基于CRISPR/Cas9构建Fzd6-Q152E定点突变小鼠模型的方法及应用

本发明属于生物技术研究领域，尤其涉及一种基于crispr/cas9构建fzd6-q152e定点突变小鼠模型的方法及应用。

背景技术：

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)，是第三代遗传标记，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的dna序列的多态性，即在基因组特定核苷酸位置发生两种不同核苷酸的改变，有的改变会引起所编码的氨基酸的不同。snp在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对中就有一个，并且这种核苷酸变异是人类可遗传变异中最常见的一种，其在疾病的遗传学研究中有重要意义，因此，深入挖掘snp并研究其生物学功能至关重要。

rs61753730是一个位于人第8号染色体frizzled6(fzd6)基因上的snp，位置为chr.8:103324560，有两个等位位点，分别为c和g，属于错义突变，即在fzd6所翻译的氨基酸的第152位由谷氨酰胺(glutamine，gln或q)转变为谷氨酸(glutamicacid，gln或e)，因此该位点也被称为q152e位点。已有研究证实fzd6参与了抑郁症、血液病、毛发的发育、神经管畸形以及癌症等的发展及进程。目前，也有研究发现rs61753730可能参与人类抑郁症的形成以及其他精神类疾病，但缺乏该位点被编辑的小鼠模型。

技术实现要素：

鉴于此，本发明实施例的目的是提供一种基于crispr/cas9构建fzd6-q152e定点突变小鼠模型的方法及应用，该方法利用最新的crispr/cas9基因编辑技术在小鼠fzd6基因的q152e位置进行定点突变，成功构建了fzd6-q152e定点突变小鼠模型。该模型可以帮助研究人员深入探索fzd6-q152e在携带rs61753730突变的疾病中的遗传学作用提供有效的研究途径和方法。

根据本发明实施例的第一方面，提供一种基于crispr/cas9基因编辑技术构建fzd6-q152e点突变小鼠模型的方法，包括：

(1)确定待突变的位点，该位点位于小鼠fzd6基因第四个外显子，然后使用在线的crisprdesign工具设计sgrna以及对应的引物和同源修复模板donor序列，所述的sgrna序列为seqidno.1，引物序列包括seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4，donor序列为seqidno.5；

(2)使用上述设计的sgrna，退火形成双链dna，构建sgrna/cas9表达载体，并将其线性化和纯化后，作为模板用于体外转录；

(3)将sgrna、cas9mrna以及donor混合，通过显微注射一起注射到小鼠受精卵，然后将注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠子宫中，出生的小鼠为被编辑的f0代小鼠；

(4)通过pcr方法和测序鉴定将所述f0代小鼠划分为野生型小鼠或阳性杂合子小鼠，然后将所述阳性杂合子小鼠与所述野生型小鼠进行交配，获得f1代小鼠，再次通过pcr反应和测序进行鉴定后，被鉴定为阳性的f1代杂合子小鼠即可稳定遗传，然后在f1代杂合子小鼠之间进行杂交，繁育所得后代即可获得纯合突变型和野生型个体。

进一步地，pcr反应中所使用的引物包括两对，其中正向引物序列都为seqidno.2，反向互补引物序列分别为：seqidno.3和seqidno.4，使用这两对引物序列可鉴定所获得的小鼠是野生型小鼠或突变型的小鼠。

根据本发明实施例的第二方面，提供一种基于crispr/cas9基因编辑技术构建fzd6-q152e点突变小鼠模型，其特征在于，所述小鼠模型由权利要求1-2任一所述的方法构建而成。

根据本发明实施例的第三方面，提供第二方面所述的小鼠模型在开展fzd6-q152e在携带rs61753730突变的疾病中的遗传学研究中的应用。

根据本发明实施例的第四方面，提供第二方面所述的小鼠模型在研究抑郁症和其他精神类疾病中的生物学功能中的应用。

根据本发明实施例的第五方面，提供构建fzd6-q152e点突变小鼠模型的试剂盒，含有sgrna以及对应的引物和同源修复模板donor序列，所述的sgrna序列为seqidno.1，引物序列包括seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4，donor序列为seqidno.5。

进一步地，还含有cas9mrna。

根据以上技术方案，本发明的有益效果如下：本发明提供的基于crispr/cas9基因编辑技术构建fzd6-q152e定点突变小鼠模型的方法，操作简单，高效快捷，成本低廉，效果稳定。该模型的建立为进一步开展fzd6-q152e在携带rs61753730突变的疾病中的遗传学作用的研究提供一种新的途径和方法。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。

