类型或者不同程度的药理活性，因而脑苷脂类化合物报道具有不同程度的抗肿瘤、抗病毒、抗微生物、神经保护等活性(徐杰，海参脑苷脂的分离纯化、结构分析及其生物活性研究，中国海洋大学博士学位论文，2011)。由于脑苷脂是由亲水性的糖基和亲脂性的脂肪酸链和鞘氨醇链组成，这种结构使之成为生物膜的重要脂质组分之一，能够保证细胞膜结构的完整性。另外，脑苷脂在生物膜极性与非极性界面可形成广泛的氢键网络，这也是构成生物膜层状结构稳定性的重要因素。因此，脑苷脂活性作用温和，毒副作用小。开发新的脑苷脂类化合物或者富含脑苷脂类的提取物治疗慢性疾病成为科研工作者的研究目标。
3.冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌cordyceps sinensis(berk.)sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体，具有调节免疫力、抗肿瘤、抗氧化、防衰老等多种药理作用。文献报道冬虫夏草化学成分主要有多糖、蛋白质、糖醇、核苷、氨基酸、甾醇和有机酸等。从冬虫夏草中提取新的有效成分，能为冬虫夏草的综合质量评价及其日后相关产品开发、应用提供科学依据。


技术实现要素：

4.本发明的发明人对冬虫夏草中有效成分进行提取，首次发现冬虫夏草提取物中含有脑苷脂类成分，并对含有脑苷脂类成分的冬虫夏草提取物进行免疫调节活性研究，发现其具有优异的免疫抑制活性。
5.本发明目的在于提供一类冬虫夏草提取物，其含有脑苷脂类成分，并且具有优异的免疫抑制活性，以及本发明提供该冬虫夏草提取物作为免疫抑制剂在制备预防或治疗免疫相关疾病的药物中的用途。
6.一方面，本发明提供一种冬虫夏草提取物，其特征在于，所述提取物中含有的化合物1的含量为0.39％-0.45％，含有的化合物2的含量为0.10％-0.18％，含有的化合物3的含量为16％-18％，含有的化合物4和5的总含量为12％-15％，含有的化合物6的含量为0.25％-0.45％，含有的化合物7的含量为0.40％-0.50％；其中所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7的结构如下所示：
7.[0008][0009]
在一些实施方案中，本发明所述的冬虫夏草提取物中含有的化合物1的含量为0.43％，含有的化合物2的含量为0.16％，含有的化合物3的含量为17.79％，含有的化合物4和5的总含量为13.58％，含有的化合物6的含量为0.38％，含有的化合物7的含量为0.46％。
[0010]
如无其他说明，本发明中所述的化合物的含量是指：在高效液相图谱2中，含有的化合物色谱峰占高效液相图谱2中总提取物的相对含量。含有的化合物色谱峰占高效液相图谱2中总提取物的相对含量的计算方法是外标一点法，计算公式为：色谱峰占提取物相对含量(％)＝(样品峰面积/对照品峰面积)*对照品浓度*对照品纯度*定容体积/脑苷脂提取物质量*100％。其中定容体积为称取脑苷脂提取物质量加入甲醇定容的体积，脑苷脂提取物质量为配制供试品称取的质量。在本发明的具体实施方案中，本发明用到的对照品为脑苷脂a。
[0011]
在一些实施方案中，本发明所述的冬虫夏草提取物，在高效液相色谱图2中显示6个峰，依次对应化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和5的混合、化合物6、化合物7，保留时间依次对应13.325分钟、13.834分钟、15.006分钟、17.572分钟、19.887分钟、22.093分钟。
[0012]
在一些实施方案中，本发明所述的高效液相色谱的分析条件为：色谱柱：agilent zorbax eclipse plus c18(4.6mm
×
150mm，5μm)；流动相：10mm乙酸铵水溶液(a)-甲醇(b)；流速为1ml/min；梯度洗脱：0～40min，93％b～95％b，后运行10min；柱温为30℃；检测波长205nm；进样量为10μl。
[0013]
另一方面，本发明提供一种冬虫夏草提取物的制备方法，包括以下步骤：
[0014]
(1)冬虫夏草在85％-95％甲醇溶液中提取，获得提取液；
[0015]
(2)将步骤(1)中提取液上样于固相萃取柱中，并依次用95％甲醇洗脱、98％～100％甲醇洗脱，收集98％～100％甲醇洗脱获得的洗脱液。
[0016]
在一些实施方案中，所述洗脱液中含有化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6和化合物7；其中所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7的结构如下所示：
