一种多肽及其用途的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种多肽及其用途。

背景技术：

目前，癌细胞已经发展出一些逃避宿主免疫监视的机制，包括：1、通过高表达膜蛋白pd-l1和pd-l2来逃避t淋巴细胞的免疫监视，其中膜蛋白pd-l1和pd-l2均与t细胞表面的pd-1结合，引发t细胞凋亡；2、逃避自然杀伤(nk)细胞的免疫监视，nk细胞表面上的nkg2d蛋白，在与癌细胞表面上的mica/micb蛋白结合时，可以激活nk细胞来杀死癌细胞，然而，癌细胞已经发展出促进mica/micb从癌细胞上脱离的机制，脱离的mica/micb与nkg2d结合，阻断其对nk细胞的激活；3、逃避巨噬细胞的免疫监视，几乎所有癌细胞在其表面上表达高水平的cd47。但现仅有pd-l1或者pd-1单抗上市治疗癌症，无法同时激活t细胞和巨噬细胞，发挥机体免疫作用实现双重杀伤。

技术实现要素：

根据第一方面，在一些实施例中，提供一种多肽，其包含信号调控蛋白α(sirp-α)d1变体，或其片段，所述信号调控蛋白αd1变体相对于野生型信号调控蛋白αd1结构域具有氨基酸突变。

根据第二方面，在一些实施例中，提供一种多肽，包含：

(a)信号调控蛋白αd1变体，所述信号调控蛋白αd1变体如第一方面所定义；

(b)fc变体，所述fc变体包含具有两个fc结构域单体的fc结构域二聚体，其中每个fc结构域单体独立地为包含人igg1、igg2或igg4fc区的突变体。

根据第三方面，在一些实施例中，提供一种多肽，其包含：fc变体，其中所述fc变体包含具有两个fc结构域单体的fc结构域二聚体，其中每个fc结构域单体独立地属于igg类，并且包括a)p329处突变，以及b)如下位置突变中的至少一种：e233、l234、l235、g236、g237、d265、d270、n297、e318、k320、k322、a327、a330、p331。

根据第四方面，在一些实施例中，提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码第一方面所述多肽，或第二方面，或第三方面所述多肽。

根据第五方面，在一些实施例中，提供一种构建体，所述构建体含有第四方面所述多核苷酸。

根据第六方面，在一些实施例中，提供一种表达系统，所述表达系统含有如第五方面所述构建体或基因组中整合有外源的如第四方面所述多核苷酸。

根据第七方面，在一些实施例中，提供一种组合物，其包含第一方面所述多肽，或第二方面所述多肽，或第三方面所述多肽，或第四方面所述多核苷酸，以及药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂中的至少一种。

根据第八方面，在一些实施例中，提供一种试剂盒，其包括第七方面所述组合物，还包括容纳第七方面所述组合物的容器。

根据第九方面，在一些实施例中，提供第一方面所述多肽，或第二方面所述多肽，或第三方面所述多肽，或第四方面所述多核苷酸，或第五方面所述构建体，或第六方面所述表达系统，或第七方面所述组合物在制备治疗由cd47和/或pd-l1过表达引起的疾病的药物中的用途。

依据上述实施例的一种多肽及其用途，本发明提供的信号调控蛋白αd1变体具有优异的cd47结合力，可用于治疗由cd47过表达引起的疾病。

附图说明

图1为一种实施例的抗体结构示意图；

图2为一种实施例的蛋白检测结果图；

图3为一种实施例的cd47结合能力facs分析图；

图4为一种实施例的pd-l1结合能力facs分析图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。

术语“约”或“大致”意指如由本领域普通技术人员所确定在特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。举例来说，根据本领域的惯例，“约”可指在1个或多于1个标准偏差以内。或者，“约”可指给定值的高达20％、高达10％、高达5％或高达1％的范围。或者，特别是就生物系统或方法来说，该术语可指在值的一个数量级以内，优选在5倍以内，并且更优选在2倍以内。在申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假设术语“约”意指在特定值的可接受误差范围内。

本文中所用的术语仅用于描述特定情况的目的，而不旨在为限制性的。除非上下文明确地指出，否则如本文中所用，单数形式“一个”、“一种”以及“所述”意在同样包括复数形式。此外，就在详细描述或权利要求书中使用术语“包括”、“具有”、“带有”或其变化型式而言，此类术语旨在以类似方式包括术语“包含”。

如本文所用，术语“抗体”是指完整抗体；抗体片段，前提条件是它们展现所需的生物活性(例如表位结合)；单克隆抗体；多克隆抗体；单特异性抗体；多特异性抗体(例如双特异性抗体)；以及抗体样蛋白质。

如本文所用，术语“抗体可变结构域”是指抗体的轻链和重链中包括互补决定区(cdr，例如cdrl1、cdrl2、cdrl3、cdrh1、cdrh2以及cdrh3)和构架区(fr)的氨基酸序列的部分。

如本文所用，术语“接头”是指两个元件(例如蛋白质结构域)之间的键联。在一些实施方案中，接头可为共价键或间隔区。术语“间隔区”是指存在于两个多肽或多肽结构域之间以在两个多肽或多肽结构域之间提供空间或柔性(或空间与柔性)的部分(例如聚乙二醇(peg)聚合物)或氨基酸序列(例如1-200个氨基酸的序列)。在一些实施方案中，氨基酸间隔区为多肽的一级序列的一部分(例如经由多肽骨架连接至间隔的多肽或多肽结构域)。

sirp和cd47的定义如下：

信号调节蛋白(sirp)是跨膜糖蛋白，包括三个家族成员，sirpα(cd172a)、sirpβ(cd172b)和sirpγ(cd172g)。这三种蛋白均包含相似的胞外区域，但是具有不同的胞内结构域。胞外区域包含三个免疫球蛋白样结构域，一个ig-v和两个ig-c结构域。sirpα(cd172a)的胞内结构域包含两个抑制性信号转导区域，其可以抑制信号转导以及相应的细胞功能。sirpβ(cd172b)和sirpγ(cd172g)的胞内区域非常短，不含信号转导结构域。但是，sirpβ(cd172b)能够经由衔接蛋白例如dap12而起到信号转导的功能。sirp主要表达在巨噬细胞树突状细胞(dc)和神经元中。

cd47是属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，在包括红细胞在内的所有细胞类型的表面上表达。cd47的配体包括整联蛋白、血小板反应蛋白-1和sirp。cd47通过与sirpα相互作用发出“不要吃我”的信号，可以抑制巨噬细胞的吞噬作用，并从而保护例如血细胞等的细胞免受巨噬细胞的攻击。

