一种日本棒束孢菌株及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体而言，涉及一种虫生药用菌株的筛选和培 养，尤其涉及一种日本棒束孢菌株及其应用。


背景技术：

2.虫生真菌具有很高的药用价值。菌类作物的氨基酸组成全面，利用率高，在国际上被 公认是“十分好的蛋白质来源”。菌类也是天然食品维生素的重要来源，其中人体较易缺乏 的维生素b含量丰富，比一般蔬菜高，维生素b2含量比肉类和奶酪高，能防止恶性贫血， 改善神经功能并有效降低血脂。食用菌中矿物质含量是蔬菜的2倍，高于牛羊肉。食用菌 不含淀粉，脂肪含量少，是糖尿病人和肥胖症患者的理想食品。食用菌还含有丰富的甾类、 三萜类、香豆精苷、挥发油、生物碱、有机锗和多糖等药效成分，对调节人体机能、提高 免疫力、降低血压和胆固醇、抗病抗肿瘤以及延缓衰老等具有显著的医疗保健功效。
3.随着人们生活水平的提高、保健意识的增强，以药用真菌为原料生产的保健产品越来 越受到大众的青睐。目前市场上的药用虫生菌类保健产品仍以蛹虫草和冬虫夏草消费为主， 产品过于单一。例如，我国的以冬虫夏草为原料的极草、同仁堂冬虫夏草等，所采用的生 产方式都是以真菌子实体干、鲜品为原料，经过浸汁或研磨后，得到含有部分有效成分的 汁液，再经过稀释、加入一些调味辅料，最后制成胶囊或冲剂。而这种传统的药用菌生产 工艺存在工艺复杂、生产成本高、原料资源短缺等问题，无法适应规模化周期性生产。且 这种虫生真菌在市场上鲜有闻之。
4.日本棒束孢又名大孢虫花、日本冬虫夏草。迄今的研究工作表明，寄生昆虫的不少拟 青霉和棒束孢能产生多种重要的生物活性物质。我国拟青霉和棒束孢资源十分丰富，对其 中一些种已进行了研究开发，如cn102676396b公开的细脚拟青霉菌株，它们也已涉及国 民经济和人民生活的诸多方面。日本棒束孢和细脚拟青霉菌属于不同菌系，研究表明：日 本棒束孢的提取物具有更好的抗肿瘤、免疫调节作用，增强肺、肾功能，防止动脉硬化， 预防贫血，增加小鼠常压耐缺氧，镇静、镇痛，抗菌等功效。
5.目前针对日本棒束孢人工培养过程，cn97113190.2公开了蛹虫草等虫草的人工培养方 法，提出可以采用蚕蛹进行日本棒束孢的培养；本技术的发明人于于辽宁省庄河市仙人洞 国家级自然保护区采集获得日本棒束孢原始菌株，经吉林农业大学根据其形态特征及显微 结构鉴定为大孢虫花(日本棒束孢，isaria japonica)，发明人首次实现了日本棒束孢的人 工培植，并于2014年发表文献《大孢虫花生物学特性及驯化栽培》(菌物研究，第12卷第 4期，2014)，但日本棒束孢原始菌株子实体产出量较低，且培养出的子实体中营养成分 含量不高，导致生产成本偏高，难以实现大规模生产。
6.因此急需对日本棒束孢原始菌株进行筛选和驯化，期望能找到更容易实现人工培育、 子实体产量更高，且子实体营养更丰富的日本棒束孢菌种，从而降低培养成本，帮助实现 日本棒束孢子实体的产业化生产。


技术实现要素：

7.为解决上述问题，本发明提供了一株经长期传代、筛选和驯化获得的日本棒束孢菌株， 使用该菌株进行人工子实体培养，能大幅提升子实体产量，工艺简单，显著降低人工栽培 日本棒束孢子实体的生产成本，能够满足规模化周期性生产的要求；制备出的日本棒束孢 的子实体营养更丰富，具有大孢虫花独有的功效特性，甘露醇、麦角甾醇等多糖含量更高， 具有广阔的市场前景。
8.一方面，本发明提供了一种日本棒束孢菌株，保藏编号为cgmcc no：11610。
9.发明人经过对日本棒束孢原始菌株的长期传代、诱变筛选和驯化，获得了一株更健壮、 子实体产量和质量更高，多糖、甘露醇、麦角甾醇和天冬氨酸等营养成分含量更高的日本 棒束孢菌种zqy001，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编 号为cgmcc no：11610，保藏名称为日本棒束孢(isaria japonica)，保藏日期为2015年 11月27日。