图1为本发明实施例中rs61753730所在的位置及野生型(wt)和突变型(q152e)所对应的氨基酸序列的比较。

图2为本发明实施例中rs61753730所在位置编码的氨基酸在不同种属中的保守性分析。

图3为本发明实施例中通过2％凝胶电泳鉴定不同基因型小鼠的结果图。

图4为本发明实施例中不同基因型小鼠的基因序列测序结果图。

具体实施方式

以下通过具体实施例并结合附图对本发明做进一步说明。

本发明实施例提供了构建fzd6基因中q152e位点突变的小鼠模型的方法和应用，所使用的技术是最新的crispr/cas9基因编辑技术，该技术不仅能实现基因敲除，在有dna修复模板的条件下，其还会对断裂的双链进行通过同源重组修复，实现基因敲入或对特定靶位点的修饰。

本发明揭示了基于crispr/cas9基因编辑技术突变fzd6基因中的q152e位点的小鼠模型，所述小鼠模型是突变了与人同源的rs61753730位点的小鼠。rs61753730所在的位置如图1所示，图2所示为通过blast在线工具比对该位点在不同物种中的氨基酸序列的保守性，可以看到该位点在多个物种中都是保守的，因此，我们可以通过构建该位点突变的小鼠模型来研究其在人携带rs61753730突变的疾病发生发展过程中的作用。

本发明还揭示了基于crispr/cas9基因编辑技术构建q152e点突变小鼠模型的方法，包括以下步骤：

首先，确定待突变的位点rs61753730(q152e)位于小鼠fzd6基因第四个外显子，然后使用在线的crisprdesign工具(http://crispr.mit.edu/)设计sgrna和对应的引物。sgrna序列为seqidno.1，引物有两对，一对为：正向引物序列seqidno.2，反向引物序列seqidno.3，另一对为正向引物序列同seqidno.2，反向引物序列：seqidno.4，同源修复模板donor序列为seqidno.5。

然后，将合成后的sgrna退火形成双链dna，构建sgrna/cas9表达载体。将重组质粒转化到dh5α大肠杆菌感受态细胞中，通过卡那霉素抗性以及靶标dna的测序，对阳性克隆质粒进行筛选及鉴定，挑选正确的克隆菌落，扩大培养后提取质粒用于准备体外转录模板。

接着，将sgrna/cas9的表达载体线性化，经酚氯仿抽提纯化后，作为模板用于体外转录，根据megashortscript^tmt7transcriptionkit试剂盒体外合成sgrna和cas9mrna。

随后，将上述转录好的sgrna、cas9mrna以及donor混合，调整注射浓度后使用显微注射仪将混合物一起显微注射到c57bl/6j小鼠的受精卵中，再将存活的受精卵移植到假孕母鼠子宫中，等待f0代小鼠出生。然后对出生的小鼠进行鉴定，收集鼠尾，抽提基因组dna，并以此为模板进行pcr反应，反应体系如下：

pcr的反应条件如下：

第一步：

第二步：

然后对上述pcr产物进行跑胶，结果如图3所示，上边所示为使用seqidno.2和seqidno.3引物进行初筛的结果，无条带的为野生型小鼠，进一步使用seqidno.2和seqidno.4引物鉴定阳性小鼠。然后进行割胶回收并纯化，通过sanger测序鉴定靶位点是否有碱基突变。

最后将通过pcr鉴定以及测序鉴定正确的f0代小鼠与野生型c57bl/6j背景小鼠进行交配，获得f1代小鼠，再使用上述鉴定方法对f1代小鼠进行基因型鉴定，获得的阳性f1代杂合子小鼠即可稳定遗传，然后将f1代杂合子小鼠进行杂交，繁育所得后代即可获得纯合突变型和野生型个体。对不同基因型小鼠的测序结果如图4所示，在靶位点发生了碱基突变，野生型中为c/c，杂合型中为c/g，纯合型中为g/g，由此表明，我们成功构建了q152e突变型小鼠模型。

该小鼠模型可以用于开展fzd6基因中rs61753730(q152e)单核苷酸多态性位点在其所参与的疾病中的遗传学功能的研究，也可用于在研究抑郁症和其他精神类疾病中的生物学功能中的应用。

本发明实施例还提供构建fzd6-q152e点突变小鼠模型的试剂盒，含有sgrna以及对应的引物和同源修复模板donor序列，所述的sgrna序列为seqidno.1，引物序列包括seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4，donor序列为seqidno.5。进一步地，还含有cas9mrna。

最后应说明的是这些实施方式仅用于说明本发明而不限制本发明的范围。此外，对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110>浙江大学

<120>基于crispr/cas9构建fzd6-q152e定点突变小鼠模型的方法及应用

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<213>小鼠(musmusculus)

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<213>小鼠(musmusculus)

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<213>小鼠(musmusculus)

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<213>小鼠(musmusculus)

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