既往研究表明，很多过表达cd47的肿瘤或癌细胞，通过与巨噬细胞的细胞表面上的sirpα结合，防止巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用。过表达cd47的癌细胞包括急性髓细胞样白血病(aml)、慢性髓细胞样白血病(cml)、急性淋巴细胞白血病(all)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、多发性骨髓瘤(mm)、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌和胰腺癌细胞。有报道称，向荷肿瘤的小鼠注射阻碍cd47与sirpα结合的cd47特异性抗体，可以显著地抑制肿瘤生长。当将同一抗体注射到携带人白血病细胞的小鼠中，肿瘤细胞或癌细胞完全消除(theocharidesapa,etal.,2012)。

本文中，pd-l1是指程序性死亡-配体1(programmedcelldeath1ligand1)，也称为表面抗原分化簇274(clusterofdifferentiation274，cd274)或b7同源体(b7homolog1，b7-h1)，是人类体内的一种蛋白质，由cd274基因编码。pd-l1是大小为40kda的第一型跨膜蛋白，据信其在某些特殊情形(例如怀孕、组织移植、自体免疫疾病，以及诸如肝炎等某些疾病)下，与免疫系统的抑制有关。正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促发具抗原特异性的细胞毒杀性t细胞(cd8+tcell增生)。而细胞程序性死亡受体-1(pd-1)与细胞程序性死亡-配体1(pd-l1)结合，可以传导抑制性的信号，减低淋巴结cd8+t细胞的增生，而且pd-1还可以借由调节bcl-2基因，控制淋巴结中抗原特异性t细胞的聚积。

本文中，pd-l2，即程序性死亡-配体2或pdcdl2或b7-dg，为pd-1的一个配体，是b7家族配体的成员，可以抑制t细胞增殖和细胞因子产生，参与外周自身免疫耐受形成。

本文中，pd-1是指程序性死亡受体1，也称为cd279，或分化簇279。pd-1是长约268个氨基酸的细胞表面受体。当与pd-l1或pd-l2结合时，pd-1可以通过抑制t细胞炎性反应，下调免疫系统，并提高自身耐受性。pd-1对于免疫系统的抑制性作用可防止自身免疫疾病，但也同时阻止免疫系统杀灭癌细胞。

fc和fcr

可结晶区段(fc区)是抗体的尾部区，是决定抗体的效应子功能(即，抗体如何与特定细胞受体或其他防御蛋白建立关系)的结构域。

fc受体(fcr)是在某些细胞，包括b淋巴细胞、滤泡树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞和肥大细胞等的表面上的蛋白。这些细胞有助于免疫系统的保护功能。

fc区可以与fc受体以及补体系统的一些蛋白相互作用，激活免疫系统。

本文中，具有至少80％同一性的氨基酸序列包括但不限于至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性等等。

关于治疗性双特异性或多特异性融合蛋白/抗体，由于靶向单一肿瘤相关抗原的抗体疗效有限。例如，已获批准的pd-l1抗体，avelumab(bavencio)，总的缓解率仅为33％。因此，有必要设计开发治疗性双特异性或多特异性融合蛋白/抗体，以提高疗效。

现有的治疗性双特异性或多特异性融合蛋白/抗体出在诸多缺陷，包括如高聚集度、大分子量(>200kda)和较短的半衰期(<12小时，bite、dart和tandab)，从而降低了其疗效。

根据第一方面，在一些实施例中，提供一种多肽，其包含信号调控蛋白α(sirp-α)d1变体，或其片段，所述信号调控蛋白αd1变体相对于野生型信号调控蛋白αd1结构域具有氨基酸突变。

在一些实施例中，所述信号调控蛋白αd1变体相对于野生型信号调控蛋白αd1结构域在残基70处具有氨基酸突变，以及相对于野生型信号调控蛋白αd1结构域还具有如下氨基酸突变中的至少一种：残基6、残基27、残基31、残基47、残基53、残基54、残基56、残基66、残基92。

在一些实施例中，所述野生型信号调控蛋白αd1结构域具有seqidno：14所示氨基酸序列。

在一些实施例中，所述信号调控蛋白αd1变体的n端、c端中的至少一端还键联有如下氨基酸序列中的至少一种：

1)ascawsgvag；

2)pvvsgpaaratpqh；

或者，所述信号调控蛋白αd1变体的n端、c端中的至少一端键联有与前述两种氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种。

在一些实施例中，所述多肽还包含键联至所述信号调控蛋白αd1变体n端的如下氨基酸序列：ascawsgvag，或与该氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述多肽还包含键联至所述信号调控蛋白αd1变体c端的如下氨基酸序列：pvvsgpaaratpqh，或与该氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述多肽包含以下氨基酸序列中的至少一种：

eeelqx1iqpdksvlvaagetatlrctx2tslx3pvgpiqwfrgagpgrx4liynqx5x6gx7fprvttvsdx8tkrx9nmdfsirignitpadagtyycx10kfrkgspddvefksgagtelsvrakpsa(seqidno：16)；

ascawsgvageeelqx1iqpdksvlvaagetatlrctx2tslx3pvgpiqwfrgagpgrx4liynqx5x6gx7fprvttvsdx8tkrx9nmdfsirignitpadagtyycx10kfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqh(seqidno：17)；

x1为i、v或l，x2为i、a或v，x3为f、i、s或t，x4为v、e或l，x5为r或k，x6为q、或e，x7为p、h或r，x8为t、l、s或g，x9为e，x10为i或v。

信号调控蛋白α(“sirp-α”或“sirp-α”)为一种属于ig超家族的跨膜糖蛋白，其广泛表达于骨髓细胞的膜上。sirp-α与cd47(一种在体内许多细胞类型上广泛表达的蛋白质)相互作用。sirp-α与cd47的相互作用防止可以其他方式被免疫系统识别的“自体”细胞的吞噬。已观测到肿瘤细胞上的高cd47表达可在急性骨髓性白血病和若干实体瘤癌症中作为存活的负性预后因子而起作用。

天然sirp-α包含3个高度同源的免疫球蛋白(ig)-样胞外结构域—d1、d2以及d3。sirp-αd1结构域(“d1结构域”)是指sirp-α的膜远端胞外结构域并且介导sirp-α与cd47的结合。如本文所用，术语“sirp-α多肽”是指能够结合于cd47的任何sirp-α多肽或其片段。存在至少十种野生型人sirp-α的变体。在一些实施方案中，sirp-α多肽包含sirp-αd1结构域。在一些实施方案中，sirp-α多肽包含野生型d1结构域，诸如seqidno：14中所提供的那些野生型d1结构域。在一些实施方案中，sirp-α多肽包括野生型人sirp-α的d2或d3结构域(或d2与d3结构域两者)。