10.进一步地，所述菌株的人工培植方法包括菌种活化、种子液培养和子实体培养；所述 种子液培养包括一级药瓶种子液培养、二级药瓶种子液培养和种子罐发酵培养；所述子实 体培养的栽培料中含有薏仁。
11.发明人在筛选和驯化日本棒束孢菌株的过程中发现，薏仁可以显著提升日本棒束孢的 子实体产量，并且制备出的日本棒束孢的子实体营养更丰富，甘露醇、麦角甾醇等多糖含 量更高。
12.进一步地，所述栽培料的配制方法为：称取葡萄糖20克、蛋白胨5克、硝酸铵3克、磷 酸二氢钾1克、硫酸镁0.5克、碳酸钙0.5克、琼脂20g，加薏仁150-160g，加蒸馏水定容至1000 毫升。
13.进一步地，所述子实体培养步骤为：将栽培料分装至培养容器中，装量为培养容器容 量的1/4，120℃高压灭菌90min，接入1％种子液，培养温度为28℃
‑‑
35℃，培养湿度为 70％-85％，培养时间为10-15天。
14.另一方面，本发明提供了如上所述的日本棒束孢菌株在制备含有多糖、甘露醇、麦角 甾醇、天冬氨酸的食品、保健品、药物和化妆品中的用途。
15.再一方面，本发明提供了薏仁在用于制备日本棒束孢的子实体培养栽培料中的用途。
16.薏仁是我国传统的药食两用的保健食品。薏仁具有利水消肿、健脾祛湿、清热排脓、 抗炎镇痛、增强免疫力等功效。薏仁多糖含量丰富，具有降血糖的作用，含有85％以上的 不饱和脂肪酸，本研究小组令人惊喜地发现，薏仁的营养成分更容易被日本棒束孢利用， 能显著提升日本棒束孢子实体的产量和质量。
17.进一步地，所述日本棒束孢的保藏编号为cgmcc no：11610。
18.进一步地，所述栽培料中薏仁的添加量为10-20％。研究证明薏仁的添加量为10-20％时， 能明显提升日本棒束孢子实体的产量。
19.进一步地，所述栽培料中薏仁的添加量为15-16％。
20.进一步地，所述栽培料包含：葡萄糖2％、蛋白胨0.5％、硝酸铵0.3％、磷酸二氢钾0.1％、 硫酸镁0.05％、碳酸钙0.05％、琼脂2％、薏仁15-16％，其余为蒸馏水。
21.再一方面，本发明提供了一种日本棒束孢的子实体的培养方法，采用如上所述的
栽培 料进行日本棒束孢的子实体培养。
22.进一步地，将栽培料分装至培养容器中，装量为培养容器容量的1/4，120℃高压灭菌 90min，接入1％种子液，培养温度为28℃
‑‑
35℃，培养湿度为70％-85％，培养时间为10-15 天。
23.进一步地，所述培养容器为保鲜盒或是培养瓶，其中保鲜盒通过盖子紧闭进行栽培， 培养瓶通过塑料布封口栽培。
24.进一步地，所述子实体培养方法包括以下步骤：
25.(1)菌种活化
26.将日本棒束孢菌种接种到试管母体培养基中，于23～25℃恒温培养箱中培养5～7天， 获得活化的日本棒束孢菌种；
27.所述母体培养基的配制方法是：称取马铃薯200克，洗净、切成小块后加蒸馏水，沸 水煮30分钟，取其煮汁以及葡萄糖20克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁1.5克、琼脂20克， 加蒸馏水定容至1000毫升，ph自然，120℃高压灭菌90分钟，待温度降至26～30℃以下 后使用；
28.(2)一级摇瓶种子培养
29.从活化的日本棒束孢菌种培养基上挑取3～4块大小为2mm的无培养基的菌丝块，转 接至装有一级摇瓶培养基的锥形瓶中，静置培养3天，然后置于摇床上，于23～25℃、90～ 120转/分钟震荡培养2～3天，得到二级摇瓶菌种液；
30.所述的一级摇瓶培养基配制方法是：称取蔗糖20克、玉米粉15克、淀粉5克、谷氨 酸4克、硝酸铵4克、磷酸二氢钾1克、硫酸镁0.5克、碳酸钙0.5克，加蒸馏水定容至 1000毫升，将配好的培养基分装于锥形瓶中，装料量为锥形瓶容量的1/5～2/5，用棉塞和 牛皮纸扎封瓶口，于120℃高压灭菌90分钟，待温度降至26～30℃以下后使用；
