本发明属于基因分型技术领域,尤其是涉及一种人血小板同种抗原系统等位基因分型的实时荧光pcr方法、探针、引物及试剂盒。
背景技术:
人血小板表面存在血型抗原,在同种免疫和血小板免疫反应中起重要作用。血小板上除ab、h、lewis、i、p等糖分子类红细胞血型抗原和hla-i类白细胞抗原外,人血小板膜上还存在血小板特异性的同种抗原系统(humanplateletalloantigen,hpa)。个体间hpa呈现一定的多态性,可通过输血、妊娠或者造血干细胞移植等途径免疫刺激产生同种血小板抗体,是造成同种免疫性血小板减少症的原因之一。因此,研究血小板同种抗原系统,提供有关的检测方法,有助于明确个体血小板抗原系统的基因型,避免产生相应的抗体。
研究显示hpa基因定位于血小板膜糖蛋白和cd109上,现明确命名的hpa系统已达到35个,开展hpa基因分型将有助于明确个体hpa抗原表达情况。目前hpa基因分型主要的方法是多聚酶链反应-序列特异性引物(pcr-sequencespecificprimer,pcr-ssp)、基于pcr测序的分型技术(pcr-sequencebasedtyping,pcr-sbt)和实时荧光pcr技术。pcr-ssp方法快速简便,但是该方法需要两对引物才能有效区分一个抗原系统,导致检测hpa多个系统时需要扩增的孔位较多,而且对于一些新的特殊的突变位点难以明确。pcr-sbt分型方法能准确对hpa进行分型,是金标准方法,但需对模板dna进行扩增、酶切和测序,耗时较长,而且成本高。实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr,qt-pcr)能够准确对hpa系统进行分型,且具有耗时短的优点,但目前的方法大多是基于pcr-ssp技术的改进,它采用ssp引物扩增后增加荧光的检测,一个hpa系统仍需要扩增两孔,而且每孔存在扩增失败导致假阴性的风险。
hpa分布存在人群的差异性,不同民族和地域分布不同。前期研究显示hpa-6w和hpa-21w在中国人群中存在多态性,国际上研究显示hpa-21w系统多态性主要存在于东亚人群,它也是我们实验室前期研究报道的一个多态性位点。目前有关hpa-6w和hpa-21w等位基因检测的实时荧光定量pcr方法甚少,因此本发明针对这一问题建立了一种人血小板同种抗原系统hpa-6w和hpa-21w等位基因分型的实时荧光pcr方法,将有助于hpa-6w和hpa-21w的分型工作。
技术实现要素:
本发明首先要解决的问题是提供一种人血小板同种抗原系统hpa-6w和hpa-21w等位基因分型的实时荧光pcr方法,以提供hpa-6w和hpa-21w等位基因的快速分型方法。
为此,针对本发明的上述目的通过以下技术方案来实现:
一种人血小板同种抗原系统等位基因分型的实时荧光pcr方法,其特征在于:所述人血小板同种抗原系统等位基因分型的实时荧光pcr方法对hpa-6w和hpa-21w抗原系统的a和b等位基因在同一扩增反应体系以及扩增反应程序下进行分型指定,具体包括如下步骤:
(1)制备人基因组dna,作为pcr扩增的模板;
(2)合成扩增引物、特异性荧光探针并配制pcr扩增反应体系;
(3)用实时荧光pcr装置在同一扩增反应体系以及扩增反应程序下获取荧光信号;
(4)分析步骤(3)获得的荧光信号结果,依据荧光信号强弱确定其基因型。
在采用上述技术方案的同时,本发明还可以采用或者组合采用如下技术方案:
作为本发明的优选技术方案:所述步骤(2)中的扩增引物为:
(1)hpa-6w抗原系统基因序列的扩增引物
hpa-6f:5’tgtgagtgctcagaggagga3’
hpa-6r:5’gtggcagacacattgaccac3’
(2)hpa-21w抗原系统基因序列的扩增引物
hpa-21f:5’ggagatcagagctggactgg3’
hpa-21r:5’tagaacctgggtgtgtgcaa3’
所述步骤(2)中的特异性荧光探针为:
(1)hpa-6w抗原系统的荧光探针
hpa-6ap:5’fam-cagcccccgrgagggtc-3’mgb,用于检测hpa-6a等位基因;
hpa-6bp:5’hex-cagcccccargagggtca-3’mgb,用于检测hpa-6b等位基因;
(2)hpa-21w抗原系统的荧光探针
hpa-21ap:5’fam-acatgacgaaaatacctg-3’mgb,用于检测hpa-21a等位基因;
hpa-21bp:5’hex-ctacatgacaaaaata-3’mgb,用于检测hpa-21b等位基因。
作为本发明的优选技术方案:所述步骤(3)中的实时荧光pcr扩增反应体系包括:
sgexcelgoldstartaqmanmixture7.5μl;每个引物浓度50μmol/l,引物用量0.06μl;每个探针浓度50μmol/l,探针用量0.06μl;50-100ng/μl的基因组dna1.5μl;余量以h2o补足至15μl。