在一些实施例中，还包含与所述信号调控蛋白αd1变体的n端或c端键联的第一fc结构域单体，所述第一fc结构域单体为人igg1、igg2或igg4fc区。

在一些实施例中，所述信号调控蛋白αd1变体键联至所述第一fc结构域单体的c端。

在一些实施例中，所述信号调控蛋白αd1变体的n端键联至所述第一fc结构域单体的c端。

fc结构域单体是指包括第二和第三抗体恒定结构域(例如ch2和ch3)的多肽链。在一些实施方案中，fc结构域单体还包括铰链结构域。在一些实施方案中，fc结构域单体属于任何免疫球蛋白抗体同种型，包括igg、ige、igm、iga以及igd。另外，在一些实施方案中，fc结构域单体属于任何igg亚型(例如igg1、igg2、igg2a、igg2b、igg2c、igg3以及igg4)。在一些实施方案中，fc结构域单体相较于野生型fc结构域单体序列包括多达十种变化(例如1-10、1-8、1-6、1-4个氨基酸取代、添加或插入、缺失或其组合)，所述变化改变fc结构域和fc受体之间的相互作用。

在一些实施例中，所述第一fc结构域单体相对于野生型人igg1、igg2或igg4fc区包含至少一个突变。

在一些实施例中，所述第一fc结构域单体属于igg类并且在e233、l234、l235、g236、g237、d265、d270、n297、e318、k320、k322、a327、a330、p331或p329处包含至少一个氨基酸取代。

在一些实施例中，所述第一fc结构域单体独立地属于igg类，并且包括a)p329处突变，以及b)如下位置突变中的至少一种：e233、l234、l235、g236、g237、d265、d270、n297、e318、k320、k322、a327、a330、p331。

在一些实施例中，所述第一fc结构域单体属于igg类并且在l234、l235、p329处包含至少一个氨基酸取代。

在一些实施例中，所述第一fc结构域单体属于igg1fc区，并且包括a)p329处突变，以及b)如下位置突变中的至少一种：e233、l234、l235、g236、g237、d265、d270、n297、e318、k320、k322、a327、a330、p331。

在一些实施例中，所述第一fc结构域单体属于人igg1fc区且含有a)p329g突变，以及b)如下氨基酸突变中的至少一个：l234a、l235a、g237a、n297a。

在一些实施例中，所述第一fc结构域单体相对于野生型人igg1fc区具有如下氨基酸取代中的至少一个：l234a、l235a、p329g。

在一些实施例中，所述第一fc结构域单体相对于野生型人igg1fc区具有如下氨基酸取代：l234a、l235a、p329g。

在一些实施例中，含有所述第一fc结构域单体的fc结构域不具有影响针对靶细胞的生物反应的能力，或者具有降低的影响针对靶细胞的生物反应的能力，可有效降低产品的副作用。

在一些实施例中，所述生物反应包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、补体依赖性细胞溶解(cdc)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)、炎性介质的释放、胎盘转移、免疫球蛋白产生中的至少一种。

在一些实施例中，本发明所提供的sirp-α多肽或构建体包括连接至第一fc结构域单体(优选为c端)、第二fc结构域单体(优选为c端)的sirp-αd1结构域或其变体以及连接至第一fc结构域单体(通常为n端)、第二fc结构域单体(通常为n端)的抗体重链恒定结构域、抗体重链可变结构域，其中第一和第二fc结构域单体组合形成fc结构域(例如异二聚fc结构域)。fc结构域为存在于免疫球蛋白c端的蛋白质结构。fc结构域包括两个fc结构域单体，所述两个fc结构域单体通过ch3抗体恒定结构域之间的相互作用而二聚化。野生型fc结构域形成结合于fc受体(例如fcγri、fcγriia、fcγriib、fcγriiia、fcγriiib以及fcγriv)的最小结构。

fc结构域不直接参与使抗体与其靶标结合，但可参与各种效应功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。在一些实施例中，本发明公开的sirp-α多肽或构建体中的fc结构域包含氨基酸取代、添加或插入、缺失或其任何组合，所述变化导致降低的效应功能，诸如降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、降低的补体依赖性细胞溶解(cdc)、降低的抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)或其任何组合。在一些实施方案中，本发明公开的sirp-α多肽或构建体的特征为与人fc受体的结合减少(例如极少结合或不结合)以及与补体蛋白c1q的结合减少(例如极少结合)或不结合。在一些实施方案中，本公开的sirp-α构建体的特征为与人fcγri、fcγriia、fcγriib、fcγriiib、fcγriiib或其任何组合以及c1q的结合减少(例如极少结合)或不结合。为了改变或降低抗体依赖性效应功能，诸如adcc、cdc、adcp或其任何组合，在一些实施方案中，本发明公开的sirp-α构建体中的fc结构域属于igg类并且在e233、l234、l235、g236、g237、d265、d270、n297、e318、k320、k322、a327、a330、p331或p329(根据kabat(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版.publichealthservice，nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))的eu索引编号)处包含一个或多个氨基酸取代。

现有技术中，靶向细胞表面抗原的抗体可触发与免疫细胞上的fc受体(fcr)接合相关的免疫刺激和效应功能。存在许多对特定类别的抗体，包括igg(γ受体)、ige(η受体)、iga(α受体)以及igm(μ受体)等等具特异性的fc受体。fc区与细胞表面上的fc受体的结合可触发许多生物反应，包括抗体包被的颗粒的吞噬(抗体依赖性细胞介导的吞噬作用，亦称adcp)、免疫复合物的清除、抗体包被的细胞被杀伤细胞裂解(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，亦称adcc)以及炎性介质的释放、胎盘转移以及免疫球蛋白产生的控制。另外，补体的c1组分与抗体的结合可活化补体系统。补体的活化对于细胞病原体的裂解可能是重要的。然而，补体的活化也可以刺激炎症反应，并且也可能参与自体免疫性超敏反应或其他免疫性病症。具有减少或消除的结合某些fc受体的能力的变体fc区可适用于开发治疗性抗体和fc-融合多肽构建体，其通过靶向、活化或中和配体功能而起作用，而不损害或破坏局部细胞或组织。

在一些实施例中，所述信号调控蛋白αd1变体通过接头键联至第一fc结构域单体。

在一些实施例中，所述信号调控蛋白αd1变体通过接头键联至第一fc结构域单体的c端。

在一些实施例中，所述接头为仅含有g(gly，即甘氨酸)、s(即ser，丝氨酸)的短肽。

在一些实施例中，所述接头为含有5-30个氨基酸残基的短肽。

在一些实施例中，所述接头含有如seqidno：7所示氨基酸序列。

在一些实施例中，还包含可与第一fc结构域单体键联的第二多肽，所述第二多肽包含第二fc结构域单体，所述第一fc结构域单体可与包含第二fc结构域单体的第二多肽键联，以形成fc结构域二聚体。