31.(3)二级摇瓶种子培养
32.将二级摇瓶菌种液接种至装有二级摇瓶培养基的锥形瓶中，接种量为10～20％，接种 后置于摇床上，于23～25℃、120转/分钟震荡培养2～3天，得到种子罐菌种液；
33.所述的二级摇瓶培养基配制方法是：称取蔗糖20克、玉米粉15克、淀粉5克、谷氨 酸5克、硝酸铵3克、磷酸二氢钾1克、硫酸镁0.5克、碳酸钙0.5克，加蒸馏水定容至 1000毫升，将配好的培养基分装于锥形瓶中，装料量为锥形瓶容量的1/5～2/5，用棉塞和 牛皮纸扎封瓶口，于120℃高压灭菌90分钟，待温度降至26～30℃以下后使用；
34.(4)种子罐发酵培养
35.将种子罐菌种液接种至装有种子罐发酵培养基的种子罐中，接种量为10～20％，接种 后于23～25℃、罐压50～70千帕、通气量以v/v
·
min比为0.5:1的条件下发酵培养3～4 天，得到发酵罐菌种液；
36.所述的种子罐发酵培养基配制方法是：称取蔗糖25克、玉米粉15克、淀粉5克、谷 氨酸7克、硝酸铵4克、磷酸二氢钾1克、硫酸镁0.5克、碳酸钙0.5克，加蒸馏水定容 至1000毫升，将配好的培养基分装于锥形瓶中，装料量为锥形瓶容量的1/5～2/5，用棉塞 和牛皮纸扎封瓶口，于120℃高压灭菌90分钟，待温度降至26～30℃以下后使用；
37.(5)子实体的培养
38.用移液器抽取10毫升发酵罐菌种液，接种到装有栽培料的保鲜盒或是培养瓶，其中保 鲜盒通过盖子紧闭进行栽培，培养瓶通过塑料布封口栽培；放入恒温箱内在28℃
‑‑
35
℃， 空气相对湿度70％-85％，培养10～15天，出瓶，分离子实体与培养基质；
39.所述的栽培料的配制方法是称取称取葡萄糖20克、蛋白胨5克、硝酸铵3克、磷酸二氢 钾1克、硫酸镁0.5克、碳酸钙0.5克、琼脂20g，加薏仁150-160g，加蒸馏水定容至1000毫升， 将配好的培养基分装于玻璃瓶中，装料量为玻璃瓶容量的1/4，用牛皮纸扎封瓶口，于120℃ 高压灭菌90分钟，待温度降至26～30℃以下后使用。
40.进一步地，所述种子罐的培养基装料系数为60～70％，通入气体为经灭菌、除尘除水处 理的洁净无菌的干燥气体。
41.本发明的有益效果为：
42.1、经长期传代、筛选和驯化获得一株人工培植子实体产量更高、甘露醇、麦角甾醇 等营养成分含量更高的日本棒束孢菌株；
43.2、大幅提升人工培植日本棒束孢的子实体产量，工艺简单，显著降低人工栽培日本 棒束孢子实体的生产成本，能够满足规模化周期性生产的要求；
44.3、制备出的日本棒束孢的子实体营养更丰富，具有大孢虫花独有的功效特性，多糖、 甘露醇、麦角甾醇和天冬氨酸等营养成分含量更高，具有广阔的市场前景；
45.4、公开了薏仁在日本棒束孢的人工培养方面的用途。
附图说明
46.图1为实施例3提供的薏仁加量与日本棒束孢子实体的产出量的关系示意图
具体实施方式
47.下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便 于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本实施例中使用的试剂、物料均为已知产 品，通过购买市售产品获得。
48.实施例1日本棒束孢菌株的筛选
49.本实施例提供的日本棒束孢优良菌株的筛选和稳定繁殖方法为：a、选用同时具备下 列特征条件的子实体：成熟度达到6-8成；橙黄或金黄色；长度6cm以上；无分叉；粗细适 中、直径为3-5mm、；直立；截面圆形；顶端明显膨大。b、不作表面消毒，在无菌操作 环境中的超净工作台上用手术刀将选用的子实体切成上下两截，取上截，再从切开处纵向 切开一个小口，然后徒手从切口处沿子实体纵向将子实体撕开成两边，以露出子实体内部 组织。c、在无菌操作环境条件下，用接种针在撕开的子实体上截中间或中间偏向顶端的地 方，挑取一小块子实体内部组织。d、将挑取的子实体内部组织接种到高效斜面培养基上， 进行培养。e、抽样进行栽培试验，剩余菌种放3～5℃的冰箱中保存f、鉴别菌种生产性能 后，淘汰劣质菌株，保留优良菌株作为生长用种。