[0017]
[0018][0019]
在一些实施方案中，本发明所述的冬虫夏草提取物的制备方法，步骤(1)中冬虫夏草和85％-95％甲醇溶液的料液比为1:8～1:12。
[0020]
其中料液比表示所用物料的质量与所用溶液的体积比，其中物料的计量单位为g，溶液的计量单位为ml；当料液比为1:8时，表示为1g物料所用的溶液的体积为8ml。
[0021]
在一些实施方案中，步骤(1)中冬虫夏草和85％-95％甲醇溶液的料液比为1:10。
[0022]
在一些实施方案中，所述步骤(1)中甲醇溶液为90％甲醇溶液。
[0023]
在一些实施方案中，所述提取为回流提取。
[0024]
在一些实施方案中，所述提取时间为2～3小时。
[0025]
在一些实施方案中所提取液为提取后的混合液离心后的上清液。
[0026]
在一些具体的实施方案中，所述离心转速为5000r/min。
[0027]
在一些实施方案中，本发明所述的冬虫夏草提取物的制备方法，所述步骤(2)中的固相萃取柱填料为ods填料。
[0028]
在一些实施方案中，所述步骤(2)为：将步骤(1)中提取液上样于ods填料的固相萃取柱中，并依次用95％甲醇洗脱、100％甲醇洗脱，收集100％甲醇洗脱获得的洗脱液。
[0029]
在一些实施方案中，所述100％甲醇洗脱获得的洗脱液进一步浓缩。
[0030]
在一些实施方案中，本发明所述的冬虫夏草提取物的制备方法，包括以下步骤：
[0031]
(1)冬虫夏草在90％甲醇溶液中回流提取2～3小时、离心、获得上清液，其中，所述冬虫夏草和90％甲醇的料液比为1:8～1:12，任选地，所述冬虫夏草和90％甲醇的料液比为
1:10；
[0032]
(2)将步骤(1)中上清液上样于ods固相萃取柱中，并依次用95％甲醇洗脱、100％甲醇洗脱，收集100％甲醇洗脱获得的洗脱液。
[0033]
另一方面，本发明提供一种由本发明所述方法制备的冬虫夏草提取物。
[0034]
另一方面，本发明提供本发明所述的冬虫夏草提取物或本发明所述方法制备的冬虫夏草提取物在用于预防或治疗免疫相关疾病中的用途。
[0035]
在一些实施方案中，所述免疫相关疾病为器官移植抗排斥反应或自身免疫疾病，其中所述自身免疫疾病为狼疮、多发性硬化、肌肉缩性侧索硬化、类风湿性关节炎、银屑病、因器官移植导致的并发症、异物移植、糖尿病、哮喘、特应性皮炎、自身免疫性甲状腺病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、阿尔茨海默病、白血病或淋巴瘤。
[0036]
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
[0037]
本专利首次在冬虫夏草中提取获得新的脑苷脂类提取物，并且该提取物具有优异的免疫抑制活性，其显示抑制con a诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的免疫抑制活性，其ic
50
值为4.6μg/ml。
[0038]
前面所述内容只概述了本发明的某些方面，但并不限于这些方面。这些方面及其他的方面的内容将在下面作更加具体完整的描述。
[0039]
本发明的详细说明书
[0040]
现在详细描述本发明的某些实施方案，其实例由随附的结构式和化学式说明。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本技术不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本技术为准。
[0041]
应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。
[0042]
除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。
[0043]
本发明所使用的术语“治疗”指治疗性和预防性治疗。例如，治疗性治疗包括由于施用一种或多种疗法(例如，一种或多种治疗剂(例如本发明的化合物和组合物))减轻或改善免疫介导的病状的进展、严重程度和/或持续时间，或改善免疫介导的病状的一种或多种症状(特别地，一种或多种可辨症状)。在特定实施方案中，治疗性治疗包括改善免疫介导的病状的至少一个可测量物理参数。在其它实施方案中，治疗性治疗包括通过(例如)稳定可辨症状在物理上或通过(例如)稳定物理参数在生理上或二者抑制免疫介导的病状的进展。在其它实施方案中，治疗性治疗包括减轻或稳定免疫介导的疾病严重程度。可在社区中使用本发明药物以治疗已经患免疫性疾病的人以减少症状的严重程度并减少他们生病的天数。