在一些实施例中，第一fc结构域单体、第二fc结构域单体中的至少一种的n端或c端键联有所述信号调控蛋白αd1变体。

在一些实施例中，第一fc结构域单体、第二fc结构域单体中的至少一种的c端键联有所述信号调控蛋白αd1变体。

在一些实施例中，第一fc结构域单体、第二fc结构域单体的c端均键联有所述信号调控蛋白αd1变体。

在一些实施例中，第一fc结构域单体、第二fc结构域单体相同或不同。

在一些实施例中，第一fc结构域单体、第二fc结构域单体相同。

在一些实施例中，所述第一fc结构域单体键联有第三多肽。

在一些实施例中，所述第二fc结构域单体键联有第四多肽。

在一些实施例中，所述第一fc结构域单体的n端键联有第三多肽。

在一些实施例中，所述第二fc结构域单体的n端键联有第四多肽。

在一些实施例中，所述第三多肽、第四多肽中的至少一种包含抗体重链可变结构域vh。

在一些实施例中，所述第三多肽、第四多肽中的至少一种包含抗体重链恒定结构域ch1。

在一些实施例中，所述第三多肽、第四多肽中的至少一种包含抗体重链可变结构域vh以及抗体重链恒定结构域ch1。

在一些实施例中，所述第三多肽、第四多肽相同或不同；

在一些实施例中，所述第三多肽、第四多肽相同；

在一些实施例中，所述第三多肽、第四多肽中的至少一种含有seqidno：2所示氨基酸序列，或与该氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述第三多肽、第四多肽中的至少一种含有seqidno：3所示氨基酸序列，或与该氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，从n端到c端，所述第三多肽、第四多肽中的至少一种依次含有seqidno：2、seqidno：3所示氨基酸序列，或与seqidno：2、seqidno：3所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，从n端到c端，所述第三多肽、第四多肽各自独立地依次含有seqidno：2、seqidno：3所示氨基酸序列，或与seqidno：2、seqidno：3所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，seqidno：3所示氨基酸序列的c端键联至所述fc结构域单体的n端。

在一些实施例中，所述第一fc结构域单体上键联的第三多肽中包含的抗体可变结构域、第二fc结构域单体上键联的第四多肽中包含的抗体可变结构域中的至少一个靶向在细胞上表达的抗原。

在一些实施例中，所述细胞为癌细胞。

在一些实施例中，所述抗体可变结构域靶向在免疫细胞调控中所涉及的细胞表面蛋白。

抗体可变结构域是指抗体轻链和重链中包括互补决定区(cdr，例如cdrl1、cdrl2、cdrl3、cdrh1、cdrh2以及cdrh3)和构架区(fr)的氨基酸序列的部分。抗体的可变结构域可赋予抗体结合于特定抗原的能力。可构建许多不同的抗体可变结构域分子。在一些实施方案中，所用的抗体可变结构域分子包括但不限于单链fv。

在一些实施例中，所述第三多肽、第四多肽独立地包括治疗性蛋白质。

在一些实施例中，所述治疗性蛋白质为细胞因子、白细胞介素、抗原、类固醇、抗炎剂或免疫调节剂。

在一些实施例中，所述第三多肽、第四多肽中的至少一种的n端或c端键联有第一信号肽。

在一些实施例中，所述第三多肽、第四多肽中的至少一种的n端键联有第一信号肽。

在一些实施例中，所述第一信号肽包括动物的igg1重链。

在一些实施例中，所述第一信号肽包括如seqidno：1所示的氨基酸序列，或与该氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述信号调控蛋白αd1变体可结合至cd47。

在一些实施例中，本发明的多肽比bite半衰期更长。

在一些实施例中，本发明的多肽为完全对称的分子结构，不存在错配的风险。

根据第二方面，在一些实施例中，提供一种多肽，包含：

(a)信号调控蛋白αd1变体，信号调控蛋白αd1变体如第一方面所定义；

(b)fc变体，所述fc变体包含具有两个fc结构域单体的fc结构域二聚体，其中每个fc结构域单体独立地为包含人igg1、igg2或igg4fc区的突变体。

在一些实施例中，所述信号调控蛋白αd1变体相对于野生型信号调控蛋白αd1结构域在残基70处具有氨基酸突变，以及相对于野生型信号调控蛋白αd1结构域还具有如下氨基酸突变中的至少一种：残基6、残基27、残基31、残基47、残基53、残基54、残基56、残基66、残基92。

在一些实施例中，所述野生型信号调控蛋白αd1结构域具有seqidno：13所示核苷酸序列。

在一些实施例中，所述信号调控蛋白αd1变体的n端、c端中的至少一端还键联有如下氨基酸序列中的至少一种：

1)ascawsgvag；

2)pvvsgpaaratpqh；

或者，所述信号调控蛋白αd1变体的n端、c端中的至少一端键联有与前述两种氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种。

在一些实施例中，所述多肽还包含键联至所述信号调控蛋白αd1变体n端的如下氨基酸序列：ascawsgvag，或与该氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述多肽还包含键联至所述信号调控蛋白αd1变体c端的如下氨基酸序列：pvvsgpaaratpqh，或与该氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述多肽包含以下氨基酸序列中的至少一种：

eeelqx1iqpdksvlvaagetatlrctx2tslx3pvgpiqwfrgagpgrx4liynqx5x6gx7fprvttvsdx8tkrx9nmdfsirignitpadagtyycx10kfrkgspddvefksgagtelsvrakpsa(seqidno：16)；

ascawsgvageeelqx1iqpdksvlvaagetatlrctx2tslx3pvgpiqwfrgagpgrx4liynqx5x6gx7fprvttvsdx8tkrx9nmdfsirignitpadagtyycx10kfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqh(seqidno：17)；

x1为i、v或l，x2为i、a或v，x3为f、i、s或t，x4为v、e或l，x5为r或k，x6为q、或e，x7为p、h或r，x8为t、l、s或g，x9为e，x10为i或v。

在一些实施例中，所述信号调控蛋白αd1变体键联至所述第一fc结构域单体的c端。

在一些实施例中，所述信号调控蛋白αd1变体的n端键联至所述fc结构域单体的c端。

在一些实施例中，每个fc结构域单体独立地属于igg类，并且包括a)p329处突变，以及b)如下位置突变中的至少一种：e233、l234、l235、g236、g237、d265、d270、n297、e318、k320、k322、a327、a330、p331。

在一些实施例中，每个fc结构域单体独立地属于igg1fc区，并且包括a)p329处突变，以及b)如下位置突变中的至少一种：e233、l234、l235、g236、g237、d265、d270、n297、e318、k320、k322、a327、a330、p331。

在一些实施例中，每个fc结构域单体独立地属于igg类并且在e233、l234、l235、g236、g237、d265、d270、n297、e318、k320、k322、a327、a330、p331或p329处包含至少一个氨基酸取代。

在一些实施例中，每个fc结构域单体独立地属于igg类并且在l234、l235、p329处包含至少一个氨基酸取代。

在一些实施例中，每个fc结构域单体独立地属于人igg1fc区且在l234、l235、p329处包含至少一个氨基酸取代。

在一些实施例中，每个fc结构域单体独立地属于人igg1fc区且含有a)p329g突变，以及b)如下氨基酸突变中的至少一个：l234a、l235a、g237a、n297a。

