一种特异性靶向活化肝星状细胞的CAR-T细胞及其制备方法和应用与流程

本发明属于细胞免疫治疗技术领域，涉及一种特异性靶向活化肝星状细胞的car-t细胞及其制备方法和应用。

背景技术：

肝纤维化是肝硬化的前期病变，慢性肝病如脂肪肝、肝炎等都会导致肝纤维化，肝纤维化长期积累有可能发展为肝硬化。在肝脏疾病的早期，细胞外基质的生成与降解处于动态平衡过程，肝纤维化形成伴随着纤维化金属蛋白酶(mmp)生成上调并将过量的细胞外基质水解；随着损伤时间的延长，静息肝星状细胞被激活为活化肝星状细胞，快速增殖的活化肝星状细胞转化为肌成纤维细胞，促进金属蛋白酶组织抑制剂的合成，抑制纤维化金属蛋白酶(mmp)的生成，从而造成纤维溶解受阻、细胞外基质过量沉积和纤维组织异常增生，破坏了肝脏正常组织结构，最终导致肝纤维化。因此从细胞水平看，导致肝纤维化的原因是活化肝星状细胞，而活化肝星状细胞的表面标志物是成纤维细胞活化蛋白(fibroblastactivationprotein，fap)。

肝纤维化的治疗方式包括药物治疗、手术治疗和干细胞移植治疗，尚无特效的治疗药物或方法能够治愈肝纤维化，目前的临床手段主要通过消除原发病因，减轻病变程度。

嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，car)t细胞是指表面表达识别特定抗原并向胞内传递信号的嵌合型受体的t细胞，核心是car分子携带有特异性识别细胞表面抗原的单链抗体(scfv)，从而识别并杀伤表达特定抗原的细胞。目前，car-t细胞疗法主要应用于癌症治疗，在血液瘤和部分实体肿瘤中展现出一定疗效，但是极少用于癌症以外的疾病治疗，鲜有将car-t应用于肝纤维化治疗的报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种特异性靶向活化肝星状细胞的car-t细胞及其制备方法和应用，以fap为靶点设计特异性靶向活化肝星状细胞的car载体，构建用于治疗肝纤维化的car-t细胞。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种特异性靶向活化肝星状细胞的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号传导结构域；

所述抗原结合结构域为抗fap单链抗体。

本发明中，采用抗fap单链抗体作为嵌合抗原受体的抗原结合结构域，使得嵌合抗原受体可以特异性结合表达成纤维细胞活化蛋白(fap)的活化肝星状细胞，实现对活化肝星状细胞的特异性靶向作用。

优选地，所述铰链区包括ch3。

优选地，所述跨膜结构域包括cd8α跨膜区。

优选地，所述信号传导结构域包括cd3ζ。

优选地，所述信号传导结构域还包括4-1bb、cd28胞内区、dap10或ox40中的任意一种或至少两种的组合，优选为4-1bb。

优选地，所述嵌合抗原受体包括抗fap单链抗体、ch3铰链区、cd8α跨膜区、4-1bb和cd3ζ。

优选地，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包括seqidno:1所示的氨基酸序列；

seqidno:1：

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优选地，所述嵌合抗原受体包括seqidno:2所示的氨基酸序列；

seqidno:2：

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第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括第一方面所述的嵌合抗原受体的编码基因。

第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括第二方面所述的核酸分子。

优选地，所述表达载体为含有第二方面所述的核酸分子的慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。

第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒由转染有第三方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳动物细胞制备得到。

第五方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体t细胞，所述嵌合抗原受体t细胞表达第一方面所述的嵌合抗原受体。

本发明中，表达靶向活化肝星状细胞嵌合抗原受体的t细胞，利用嵌合抗原受体对活化肝星状细胞标志物fap的特异性结合作用，靶向结合活化肝星状细胞，发挥t细胞的杀伤功能，实现了对活化肝星状细胞的杀伤作用。

优选地，所述嵌合抗原受体t细胞的基因组中整合有第二方面所述的核酸分子。

优选地，所述嵌合抗原受体t细胞包括第三方面所述的表达载体和/或第四方面所述的重组慢病毒。

第六方面，本发明提供了一种第五方面所述的嵌合抗原受体t细胞的制备方法，所述制备方法包括将第三方面所述的表达载体和/或第四方面所述的重组慢病毒导入t细胞的步骤。

第七方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第五方面所述的嵌合抗原受体t细胞。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第八方面，本发明提供了第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的重组慢病毒、第五方面所述的嵌合抗原受体t细胞或第七方面所述的药物组合物在制备肝病治疗药物中的应用。