[0044]
本发明的组合物、制剂和给药
[0045]
本发明提供了一种药物组合物，其包括本发明所述的提取物。所述药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的辅剂、以及任选地、其它的治疗和/或预防成分。在一些实施方案，所述药物组合物包含有效量的至少一种药学上可接受的辅剂。
[0046]
像本发明所描述的，本发明所述的药物组合物或药学上可接受的组合物进一步包含药学上可接受的辅剂，像本发明所应用的，包括适合于特有的目标剂型的，任何溶剂、稀释剂、液体赋形剂、分散剂、悬浮剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、固体粘合剂或润滑剂，等等。remington:the science and practice of pharmacy,21st edition,2005,ed.d.b.troy,lippincott williams&wilkins,philadelphia,and encyclopedia of pharmaceutical technology,eds.j.swarbrick and j.c.boylan,1988-1999,marcel dekker,new york公开了配制药学上可接受的组合物中使用的各种载体及其公知制备方法。除了与本发明的化合物不相容的常规载体媒介，例如会产生不良生物效应或与药学上可接受的组合物中的任何其他组分发生有害的相互作用，其他任何常规的载体媒介及它们的用途也是本发明所考虑的范围。
[0047]
本发明的提取物或组合物可以通过任何合适方式给药，可根据受治感染的严重程度经口、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(如同通过粉剂、药膏或滴剂)、口腔作为口或喷鼻剂等向人或其它动物施用以上所述化合物和药学上可接受的组合物。
[0048]
可将用于本发明的方法的提取物配制成单位剂型。术语“单位剂型”指适合作为受治疗者的单位剂量的物理分立单位，每单位含有经计算产生预期疗效的预定量的提取物，任选地与适合的药物辅剂结合。单位剂型可作单次日剂量或多次日剂量(例如，每日约1-4次或更多次)的其中一次。当使用多次日剂量时，对于每次剂量的单位剂型可相同或不同。
[0049]
本发明提取物及其组合物的用途
[0050]
本发明提供的上述提取物和药物组合物作为免疫抑制剂可用于制备用于预防、治疗或减轻患者免疫相关疾病的药物，优选地，所述免疫相关疾病为器官移植抗排斥反应或自身免疫疾病，优选地，所述自身免疫疾病为狼疮、多发性硬化、肌肉缩性侧索硬化、类风湿性关节炎、银屑病、i型糖尿病、因器官移植导致的并发症、异物移植、糖尿病、哮喘、特应性皮炎、自身免疫性甲状腺病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、阿尔茨海默病、白血病或淋巴瘤。
[0051]
本发明提供一种用于治疗、预防或减轻患者免疫相关疾病的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的本发明所述的提取物或其药物组合物。并且，本发明提供的上述化合物或其药物组合物可以与其它疗法或治疗剂共同施用。施用方式可以为同时、顺序或以一定时间间隔进行。其中其它疗法或治疗剂选自化疗剂或抗增殖剂、抗炎药、免疫调节剂或免疫抑制剂、神经营养因子、用于治疗心血管疾病的活性剂、用于治疗糖尿病的活性剂和用于治疗自体免疫疾病的活性剂。
[0052]
实施治疗、预防或延缓等作用所需的提取物或药物组合物的剂量通常取决于施用的具体提取物或药物组合物、患者、具体疾病或病症及其严重程度、给药途径和频率等，并且需要由主治医师根据具体情况判定。例如，在通过经静脉途径施用本发明提供的提取物或药物组合物时，可以每周一次甚至以更长时间间隔进行施用。
[0053]
本发明的提取物及药物组合物除了对人类治疗有益以外，还可应用于兽医治疗宠物、引进品种的动物和农场的动物中的哺乳动物。另外一些动物的实例包括马、狗和猫。在此，本发明的化合物包括其药学上可接受的衍生物。
附图说明
[0054]
图1和图2为实施例1中冬虫夏草脑苷脂提取物色谱峰指认图谱，其中，图1为对照品脑苷脂a色谱图(色谱峰3)；图2为冬虫夏草脑苷脂提取物色谱图，峰1～7：7个脑苷脂成分。
[0055]
图3为实施例2中不同提取溶剂条件下冬虫夏草脑苷脂提取物色谱图，其中，a：90％甲醇提取溶剂下冬虫夏草脑苷脂提取物色谱图；b：95％乙醇提取溶剂下冬虫夏草脑苷脂提取物色谱图；峰1～7：7个脑苷脂成分。