在一些实施例中，所述fc结构域单体中的至少一个为由突变l234a、l235a、g237a、n297a、p329g组成的人igg1fc区。

在一些实施例中，所述fc结构域单体中的至少一个为由突变l234a、l235a、p329g组成的人igg1fc区。

在一些实施例中，每个fc结构域单体独立地相对于野生型人igg1fc区具有如下氨基酸取代：l234a、l235a、p329g。

在一些实施例中，每个fc结构域单体独立地包含seqidno：5-6所示的氨基酸序列中的至少一种，或与seqidno：5-6所示的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，每个fc结构域单体独立地包含seqidno：4-6所示的氨基酸序列中的至少一种，或与seqidno：4-6所示的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，每个fc结构域单体独立地包含从n端到c端依次连接的seqidno：4-6所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述两个fc结构域单体是相同的。

在一些实施例中，所述fc变体与人iggfc区的野生型型式相比展现消除或减少的与fcγ受体的结合。

在一些实施例中，所述igg1fc变体与人igg1fc区的野生型型式相比展现消除或减少的与cd16a、cd32a、cd32b、cd32c以及cd64fcγ受体的结合。

在一些实施例中，所述igg1fc变体以大于约5x10^-6m的kd结合于fcγ受体。

在一些实施例中，所述igg1fc变体与人igg1fc融合物的野生型型式相比展现消除或减少的与c1q的结合。

在一些实施例中，所述信号调控蛋白αd1变体可与cd47结合。

在一些实施例中，所述fc变体键联有抗原结合部分。

在一些实施例中，所述fc变体的n端键联有抗原结合部分。

在一些实施例中，所述fc变体键联有可与pd-l1结合的第五多肽。

在一些实施例中，所述fc变体的n端键联有可与pd-l1结合的第五多肽。

在一些实施例中，所述第五多肽包含抗体重链第一恒定结构域(ch1)、抗体重链可变结构域(vh)、抗体轻链恒定结构域(cl)、抗体轻链可变结构域(vl)中的至少一种。

在一些实施例中，所述第五多肽包含seqidno：2、3、10或11所示氨基酸序列中的至少一种，或与前述四种氨基酸序列中的至少一种具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述五多肽还包含可键联至抗体轻链可变结构域(vl)的第二信号肽。

在一些实施例中，所述第二信号肽键联至抗体轻链可变结构域(vl)的n端。

在一些实施例中，所述第二信号肽键含有seqidno：9所示氨基酸序列，或与该氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

根据第三方面，在一些实施例中，提供一种多肽，其包含：fc变体，其中所述fc变体包含具有两个fc结构域单体的fc结构域二聚体，其中每个fc结构域单体独立地属于igg类，并且包括a)p329处突变，以及b)如下位置突变中的至少一种：e233、l234、l235、g236、g237、d265、d270、n297、e318、k320、k322、a327、a330、p331。

在一些实施例中，每个fc结构域单体独立地属于igg1fc区，并且包括a)p329处突变，以及b)如下位置突变中的至少一种：e233、l234、l235、g236、g237、d265、d270、n297、e318、k320、k322、a327、a330、p331。

在一些实施例中，每个fc结构域单体独立地属于人igg1fc区且含有a)p329g突变，以及b)如下氨基酸突变中的至少一个：l234a、l235a、g237a、n297a。

在一些实施例中，其中每个fc结构域单体独立地选自由突变l234a、l235a、p329g组成的人igg1fc区。

在一些实施例中，所述两个fc结构域单体是相同的。

在一些实施例中，所述fc变体与所述人iggfc区的所述野生型型式相比展现消除或减少的与fcγ受体的结合。

在一些实施例中，所述fc变体与所述人iggfc区的所述野生型型式相比展现消除或减少的与cd16a、cd32a、cd32b、cd32c以及cd64fcγ受体的结合。

在一些实施例中，其中所述fc变体与所述人iggfc融合物的所述野生型型式相比展现消除或减少的与c1q的结合。

在一些实施例中，所述fc变体与人igg1fc区的野生型型式相比展现消除或减少的与cd16a、cd32a、cd32b、cd32c以及cd64fcγ受体的结合。

在一些实施例中，所述fc变体与人igg1fc融合物的野生型型式相比展现消除或减少的与c1q的结合。

在一些实施例中，所述fc变体以大于约5x10-6m的kd结合于fcγ受体。

在一些实施例中，还包含可结合cd47的多肽。

在一些实施例中，其中所述fc变体与人iggfc区的野生型型式相比展现消除或减少的与fcγ受体的结合。

在一些实施例中，所述结合cd47的多肽在啮齿动物和非人灵长类动物中不引起急性贫血。

在一些实施例中，所述结合cd47的多肽在人中不引起急性贫血。

在一些实施例中，所述结合cd47的多肽为信号调控蛋白α(sirp-α)多肽或其片段。

在一些实施例中，其中所述信号调控蛋白α多肽包含sirp-αd1变体，所述sirp-αd1变体如第一方面所定义。

根据第四方面，在一些实施例中，提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码第一方面所述多肽，或第二方面，或第三方面所述多肽。

在一些实施例中，编码所述多肽的核苷酸的两端各包含一个酶切位点。

在一些实施例中，编码所述多肽的抗体重链的核苷酸包含位于5’端酶切位点与编码第一信号肽的核苷酸之间的kozak序列。

在一些实施例中，kozak序列是存在于真核生物mrna的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。具体而言，kozak序列是位于真核生物mrna5’端帽子结构后面的一段核酸序列，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的mrna翻译起始。对应于原核生物的sd序列。

在一些实施例中，所述kozak序列含有如下核苷酸序列：gccacc。

在一些实施例中，编码所述多肽的抗体重链的核苷酸的5’端含有hindiii酶切位点，3’端含有ecori酶切位点。

在一些实施例中，编码所述多肽的抗体轻链的核苷酸的5’端含有xbali酶切位点，3’端含有noti酶切位点。

在一些实施例中，编码所述多肽的抗体轻链的核苷酸包含位于5’端酶切位点与编码第二信号肽的核苷酸之间的kozac序列。

在一些实施例中，所述kozac序列含有如下核苷酸序列：gccacc。

根据第五方面，在一些实施例中，提供一种构建体，所述构建体含有第四方面所述多核苷酸。所述构建体通常可以通过将所述分离的多核苷酸插入合适的载体中构建获得，本领域技术人员可选择合适的载体，所述载体可以是噬菌体、质粒、病毒载体或人工染色体，诸如细菌或酵母人工染色体。换言之，本发明的实施方案的载体包含能够在宿主细胞或其分离的级分中表达的感兴趣的多核苷酸。载体通常还适合作为克隆载体，即在微生物系统中可复制；克隆载体可以被设计用于在一种宿主中复制，而构建体被设计用于在不同的宿主中表达。包含本发明的实施方案的多肽和蛋白的载体还可以包含用于在宿主细胞中繁殖或选择的选择标记。载体可以通过常规转化或转染技术引入到原核或真核细胞中。