50.经过初步筛选，获得10株生产性能较优的日本棒束孢优良菌株zqy001～zqy010。
51.实施例2日本棒束孢子实体的人工培养
52.本实施例采用日本棒束孢菌种zqy001，子实体的人工培养过程包括以下步骤：
53.(1)菌种活化
54.切取1～2块大小为2mm日本棒束孢菌种zqy001的菌块接种到试管母体培养基中进 行菌种活化培养，于23～25℃恒温培养箱中培养5～7天，见到白色大孢虫花菌体，获得 活
zqy010，并采用实施例2提供的日本棒束孢子实体的培养方法进行培养，比较不同日本棒 束孢菌株的子实体产出量，以及子实体中的多糖、甘露醇、麦角甾醇、天冬氨酸含量。
70.其中多糖含量的检测方法为：以7％的接种量将浓度为107个/ml的孢子悬液接入装 液量为20％的液体培养基中，于ph7、27℃和转速150r/min的条件下发酵7d，再用硫酸
‑ꢀ
蒽酮法测定多糖含量。
71.甘露醇含量的检测方法为：取供试品约1g，精密称定，精密加入水25ml，称定重量， 50℃超声处理60min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，离心，取续滤液10ml 至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用流动相溶解并定容至10ml量瓶中，经0.45μm微孔滤膜滤 过，取续滤液进行hplc分析。
72.麦角甾醇含量的检测方法为：精密称取1g样品置于10ml容量瓶加入1mol/l的naoh、 50％甲醇液超声波中混匀后于60℃水浴1hr，然后14000r/min离心20min，取上清液5ml 加5mlchcl3进行萃取，取2ml萃取液，氮气吹干后用1ml甲醇溶解，经0.45μm微孔 滤膜过滤，滤液供hplc分析用，以三氯甲烷为溶剂配制系列浓度的麦角甾醇标准品溶液。
73.天冬氨酸含量的检测方法为：准确称取一定量均匀性好的的试样，放入水解管中，在 水解管内加入6mol/l盐酸10-15ml，含水量高的试样加入等体积的盐酸，加入新蒸馏的苯 酚3-4滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3-5min,再接到真空泵的抽气管上，抽真空(接 近0pa)，然后充入高纯度氮气，再抽真空充氮气，反复三次后，在充氮气状态下封口或 拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在110℃的恒温箱，水解22h后，取出冷却；打开水解管， 将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到50ml容量瓶内用去 离子水定容；吸取绿叶1ml于5ml容量瓶内，用真空干燥器在40-50℃干燥，残留物用 1-2ml水溶解，再干燥，反复进行两次，最后蒸干，用1mlph2.2的缓冲液溶解；准确取 0.2ml混合氨基酸溶液，用ph2.2的缓冲液稀释到5ml；用氨基酸自动分析仪以外标法测 定试样测定氨基酸含量。
74.表1、日本棒束孢菌株zqy001～zqy010的子实体培养情况对比
[0075][0076]
由表1可见，10株生产性能较优的日本棒束孢优良菌株zqy001～zqy010中，zqy001 的子实体产出量明显更高，且以及子实体中的多糖、甘露醇、麦角甾醇、天冬氨酸含量也 具有显著优势，因此优选了日本棒束孢优良菌株zqy001进行菌种保藏并进行后续开发工 作。
[0077]
实施例4薏仁对日本棒束孢子实体培养的影响
[0078]