[0056]
图4、图5、图6、图7为实施例2中不同洗脱液条件下冬虫夏草脑苷脂馏分洗脱液考察色谱图，图4、图5、图6、图7依次为：90％甲醇洗脱液、95％甲醇洗脱液、98％甲醇洗脱液、100％甲醇洗脱液洗脱条件下的冬虫夏草脑苷脂馏分色谱图；a～e依次为：第1～第5个柱体积洗脱液的色谱图；峰1～7：7个脑苷脂成分。
具体实施方式
[0057]
下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是，所描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0058]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围，且用于制备本发明的化合物的其它方法都被认为是在本发明的范围之内。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0059]
1.药材来源
[0060]
冬虫夏草来源于湖北省宜昌山城水都冬虫夏草有限公司。
[0061]
2.实验仪器
[0062]
eyela旋转蒸发仪n-1001(东京rikakikai公司)；dionex分析型和制备型高效液相色谱仪(美国thermo fisher scientific公司)；agilent zorbax eclipse plus c18分析柱(4.6
×
150mm，5μm)(美国phenomenex公司)；agilent extend c18(2.1mm
×
50mm，3.5μm)(美国phenomenex公司)；esi源低分辨质谱(美国bruker daltonics公司)；hera cell 150i细胞培养箱(美国thermo fisher scientific公司)；model 680多功能酶标仪(美国bio-rad laboratories公司)；电子天平(梅特勒托利多公司，型号：me204e)；恒温水浴锅(金坛市天宏实验仪器厂，型号：hh-s28)；高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司，型号：st40r)；milli-q advantage a10超纯水系统(默克密理博公司：)；jasco v-550紫外测定仪(日本jasco international公司)；jasco ft/ir-480plus红外测定仪(日本jasco international公司)；jasco p-1020旋光测定仪(日本jasco international公司)；bruker av-400/600mhz核磁共振仪(瑞士bruker biospin公司)；apci离子源低分辨质谱(美国bruker daltonics公司)；waters synapt g2 tof高分辨质谱仪(美国waters公司)；1260-6130型高效液相色谱-质谱联用仪，g1315dad检测器(美国安捷伦科技有限公司)。1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)。
[0063]
phenomenex gemini c
18
分析(4.6
×
250mm，5μm)、半制备(10.0
×
250mm，5μm)和制备(20.0
×
250mm，5μm)色谱柱(美国phenomenex公司)；phenomenex biphenyl分析(4.6
×
250mm，5μm)和半制备(10.0
×
250mm，5μm)色谱柱(美国phenomenex公司)；
[0064]
3.实验材料
[0065]
色谱级甲醇购自山东禹王实业有限公司；色谱级乙酸铵购自美国sigma-aldrich chemical公司；无水甲醇(分析纯，西陇科学股份有限公司)，甲醇(色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司)水为超纯水。ods-aq-hg反相硅胶填料购自ymc公司。氘代吡啶购自德国sigma-aldrich公司。硅胶购自青岛海洋化工有限公司。
[0066]
雄性babl/c小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司；96孔板购自康宁(上海)管理有限公司；con a、hank’s液、红细胞裂解液购自美国sigma-aldrich chemical公司；cell counting kit-8购自日本dojindo molecular technologies公司。