根据第六方面，在一些实施例中，提供一种表达系统，所述表达系统含有如第五方面所述构建体或基因组中整合有外源的如第四方面所述多核苷酸。所述表达系统可以是宿主细胞，所述宿主细胞可以表达如第一方面所述多肽，或第二方面所述多肽，或第三方面所述多肽。在本发明另一具体实施例中，所述宿主细胞可以是真核细胞和/或原核细胞，更具体可以是小鼠细胞、人细胞等。

根据第七方面，在一些实施例中，提供一种组合物，其包含第一方面所述多肽，或第二方面所述多肽，或第三方面所述多肽，或第四方面所述多核苷酸，以及药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂中的至少一种。

本说明书中使用的术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”包括液体或固体填充剂，还可以包括但不限于溶剂和包封材料中的至少一种；并且是指药学或生理学上可接受的材料、组合物、物质或介质。

根据第八方面，在一些实施例中，提供一种试剂盒，其包括第七方面所述组合物。

在一些实施例中，还包括容纳第七方面所述组合物的容器。

根据第九方面，在一些实施例中，提供第一方面所述多肽，或第二方面所述的多肽，或第三方面所述的多肽，或第四方面所述多核苷酸，或第五方面所述构建体，或第六方面所述表达系统，或第七方面所述组合物在制备治疗由cd47和/或pd-l1过表达引起的疾病的药物中的用途。

在一些实施例中，所述疾病包括但不限于急性髓细胞样白血病(aml)、慢性髓细胞样白血病(cml)、急性淋巴细胞白血病(all)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、多发性骨髓瘤(mm)、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肾细胞癌中的至少一种。

在一些实施例中，所述疾病包括但不限于克罗恩病、过敏性哮喘、类风湿性关节炎中的至少一种。

在一些实施例中，本发明提供的重组融合蛋白可以同时与cd47、pd-l1结合，但不会与fc受体结合，或者具有降低的fc受体结合力。

在一些实施例中，含有信号调控蛋白αd1变体、fc变体的多肽可以同时靶向pd-l1抗原和cd47分子，突破单抗单独治疗的局限性，双抗的功能更强，去除了adcc功能，降低了产品可能的副作用，还可以同时克隆到一个表达载体上，提高了表达效率。

在一些实施例中，信号调控蛋白α(sirp-α)d1变体与癌细胞或肿瘤细胞上的cd47结合，可以阻断cd47与巨噬细胞上sirp的相互作用，因而解除sirp介导的抑制信号对巨噬细胞的检查。

在一些实施例中，本发明提供的多肽为pd-l1抗体，其抗原结合(fab)部分(或互补位)可以与癌细胞或肿瘤细胞表面的pd-l1结合，阻断pd-l1与t细胞表面pd-1的相互作用，从而解除pd-1介导的抑制信号对t细胞的检查。

本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保留与抗原(例如pd-l1)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已证明抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来行使。术语抗体的“抗原结合部分”中所包括的结合片段的例子包括：(i)fab片段，即由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab’)2片段，即包含在铰链区处通过二硫键连接的两个fab片段的双价片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段；(v)由vh结构域组成的dab片段(ward等(1989)nature341：544-546)；和(vi)分离的互补决定区(cdr)。此外，尽管fv片段的两个结构域vl和vh由单独的基因编码，但是它们可以利用重组方法通过合成连接体连接在一起，该连接体使它们能够制成一条蛋白质链，其中vl和vh区配对构成单价分子(称为单链fv(scfv)；参见，例如bird等(1988)science242：423-426；和huston等(1988)proc.natl.acad.sci.usa85：5879-5883)。这种单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段用本领域技术人员公知的常规技术获得，并用与完整抗体相同的方法对这些片段的实用性进行筛选。

在一些实施例中，本发明还提供编码该重组融合蛋白的多核苷酸、包含该多核苷酸的表达载体、制备该重组蛋白的方法，以及使用重组蛋白治疗由cd47和/或pd-l1过表达引起的疾病。

在一些实施例中，本发明提供的pd-l1/sirpα双抗可以同时靶向pdl1抗原和cd47分子，突破单抗单独治疗的局限性，双抗的功能更强。

在一些实施例中，本发明提供的pd-l1/sirpα双抗序列采用了igg1的fc段，去除了adcc功能(抗体依赖、细胞介导的细胞毒性，antibodydependentcell-mediatedcytotoxicity，简称adcc)，降低了产品可能的副作用。

adcc，是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(adcc，antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity)，是指抗体的fab段结合病毒感染的细胞或肿瘤细胞的抗原表位，其fc段与杀伤细胞(nk细胞、巨噬细胞等)表面的fcr结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞。

在一些实施例中，pdl1/sirpα双抗序列同时克隆到一个表达载体上，提高了表达效率。

在一些实施例中，本发明包括如下阶段：

第一阶段：进行双特异性抗体结构设计。分别对pdl1和sirpα突变体进行构建，再进行双抗载体构建及鉴定。进行转化实验，提取质粒。

第二阶段：稳转株构建。质粒转染cho-k1细胞构建瞬时表达系统，之后再构建稳定表达系统。

第三阶段：抗体纯化。使用proteina进行纯化，先对瞬转系统进行纯化，并进行初步分析鉴定；后对稳转株进行纯化工艺开发，最终纯化出合格的原液。

第四阶段：分析方法的建立。针对双抗的分子进行分析方法的开发，并建立相关的检测方法。

第五阶段：抗体功能验证。体外功能验证包括双抗与靶细胞的结合能力测验和tdcc杀伤活性检测。体内功能验证包括抗肿瘤活性检测等。

在一些实施例中，本发明包括如下步骤：

(1)在pdl1抗体c末端连接sirpα融合蛋白，将重链、轻链分别克隆至含有两个启动子的同一个表达载体中。使得已构建的表达载体成功表达目的蛋白。

(2)建立有效的稳转(稳定转染)细胞株筛选的方法。单克隆细胞株筛选后，采用免疫印迹的实验技术，检测目标克隆的分子量是否在180kd左右，即可判断稳转是否成功。

(3)y-trap完全对称的分子结构，纯化过程简单，无异源二聚体的问题。采用proteina进行纯化，制备符合要求的标准品。

(4)建立可靠的分析方法。

在一些实施例中，构建psk001(quacell，cat.no.a13201)表达载体，瞬时转染至expicho-s^tmcells(thermo，cat.no.a29127)细胞株中，培养周期为7天，培养温度为32℃。当细胞活力降到80％以下时，终止反应器中的反应，收取细胞培养上清液，采用hitrapmabselectsurelx1ml(ge，cat.no.17547401)预装柱进行亲和纯化，重组蛋白的纯度高于95％。