本实施例采用实施例2提供的日本棒束孢子实体的培养方法进行培养，并同时进行多 组对比例的培养，对比例与其区别是子实体培养的栽培料中不加薏仁，并分别采用小麦、 大米、大豆、蚕蛹、玉米、山药、马铃薯进行替代，考察不同栽培料的日本棒束子实体产 出量，以及子实体中的多糖、甘露醇、麦角甾醇、天冬氨酸含量。其中多糖含量、甘露醇、 麦角甾醇、天冬氨酸含量的检测方法如实施例3所述。具体考察结果如表3所示。
[0079]
表3、不同栽培料对日本棒束孢子实体培养的影响
[0080][0081]
由表2可以看出，与第2组的空白对照相比，当栽培料中添加薏仁时，日本棒束孢的子 实体产出量由8.1g/50g培养基提高至25.3g/50g，同时子实体中的多糖、甘露醇、麦角甾醇、 天冬氨酸都得到明显提升；与第3-9组相比，添加小麦、大米、大豆、蚕蛹、玉米、山药、 马铃薯时，对日本棒束孢的子实体的培养虽然也稍有效果，但效果都不如薏仁，这可能是 因为薏仁的油脂含量较低，且其中的膳食纤维和脂肪酸更容易被日本棒束孢所利用；而大 米、小麦等的多糖纤维含量高，难以被日本棒束孢分解利用；大豆、蚕蛹等油脂含量高， 且脂肪酸种类不利于日本棒束孢的培养。
[0082]
实施例5薏仁的不同加量对子实体培养的影响
[0083]
本实施例采用实施例2提供的日本棒束孢子实体的培养方法进行培养，其中的薏仁添 加比例分别为10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％，即每 50g栽培料中，薏仁的添加量分别为5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g、 10g，考察了薏仁的不同添加比例对日本棒束的子实体产出量，以及子实体中的多糖、甘 露醇、麦角甾醇、天冬氨酸含量。其中多糖含量、甘露醇、麦角甾醇、天冬氨酸含量的检 测方法如实施例3所述。具体考察结果如表3所示，日本棒束孢子实体的产出量与薏仁加 量的关系示意图见图1。
[0084]
表3、栽培料中薏仁的不同加量对日本棒束孢子实体培养的影响
[0085][0086]
由表3可以看出，薏仁的不同加量，对日本棒束孢子实体的培养存在一定的影响，当 薏仁加量从10％增加到16％时，日本棒束孢子实体产出量由11.2g/50g培养基，提高到 25.3g/50g培养基，子实体中的多糖含量、甘露醇、麦角甾醇、天冬氨酸含量也都分别有了 一定程度的提升，但随着薏仁的添加量继续上升，从16％继续增加到20％时，日本棒束孢 子实体产出量却开始出现下降趋势，而且子实体中的多糖含量、甘露醇、麦角甾醇、天冬 氨酸含量也都出现一定程度的下降。可见薏仁的最佳添加比例应为15-16％，最优选为16％， 即8g薏仁/50g栽培料。
[0087]
实施例6日本棒束孢子实体与天然蝉花虫草营养成分对比
[0088]
本实施例采用实施例2获得的日本棒束孢与天然蝉花虫草(购自)进行多糖、甘露 醇、麦角甾醇、天冬氨酸含量对比，中多糖含量、甘露醇、麦角甾醇、天冬氨酸含量的检 测方法如实施例3所述。具体考察结果如表4所示。
[0089]
表4、本棒束孢子实体与天然蝉花虫草营养成分对比
[0090]
序号品种多糖(mg/g)甘露醇(mg/g)麦角甾醇(mg/g)天冬氨酸(％)1日本棒束孢34.56
±
0.7581.9
±
1.120.6256
±
0.03090.042天然蝉花虫草28.5
±
0.9553.6
±
1.160.5743
±
0.0180.02
[0091]
由表4可见，本发明通过人工培养获得的日本棒束孢与天然蝉花虫草相比，其中的多 糖、甘露醇、麦角甾醇、天冬氨酸含量都明显更高，功效成分含量更多，也将更俱保健功 能，市场前景广阔。
[0092]
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发 明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限 定的范围为准。