[0067]
以下缩写贯穿整个说明书：
[0068]
tr：保留时间
[0069]
pyr-d5：氘代吡啶
[0070]
δh：氢的化学位移
[0071]
δc：碳的化合物位移
[0072]
如无其他说明，本发明中色谱分析的检测波长均为205nm,色谱柱柱温均为30℃。
[0073]
实施例1：冬虫夏草脑苷脂提取物的制备及化学成分分析
[0074]
1.1冬虫夏草脑苷脂提取物的制备
[0075]
取冬虫夏草10g，放入250ml圆底烧瓶，加入90％甲醇100ml，回流提取3小时，离心(5000r/min)，将获得的上清液(约70-80ml)分批上样于ods柱(内径2.8cm*高3.0cm)(ods柱需提前使用纯甲醇活化，装柱之后使用90％甲醇平衡再上上清液，本次实验称取ods的质量约10g)，然后采用95％甲醇洗脱10bv(bv，柱体积，1bv约为10ml)，弃去，100％甲醇洗脱5bv，收集，挥干，即得冬虫夏草脑苷脂提取物3.4mg，得率0.38％。计算公式为：得率＝脑苷脂提取物质量/样品质量(干燥品)。
[0076]
1.2冬虫夏草脑苷脂提取物化学成分分析
[0077]
1.2.1供试品制备
[0078]
取上述脑苷脂提取物3.4mg，加入500μl甲醇复溶，离心，转速为10000rmp，取上清，备用。
[0079]
1.2.2对照品制备
[0080]
称取对照品脑苷脂a(实验室制备，保存于暨南大学)14.10mg(纯度为90.7％)加甲醇配置成浓度2.82mg/ml，待hplc-uv-esi/ms分析。
[0081]
1.2.3高效液相色谱分析
[0082]
色谱柱：agilent zorbax eclipse plus c18(4.6mm
×
150mm，5μm)；流动相：10mm乙酸铵水溶液(a)-甲醇(b)；流速为1ml/min；梯度洗脱：0～40min，93％b～95％b，后运行10min；柱温为30℃；检测波长205nm；进样量为10μl。
[0083]
质谱条件：电喷雾离子源，干燥气(氮气)流速9l/min；干燥气体温度350℃；雾化压力50psi；毛细管电压3500v；扫描方式：负离子模式，sim扫描模式；碰撞诱导解离电压70v；离子扫描范围：100-1000m/z。筛选离子的保留时间及相应质荷比参数：通道1：0min711，725，727，739，753。
[0084]
计算公式(外标一点法)：色谱峰占提取物相对含量(％)＝(样品峰面积/对照品峰
面积)*对照品浓度*对照品纯度*定容体积/脑苷脂提取物质量*100％。(定容体积为称取脑苷脂提取物质量加入甲醇定容的体积，脑苷脂提取物质量为配制供试品称取的质量)
[0085]
由上述分析检测方法得到的冬虫夏草7个脑苷脂成分占脑苷脂提取物的相对含量和质谱数据如表1所示。另外图1和图2中显示了冬虫夏草脑苷脂提取物各色谱峰的对应的各化合物情况，图2中峰1对应化合物1、峰2对应化合物2、峰3对应化合物3、峰4&5对应化合物4和5、峰6对应化合物6、峰7对应化合物7。
[0086]
表1冬虫夏草脑苷脂成分占脑苷脂提取物的相对含量
[0087]
成分保留时间(min)峰面积相对含量(％)质荷比(m/z)峰113.325168.60.43711峰213.83461.70.16711峰315.0067043.917.79725峰4&517.5725377.613.58727&739峰619.887152.30.38711峰722.093180.60.46753对照品14.92413202.2
‑‑ꢀꢀ
总含量32.7884-[0088]
1.2.4冬虫夏草脑苷脂提取物中单体化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7的分离鉴定
[0089]
将按照1.1方法制备获得的冬虫夏草脑苷脂提取物(1.4g)使用甲醇溶解后，用制备型高效液相色谱仪进行分析，采用中低压ods柱色谱(3.1
×
20.0cm)(日本ymc公司)进行分离，流动相用85％-100％(v/v)甲醇-水梯度洗脱3小时，同时用带有刻度的离心管接洗脱液，约30ml接一管，每15管合并成为一个馏分，共得到7个子馏分，分别为f7.1、f7.2、f7.3、f7.4、f7.5、f7.6、f7.7。通过高效液相分析发现子馏分7.1、7.2和7.3中不含有化合物。馏分f7.4(10.8mg)用半制备色谱柱phenomenex biphenyl(10.0
×
250mm，5μm)进行分离，以流动相85％甲醇-水(v/v)，流速3ml/min等度洗脱，获得化合物1(tr:43.8min,3.5mg)。馏分f7.5(93.8mg)用半制备色谱柱phenomenex gemini c18(10.0