实施例1

表达重组蛋白cla014的载体的构建

人工设计重组融合蛋白cla014的全长编码序列。

如图1所示为本实施例中重组融合蛋白cla014的结构示意图，包括内侧的两个重组重链单体和外侧的两个重组轻链单体，内侧的两个重组重链单体通过二硫键键联，形成二聚体。

对于每个重组重链单体，从n端到c端，依次为抗体重链可变结构域(vh)、抗体重链第一恒定结构域(ch1)、铰链(hinge)、抗体重链第二恒定结构域(ch2)、抗体重链第三恒定结构域(ch3)、接头、sirpαd1变体。

对于每个重组轻链单体，从n端到c端，依次为抗体轻链可变结构域、抗体轻链恒定结构域。

重组轻链恒定结构域(cl)与重组重链恒定结构域(ch1-ch2-ch3)通过二硫键键联。

图1中，sirpαd1变体可结合至cd47，抗体重链、轻链的可变结构域键联形成的抗原结合部分(即图1的vh、vl区域键联形成的抗原结合部分)为pd-l1结合区。

具体地，对于重链，sirpα的第一胞外结构域(sirpαd1)变体的编码序列通过gs接头与cla014的重链fc段编码序列的3’端连接。将编码小鼠igg1重链的信号肽(即第一信号肽)的57个核苷酸加到抗体重链恒定结构域(vh)编码序列的5’端，并将kozak序列加到信号肽编码序列的5’端。最后，在所得序列的5’和3’端分别加入hindiii和ecori限制性酶切位点。

对于轻链，使用另一个信号肽编码序列(即第二信号肽编码序列)和kozac序列，但是在所得序列的5’和3’端分别加入xbal和noti限制性酶切位点。两个所得的序列通过华大基因合成(id#:c5119fj290-cl004-04)，并分别克隆到psk001载体中。psk001载体购自生产商：中山康天晟合生物技术有限公司；载体原始名称quacellpks001，货号：a13201。

从n端到c端，重链片段氨基酸序列(插入位点hindiii、ecori)：

第一信号肽(亦称重链信号肽)的氨基酸序列如下：

melglswifllailkgvqc(seqidno：1)。

vh段的氨基酸序列如下：

qvqlvqsgaevkkpgssvkvscktsgdtfstyaiswvrqapgqglewmggiipifgkahyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyfcarkfhfvsgspfgmdvwgqgttvtvss(seqidno：2)。

ch1段的氨基酸序列如下：

astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkv(seqidno：3)。

本实施例中，fc结构域单体段为铰链+ch2+ch3，各局部区域的氨基酸序列具体如下：

铰链(hinge)的氨基酸序列如下：

epkscdkthtcppcp(seqidno：4)。

ch2段的氨基酸序列如下：

ch3段的氨基酸序列如下：

对于fc结构域单体段，ch2段、ch3段中，下划单直线标示的两个aa氨基为突变氨基，具体为突变l234a、l235a(即相对于野生型的igg1fc区，在残基234、235处具有氨基酸突变，由ll氨基突变为aa氨基)；下划单波浪线标示的g氨基为突变p329g(即相对于野生型的重链，在残基329处具有氨基酸突变，本实施例由p氨基突变为g氨基)，fc段前述三处突变，实现去除adcc功能；下划双直线标示的末端氨基酸a，是由k突变为a，防止氧化脱落。本文中所提及的fc区氨基酸残基位置234、235、329可以是根据kabat等人，1991的eu编号系统所指定。

铰链+ch2+ch3组成的fc结构域单体段氨基酸序列如下：

epkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspga(seqidno：18)。

gs接头(link)的氨基酸序列如下：

ggggsggggsggggsggggsg(seqidno：7)。

第一胞外结构域(sirpαd1)变体的氨基酸序列如下：

ascawsgvageeelqiiqpdksvlvaagetatlrctitslfpvgpiqwfrgagpgrvliynqrqgpfprvttvsdttkrenmdfsirignitpadagtyycikfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqh(seqidno：8)。

从n端到c端，抗体轻链氨基酸序列依次包括第二信号肽(亦称轻链信号肽)、轻链可变区(vl)、轻链恒定区(cl)。

具体如下：

第二信号肽：

mdmrvpaqllgllllwlsgarc(seqidno：9)。

轻链可变区(vl)：

eivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqrsnwptfgqgtkveik(seqidno：10)。

轻链恒定区(cl)：

rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno：11)。

抗体重链的核苷酸序列具体如下：

seqidno：11所示抗体重链核苷酸序列中，从5’端到3’端，依次包括hindiii酶切位点、kozak序列、第一信号肽编码序列、vh编码序列、ch1编码序列、铰链编码序列、ch2编码序列、ch3编码序列、gs接头编码序列、sirpα变体编码序列、翻译终止密码子、ecori酶切位点，前述各个序列在seqidno：11所示核苷酸序列中，用下划单波浪线和下划单直线间隔标示，例如，第一条下划单波浪线标示的核苷酸序列为hindiii酶切位点，第一条下划单直线标示的核苷酸序列为kozac序列，第二条下划单波浪线标示的核苷酸序列为第一信号肽编码序列，第二条下划单直线标示的核苷酸序列为vh编码序列，依此类推。

从5’端到3’端，抗体轻链的核苷酸序列依次包括xbali酶切位点、kozac序列、第二信号肽编码序列、轻链可变区(vl)编码序列、轻链恒定区(cl)编码序列、终止密码子、noti酶切位点，通过下划单波浪线、下划单直线间隔标示，具体如下：

seqidno：13所示核苷酸序列中，从5’端到3’端，第一条下划单波浪线标示的核苷酸序列为xbali酶切位点，第一条下划单直线标示的核苷酸序列为kozac序列，第二条下划单波浪线标示的核苷酸序列为第二信号肽编码序列，第二条下划单直线标示的核苷酸序列为轻链可变区(vl)编码序列，第三条下划单波浪线标示的核苷酸序列为轻链恒定区(cl)编码序列，第三条下划单直线标示的核苷酸序列为终止密码子，第四条下划单波浪线标示的核苷酸序列为noti酶切位点。

pdl1-sirpα-native是指野生型sirpαd1，根据pdl1-sirpα-native流式分析结果，从n端到c端，野生型sirpαd1的氨基酸序列如下：

eeelqviqpdksvlvaagetatlrctatslipvgpiqwfrgagpgreliynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakpsa(seqidno：14)。

野生型sirpαd1的核苷酸序列如下：

5’-gaagaagaactgcaagtgattcagcccgacaagtccgtgctggtggccgctggagaaacagctacattgagatgtacagctacatccctgatccccgtgggccctattcaatggttcaggggagctggacctggaagggaactgatttacaaccagaaggagggccacttccccagggtgacaacagtgtctgatctgacaaaaaggaacaacatggacttctccatcaggatcggcaacatcacccccgccgatgctggaacatattattgtgtgaagttccggaagggctcccccgacgatgtggagtttaaatccggagctggcacagagctgtccgtgagggctaaaccctccgct-3’(seqidno：15)。