作为本发明的优选技术方案:所述步骤(3)中的实时荧光pcr扩增反应程序为:
95℃预变性3min;95℃20s,60℃30s,50个循环;每个循环读取荧光信号。
本发明第二个目的在于,针对现有技术中存在的不足,提供人血小板同种抗原系统等位基因分型的实时荧光pcr方法用扩增引物组合物。
为此,针对本发明的上述目的通过以下技术方案来实现:
人血小板同种抗原系统等位基因分型的实时荧光pcr方法用扩增引物组合物,其特征在于:所述扩增引物组合物包括:
(1)hpa-6w抗原系统基因序列的扩增引物
hpa-6f:5’tgtgagtgctcagaggagga3’
hpa-6r:5’gtggcagacacattgaccac3’
(2)hpa-21w抗原系统基因序列的扩增引物
hpa-21f:5’ggagatcagagctggactgg3’
hpa-21r:5’tagaacctgggtgtgtgcaa3’。
本发明第三个目的在于,针对现有技术中存在的不足,提供人血小板同种抗原系统等位基因分型的实时荧光pcr方法用荧光探针组合物。
为此,针对本发明的上述目的通过以下技术方案来实现:
人血小板同种抗原系统等位基因分型的实时荧光pcr方法用荧光探针组合物,其特征在于:所述荧光探针组合物包括:
(1)hpa-6w抗原系统的荧光探针
hpa-6ap:5’fam-cagcccccgrgagggtc-3’mgb
hpa-6bp:5’hex-cagcccccargagggtca-3’mgb
(2)hpa-21w抗原系统的荧光探针
hpa-21ap:5’fam-acatgacgaaaatacctg-3’mgb
hpa-21bp:5’hex-ctacatgacaaaaata-3’mgb。
本发明还有一个目的在于,提供人血小板同种抗原系统等位基因分型的实时荧光pcr方法用试剂盒。
为此,针对本发明的上述目的通过以下技术方案来实现:
人血小板同种抗原系统等位基因分型的实时荧光pcr方法用试剂盒,其特征在于:所述人血小板同种抗原系统等位基因分型的实时荧光pcr方法用试剂盒包含前文所述的人血小板同种抗原系统等位基因分型的实时荧光pcr方法用扩增引物组合物和前文所述的人血小板同种抗原系统等位基因分型的实时荧光pcr方法用荧光探针组合物。
本发明所设计的寡核苷酸引物和探针是根据genbank中人类的hpa抗原基因序列包括其遗传多态性位点在内的连续寡核苷酸序列进行设计获得的。hpa-6w、hpa-21bw抗原系统的itgb3基因序列的扩增引物和探针根据genbank中编号为nc_000017.10(45331208-45390077)的序列进行设计。
本发明以2对寡核苷酸引物分别扩增hpa-6w和hpa-21w系统的2个基因片段。其中hpa-6w和hpa-21w抗原系统的引物分别扩增genbank编号为nc_000017.10(45331208-45390077)序列中45378565-45378681位和45386600-45386818位,可保证2个抗原系统基因的有效扩增。扩增引物的设计参照dbsnp数据库避开了hpa抗原编码序列的多态性位点,避免了任何突变点的漏检。
本发明针对hpa-6w和hpa-21w系统的a和b等位基因,设计4个特异性荧光探针(分别为hpa-6ap、hpa-6bp、hpa-21ap、hpa-21bp,且分别用于检测hpa-6a等位基因、hpa-6b等位基因、hpa-21a等位基因以及hpa-21b等位基因),序列位置分别为45378612-45378628、45378612-45378629、45386715-45386732、45386713-45386728,在探针5’标记有荧光报告基团(fam或者hex),在3’标记有淬灭基团mgb。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;在pcr扩增过程中当特定等位基因探针能与目标序列互补时,则taq酶利用5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,个体序列上存在该等位基因;当特定等位基因探针不能与序列互补时,则探针上报告荧光基团和淬灭荧光基团未分离,荧光监测系统不能检测到对应的荧光信号,个体序列上不存在该等位基因,从而实现等位基因的鉴定。
本发明所提供的方法通过自行设计引物、探针和优化扩增检测条件,实现了在同一扩增反应体系以及扩增反应程序下检测hpa-6w和hpa-21w等位基因,而且针对a和b等位基因采用不同的探针,有效解决了既往基于pcr-ssp实时荧光的不足。同时本发明所提供的方法中单个孔内可实现一个系统的a和b等位基因的鉴定,较既往基于pcr-ssp的实时荧光减少了所需孔位,而且本发明所提供的方法中基于目标序列扩增后检测,在反应体系中至少有一个探针呈现阳性,可避免基于pcr-ssp的实时荧光扩增引起的检测假阴性或者假阳性;同时本发明所提供的方法首次针对中国人群hpa-21分布特点,建立了hpa-21w等位基因的实时荧光方法。