×
250mm，5μm)进行分离，以流动相92％甲醇-水(v/v)，流速3ml/min等度洗脱，获得化合物2(tr:51.6min,4.1mg)。馏分f7.6(523.4mg)用制备色谱柱phenomenex gemini c18(20.0
×
250mm，5μm)进行分离，以流动相93％甲醇-水(v/v)，流速8ml/min等度洗脱，获得馏分f7.6.1(tr:50.0～55.0min)、f7.6.2(tr:60.0～65.0min)、f7.6.3(tr:66.0～70.0min)和f7.6.4(tr:74.0～78.0min)。。馏分f7.6.1(356.5mg)用半制备色谱柱phenomenex gemini c18(10.0
×
250mm，5μm)进行分离，以流动相93％甲醇-水(v/v)，流速3ml/min等度洗脱，获得化合物3(tr:50.9min,319.9mg)。馏分f7.6.2(20.7mg)用半制备色谱柱phenomenex biphenyl(10.0
×
250mm，5μm)进行分离，以流动相87％甲醇-水(v/v)，流速3ml/min等度洗脱，获得化合物4(tr:31.6min,9.3mg)和化合物5(tr:29.3min,8.7mg)。馏分f7.6.3(8.8mg)用半制备色谱柱phenomenex biphenyl(10.0
×
250mm，5μm)进行分离，以流动相87％甲醇-水(v/v)，流速3ml/min等度洗脱，获得化合物6(tr:29.2min,2.5mg)。馏分f7.6.4(15.6mg)用半制备色谱柱phenomenex gemini c18(10.0
×
250mm，5μm)进行分离，以流动相93％甲醇-水(v/v)，流速3ml/min等度洗脱，获得化合物7(tr:71.1min,12.9mg)。
[0090]
其中化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7的结构及鉴定数据如下所示：
[0091]
化合物1：
[0092][0093]
化合物1：白色粉末；uv(meoh)λ
max
(logε)203(4.09)nm；ir(kbr)v
max 3332,2915,1659,1539,1466,1073cm-1
；apci-ms/ms(positive)m/z 712,694,532,294,276；hresims(positive)m/z 712.5357[m+h]
+
(calcd.for c
40h74
no9,712.5358)；1h和
13
c nmr见表2。
[0094]
化合物2：
[0095][0096]
化合物2：白色粉末；uv(meoh)λ
max
(logε)202(4.02)nm；ir(kbr)v
max 3218,2921,1639,1539,1466,1078cm-1
；apci-ms/ms(positive)m/z 712,694,532,280,262；hresims(positive)m/z 712.5354[m+h]
+
(calcd.for c
40h74
no9,712.5358)；1h和
13
c nmr见表2。
[0097]
化合物3：
[0098][0099]
化合物3：白色粉末；apci-ms/ms(positive)m/z 726,708,546,294,276；hresims(positive)m/z 726.5505[m+h]
+
(calcd.for c
41h76
no9,726.5515)；1h和
13
c nmr见表3。
[0100]
化合物4：
[0101][0102]
化合物4：白色粉末；uv(meoh)λ
max
(logε)202(4.22)nm；ir(kbr)v
max 3283,2921,1639,1531,1466,1081,1029,968 cm-1
；apci-ms/ms(positive)m/z740,722,560,294,276；hresims(positive)m/z 740.5668[m+h]
+
(calcd.for c
42h78
no9,740.5671)，确定化合物4的分子式为c
42h77
no9；1h和
13
c nmr见表3。
[0103]
化合物5：
[0104][0105]
化合物5：白色粉末；apci-ms/ms(positive)m/z 728,710,548,294,276；hresims(positive)m/z 728.5668[m+h]
+
(calcd.for c