实施例2

蛋白表达和纯化

为制备重组蛋白cla014，将表达载体经电穿孔导入中国仓鼠卵巢(cho)细胞(atcc，cat#ccl-61)中，之后，这些cho细胞接受几轮的msx压力选择。选出的稳定表达细胞在无血清cd04cho生长a培养基(irvinescientific，cat#94120)中适应。对于蛋白表达，将细胞接种到3升生物反应器中，并以流加培养法培养。当细胞活力降到约80％时，终止反应器中的反应，收取细胞培养上清液并通过亲和色谱法进行蛋白纯化。重组蛋白的纯度高于90％。图2为蛋白检测结果图，图2中，右侧数值为蛋白的分子量，其中包括非还原组和还原组。

对图2的各组别说明如下：

培养液(天然)：sirpα序列为天然序列时，瞬时转染至cho细胞，培养活率细胞活力降到约80％时，取样检测；

流穿(天然)：sirpα序列为天然序列时，瞬时转染至cho细胞，培养活率细胞活力降到约80％时，进行proteina上样纯化，收集流穿样品，取样检测；

培养液(突变)：sirpα序列为sirrα变体序列时，瞬时转染至cho细胞，培养活率细胞活力降到约80％时，取样检测；

流穿(突变)：sirpα序列为sirrα变体序列时，瞬时转染至cho细胞，培养活率细胞活力降到约80％时，进行proteina上样纯化，收集流穿样品，取样检测；

洗脱液(天然)：sirpα序列天然序列时，瞬时转染至cho细胞，培养活率细胞活力降到约80％时，进行proteina上样纯化，洗脱收集样品，取样检测；

洗脱液(突变)：sirpα序列为sirrα变体序列时，瞬时转染至cho细胞，培养活率细胞活力降到约80％时，进行proteina上样纯化，洗脱收集样品，取样检测。

从图2可以看出，目标克隆的分子量在180kd左右，表明稳转成功。

实施例3

cla014与pd-l1或cd47结合

取高表达cd47的jurkat细胞，用cla014在4℃孵育1小时，阳性对照为jurkat细胞，用sirpα-his(义翘神州，11612-h08h)在4℃孵育1小时；孵育完成后，细胞用预冷pbs清洗两遍，之后实验组用apc(别藻蓝蛋白，allophycocyanin)标记的针对人iggfc的二抗(biolegend，cat#409306)孵育45分钟，对照组用apc标记的针对his的二抗(biolegend，cat#362605)孵育45分钟；孵育完成后用预冷至4℃的pbs清洗两遍后重悬于400μl的pbs中，1小时内用流式细胞仪(sony，ma900)进行facs分析(流式细胞荧光分选，fluorescenceactivatedcellsorting)。

本次试验设计了与sirp天然序列进行对比，其中，对于pdl1-sirpα-native(是指sirpα序列为天然序列)与pdl1-sirpα-mutant(是指sirpα序列为变体序列，具体结构及序列如实施例1所述)，两者的pd-l1结合区的编码序列，以及fc区、接头、铰链区均是相同的。

图3中，blank-cho-shfc-apc实验组的空白对照(cho-s培养上清，二抗是抗人fc荧光二抗)。

blank-cho-shis-apc表示实验组的空白对照(cho-s培养上清，二抗是抗his荧光二抗)。

positive-sirpαhis-apc表示jurkat细胞阳性对照，证明能与sirpα结合。

negative-pdl1-apc表示jurkat细胞阴性对照，证明此细胞不能与pdl1结合。

pdl1-sirpα-nativehfc-apc表示实验组(天然)。

pdl1-sirpα-mutanthfc-apc表示实验组(突变)。

结果发现，cla014中sirpαd1变体的cd47结合能力比天然序列的cd47结合能力更强。

取高表达pd-l1的u251细胞用cla014或对照在4℃孵育1小时，细胞用预冷pbs清洗两遍，之后用apc标记的针对人iggfc的二抗(biolegend，cat#409306)孵育45分钟，用预冷pbs清洗两遍后重悬于400μl的pbs中，1小时内用流式细胞仪(sony，ma900)进行facs分析。

图4所示为pd-l1结合分析的流式细胞荧光分选图，结果发现，cla014的pd-l1结合能力比天然序列的pd-l1结合能力更强。

实施例4

cla014阻断pd-l1与pd-1的相互作用

生物素-pd1-fc与连续稀释的cla014-mutant、cla014-nature、tti-622添加到含cho-pd-l1细胞的96孔板。细胞于4℃孵育45分钟，用pbs洗，并进一步与结合pe的小鼠抗人cd279(bdbioscience，cat#557946)于4℃孵育45分钟。细胞清洗后重悬于200ml的pbs中，并经facs分析pd1-fc对膜上pd-l1的结合亲和力。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

sequencelisting

<110>深圳市乐土生物医药有限公司

<120>一种多肽及其用途

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valglncys

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glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyser

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servallysvalsercyslysthrserglyaspthrpheserthrtyr

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alailesertrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet

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glyglyileileproilepheglylysalahistyralaglnlysphe

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glnglyargvalthrilethralaaspgluserthrserthralatyr

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metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrphecys

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trpglyglnglythrthrvalthrvalserser

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serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr

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pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser

354045

glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser

505560

leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr

65707580

tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys

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lysval

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alaproglualaalaglyglyproservalpheleupheproprolys

151015

prolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysval

202530

valvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyr

354045

valaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglu

505560

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glnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlys

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alaleuglyalaproileglulysthrileserlysalalys

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151015

gluleuthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphe

202530

tyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnproglu

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pheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglngly

65707580

asnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyr

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glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglysergly

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glyglyglysergly

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leuargcysthrilethrserleupheprovalglyproileglntrp

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pheargglyalaglyproglyargvalleuiletyrasnglnarggln

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gluaspphealavaltyrtyrcysglnglnargserasntrpprothr

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argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu

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glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe

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serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser

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thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu

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lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser

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provalthrlysserpheasnargglyglucys

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gtgaaagtgtcctgcaagacctccggcgacaccttctccacatacgccatttcctgggtg180

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gcccactacgcccagaagttccagggcagggtgacaatcaccgccgacgaatccacatcc300

accgcctatatggaactgtcctccctgaggtccgaggacaccgctgtgtatttctgcgcc360

aggaaattccacttcgtgtccggctccccctttggcatggatgtgtggggacagggaacc420

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cctggagaaagggctacactgtcctgtagggcttcccagtccgtgtcctcctatctggcc180

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gccaccggcatccccgccagattttccggatccggatccggaacagattttaccctgaca300

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gluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocysproala

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proglualaalaglyglyproservalpheleupheproprolyspro

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lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval

354045

valaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrval

505560

aspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglugln

65707580

tyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln

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asptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysala

100105110

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225230