本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法,解决了hpa-6w和hpa-21w抗原系统等位基因快速准确定型的问题,发挥实时荧光pcr对hpa基因等位基因定型操作高通量、结果准确和快速的特点,在输血医学研究和遗传学等领域的相关应用将受到高度重视,对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的意义。
附图说明
图1为hpa-6w的实时荧光pcr结果图,标本为hpa-6waa基因型。
图2为hpa-6w的实时荧光pcr结果图,标本为hpa-6wab基因型。
图3为hpa-21w的实时荧光pcr结果图,标本为hpa-21waa基因型。
图4为hpa-21w的实时荧光pcr结果图,标本为hpa-21wab基因型。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的内容作进一步详细说明。
本实施具体以献血者的血液为检测样本进行hpa-6w和hpa-21bw系统抗原等位基因的分型为例,对本发明内容做详细说明。
本发明的基因分型的实时荧光pcr方法包括以下步骤:
1、制备人基因组dna,作为后续步骤的pcr扩增模板。
取待检全血200μl,按照magdnapurelcdnaisolationkit试剂盒说明书提取基因组dna,并利用分光光度计测定基因组dna的浓度和纯度。
2、合成2对扩增引物和4条特异性荧光探针,具体引物序列和探针序列见发明内容和序列表中的基因序列,此处不再赘述,将扩增引物和荧光探针用纯水稀释至50μmol/l。
准备sgexcelgoldstartaqmanmixture(withrox,上海生工生物技术股份有限公司)、rnase-freeh2o,与步骤1所制备的pcr扩增模板,按下表1配制pcr反应体系。
表1
上述pcr反应体系混匀后,在美国abi公司的quantstudiodx荧光pcr仪上按以下程序进行扩增:
每个循环后读板1次。
3、所读取的荧光信号结果用美国abi公司的quantstudiotestdevelopmentsoftware进行分析,确定hpa-6w和hpa-21bw抗原系统的基因型。
图1为hpa-6w的实时荧光pcr结果图,标本为hpa-6waa基因型。图1中fam荧光探针呈现阳性,而hex探针呈现阴性。
图2为hpa-6w的实时荧光pcr结果图,标本为hpa-6wab基因型。图2中fam荧光探针呈现阳性,而hex探针呈现阳性。相比图1而言,fam荧光探针荧光值下降,而hex探针荧光值增加。
图3为hpa-21w的实时荧光pcr结果图,标本为hpa-21waa基因型。图3中fam荧光探针呈现阳性,而hex探针呈现阴性。
图4为hpa-21w的实时荧光pcr结果图,标本为hpa-21wab基因型。图4中fam荧光探针呈现阳性,而hex探针呈现阳性。相比图1而言,fam荧光探针荧光值下降,而hex探针荧光值增加。
上述具体实施方式用来解释说明本发明,仅为本发明的优选实施例,而不是对本发明进行限制,在本发明的精神和权利要求的保护范围内,对本发明做出的任何修改、等同替换、改进等,都落入本发明的保护范围。
序列表
<110>浙江省血液中心
<120>一种人血小板同种抗原系统等位基因分型的实时荧光pcr方法、探针、引物及试剂盒
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tgtgagtgctcagaggagga20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gtggcagacacattgaccac20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
ggagatcagagctggactgg20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
tagaacctgggtgtgtgcaa20
<210>5
<211>17
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
cagcccccgrgagggtc17
<210>6
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
cagcccccargagggtca18
<210>7
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
acatgacgaaaatacctg18
<210>8
<211>16
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
ctacatgacaaaaata16