41h78
no9,728.5671)；1h和
13
c nmr见表3。化合物6：
[0106][0107]
化合物6：白色粉末；uv(meoh)λ
max
(logε)202(3.36)nm；ir(kbr)v
max 3172,2918,1720,1542,1466,1079 cm-1
；apci-ms/ms(positive)m/z 712,694,532,294,276；hresims(positive)m/z 712.5721[m+h]
+
(calcd.for c
41h78
no8,712.5722)；1h和
13
cnmr见表4。
[0108]
化合物7：
[0109][0110]
化合物7：白色粉末；apci-ms/ms(positive)m/z 754,736,574,294,276；hresims
(positive)m/z 754.5830[m+h]
+
(calcd.for c
43h80
no9,754.5828)；1h和
13
c nmr见表4。
[0111]
表2化合物1和化合物2核磁数据归属(600 mhz,in pyr-d5)
[0112]
[0113][0114]
*
信号归属在同一列内可能互换。
[0115]
表3化合物3、4和5核磁数据归属
[0116]
[0117][0118]
*
信号归属在同一列内可能互换；mhz,in pyr-d5；mhz,in pyr-d5。
[0119]
表4化合物6和7核磁数据归属
[0120]
[0121][0122]
*
信号归属在同一列内可能互换；mhz,in pyr-d5；mhz,in pyr-d5。
[0123]
实施例2：不同条件下的冬虫夏草脑苷脂提取物的制备
[0124]
2.1不同提取溶剂
[0125]
样本制备方法与“1.1”相同，其中的提取溶剂分别为95％乙醇与90％甲醇，得到的提取液离心后上ods柱，然后直接用100％甲醇洗脱。然后按照“1.2.3”项下的色谱条件进行检测，以色谱峰3的峰面积作为评价指标，来比较两个提取溶剂的效果。结果发现90％甲醇提取液获得的色谱峰3的峰面积为2661.7，95％乙醇提取液获得的色谱峰3的峰面积为1008.4，因此90％甲醇提取效果较好，结果如图3所示。
[0126]
2.2不同洗脱液
[0127]
比较90％甲醇、95％甲醇、98％甲醇、100％甲醇洗脱液对脑苷脂成分的洗脱效果。按照“1.1”项下方法制备冬虫夏草提取液，离心后将上清液装置于ods柱之后分别使用90％甲醇、95％甲醇、98％甲醇、100％甲醇洗脱液对上清液进行洗脱。按照“1.2.3”项下的色谱条件进行检测，结果如图4、图5、图6、图7所示，90％甲醇、95％甲醇不能将目标成分洗脱下来；98％甲醇能将目标成分洗脱下来但100％甲醇中仍有目标部分(使用98％甲醇洗脱不能将目标化合物完全洗脱下来)。因此洗脱液条件优化为以95％甲醇洗脱除杂，98％-100％甲醇洗脱并富集目标化合物。
[0128]
2.3不同料液比
[0129]
取冬虫夏草粉末1g三份，精密称定，置于50ml锥形瓶中，以料液比1:6、1:10、1:12分别加入90％甲醇6ml、10ml、12ml，回流提取3h。离心(5000rpm，10min)，取上清液。将上清液上样于平衡好的ods小柱，用95％甲醇洗脱10bv，弃去，100％甲醇洗脱5bv，用恒重的蒸发皿接样，然后放置水浴锅上蒸干，之后于105℃干燥3h，置干燥器中冷却30min，迅速精密称定脑苷脂提取物的重量。以干燥品计算得率，计算公式为：得率＝脑苷脂提取物质量/样品质量(干燥品)。(样品含水量计算方法：取样品2g用快速水分测定仪测定，水分含量为11.8％。)
[0130]
结果如表5所示。料液比1:6、1:10、1:12提取所得冬虫夏草脑苷脂提取物得率分别为0.18％、0.38％、0.50％，可见料液比在1:8-1:12之间是比较适合的。
[0131]
表5不同料液比冬虫夏草脑苷脂提取物得率
[0132][0133][0134]
实施例3：冬虫夏草脑苷脂提取物的免疫抑制活性
[0135]
3.1溶液配制
[0136]
培养基：89％培养基+10％胎牛血清+1％双抗，2～8℃保存。
[0137]
pbs：取1包pbs用1l纯水完全溶解，分装，高温灭菌。
[0138]
10％cck-8：取1ml cck8加入9ml培养基配，制成10％cck-8检测液，现配现用。
[0139]
刀豆蛋白a(cona)：准确称取5mg刀豆蛋白a，加入1ml无菌的pbs充分溶解后，配置成5mg/ml的母液，分装成50μl每管，-20℃冻存。使用时，解冻后用完全培养基配置成浓度为
150μg/ml的工作液。
[0140]
3.2实验方法
[0141]
3.2.1细胞获取：babl/c雄性小鼠摘眼球放血后，处死小鼠，在75％酒精中浸泡10min，超净工作台内无菌取脾，放入盛有pbs的培养皿内。用注射器吸取pbs冲洗脾脏表面和内部至脾脏发白，用镊子轻轻撕碎，用5ml注射器针芯在钢网上轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液，经200目筛网过滤后，滤液离心10min(1000rpm/min)；离心后，弃上清液，细胞沉淀用pbs液重悬后，再次离心10min(1000rpm/min)，重复操作一次；细胞沉淀中加入2ml红细胞裂解液，混匀静置5min后，加入8ml pbs混匀，然后1000rpm/min离心5分钟。离心后，弃上清液，细胞沉淀用pbs液重悬后，再次离心10min(1000rpm/min)，重复操作一次；离心后，弃上清液，将细胞沉淀悬浮于1ml的rpmi-1640完全培养基(含10％的胎牛血清和1％的双抗)中，加入2-3ml培养基稀释，用细胞计数仪进行细胞计数(new cell type)，用完全培养基调整细胞浓度为2*106个/ml。
[0142]
3.2.2样品配置：取适量实施例1的冬虫夏草脑苷脂提取物溶于dmso，配制25.6mg/ml母液，然后用培养基稀释，得到浓度为128μg/ml的溶液，再用培养基梯度稀释，得到浓度分别为64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml的样品稀释液。
[0143]
3.2.3细胞活力检测：向96孔板中加入制备好的细胞悬液，接种细胞密度为2*105个/孔，加入细胞体积为100μl。按100μl/孔加入样品，每个浓度5个复孔，然后再置于37℃、5％co2培养箱中孵育60h后，用无血清培养基加上10％cck-8，置于37℃培养箱中孵育4～5小时，酶标仪450nm处检测各孔的吸光度(a)值。设置1个对照组：细胞+1640培养基。结果显示与对照组比较，样品在各浓度下(64、32、16、8、4、2μg/ml)均显示对脾淋巴细胞无细胞毒作用。
[0144]
3.2.4细胞增殖抑制检测：向96孔板中加入制备好的细胞悬液，接种细胞密度为2*105个/孔，加入细胞体积为100μl。按100μl/孔加入样品，每个浓度5个复孔，然后再置于37℃、5％co2培养箱中孵育12h后，小心吸出10μl上清，向对应组别加入10μl浓度为150μg/ml的cona(终浓度为7.5μg/ml)，然后再置于37℃、5％co2培养箱中孵育48h，最后用无血清培养基加上10％cck-8，置于37℃培养箱中孵育4～5小时，酶标仪450nm处检测各孔的吸光度(a)值。设置1个阴性对照组和1个模型对照组，分别为：细胞+1640培养基、细胞+cona+1640培养基。。
[0145]
3.2.5数据处理：按以下公式计算样品对脾淋巴细胞的增殖率(活力)：
[0146]
增殖率％＝[as/ac]
×
100％
[0147]
as：样品组吸光度(脾淋巴细胞+待测样品+cck-8)
[0148]
ac：对照组吸光度(脾淋巴细胞+cck-8)
[0149]
按以下公式计算样品对脾淋巴细胞的增殖抑制率：
[0150]
增殖抑制率％＝[(am-as)/(am-ac)]
×
100％
[0151]
am：模型组对照吸光度(脾淋巴细胞+cona+cck-8)
[0152]
as：样品组吸光度(脾淋巴细胞+待测样品+cona+cck-8)
[0153]
ac：阴性对照组吸光度(脾淋巴细胞+cck-8)
[0154]
3.3实验结果
[0155]
实验结果如下面表6所示：
[0156]
表6冬虫夏草脑苷脂提取物对con a诱导的脾淋巴细胞的增殖抑制率(％)
[0157][0158]
***：与模型组比p《0.001；**：与模型组比p《0.01；*：与模型组比p《0.05
[0159]
由表6可知，冬虫夏草脑苷脂提取物显示抑制con a诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的免疫抑制活性，其ic
50
值为4.6μg/ml。
[0160]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、、“一些实施方案”、“另一些实施方案”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0161]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围内。