优选地，所述肝病包括肝纤维化和/或肝硬化。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的嵌合抗原受体采用抗fap单链抗体作为抗原结合结构域，通过结合活化肝星状细胞表面的fap标志物，实现了对活化肝星状细胞的特异性靶向作用；

(2)本发明的表达嵌合抗原受体的t细胞在不同的效靶比下对fap阳性细胞均具有显著的杀伤作用，为临床治疗肝纤维化、肝硬化和非肿瘤疾病提供了新思路。

附图说明

图1为anti-fapcar的结构示意图；

图2为anti-fapcar-t细胞杀伤过表达fap的a549细胞系的结果；

图3为anti-fapcar-t细胞杀伤野生型a549细胞系的结果；

图4为免疫荧光验证肝星状细胞系lx2表达fap；

图5为anti-fapcar-t细胞杀伤肝星状细胞系lx2的结果。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1构建anti-fapcar慢病毒载体

本实施例采用抗fap单链抗体(pct/us10/02660)作为car分子的抗原结合结构域，与ch3铰链区、cd8α跨膜区、4-1bb和cd3ζ结合，设计anti-fapcar(seqidno:2)，示意图如图1所示；

全基因合成anti-fapcar编码基因，通过pcr、酶切、重组等步骤将合成的car分子编码基因克隆至慢病毒载体中，导入宿主菌，保存于甘油中；

取100μl甘油菌于50ml离心管中，加入25ml新鲜lb培养基，于37℃、220rpm摇床中培养16小时，然后用质粒小提中量试剂盒提取质粒，取少量质粒交于生工生物工程(上海)股份有限公司测序，检验其序列是否与构建的目的图谱一致，其余质粒保存于-20℃。

实施例2包装anti-fapcar慢病毒和滴度检测

利用pei转染的方式，将提取的anti-fapcar慢病毒载体和辅助质粒与pei混合均匀，常温孵育20min后，加入到培养于10cm培养皿中的密度为70％～80％的293t细胞中(培养基为含1％fbs的dmem培养基)；12小时后换液为新鲜的含1％fbs的dmem培养基，继续培养24小时收集上清，置于4℃保存；补加培养基继续培养，连续收集3天上清，用0.45μm过滤器过滤，保存待用。

分别取过滤后的病毒溶液25μl、50μl、100μl于48孔板，再加入1×10⁵个jurkat细胞(用300μl含10％fbs的1640培养基重悬)，置于37℃、5％co2培养箱中培养48小时，用流式细胞术检测gfp阳性比例，gfp阳性的细胞为转染成功的细胞，计算出病毒溶液的滴度，即1ml病毒感染细胞的数量。

实施例3制备anti-fapcar-t细胞

(1)利用ficoll密度梯度法从全血中分离外周血单个核细胞(pbmc)，经红细胞裂解液裂解去除红细胞后，再利用macspan-t磁珠分选出t细胞；

(2)分选出来的t细胞用培养基(t551培养基+5％fbs+100u/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素+1000iu/mlil-2)稀释至细胞浓度为1×10⁷个/ml，待用；

(3)用t细胞激活试剂盒transact(加拿大stemcell)激活t细胞，具体为向1×10⁶个t细胞中加入10μltransact，使t细胞终浓度为1×10⁶个/ml/cm²，置于37℃、5％co2培养箱培养激活36小时；

(4)t细胞激活36小时后，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬，加入anti-fapcar慢病毒(病毒加入量为moi＝10)、8μg/mlpolybrene和1000iu/mlil-2，置于37℃、5％co2培养箱培养24小时；300g离心5min，去上清，用含1000iu/mlil-2的新鲜培养基重悬，即得过表达anti-fapcar分子的t细胞；

另取一定已激活的t细胞，正常培养扩增，作为阴性对照t细胞(negativecontrolt，nct)；

(5)将car-t细胞密度维持在1×10⁶个/ml左右，每2～3天进行一次半量换液，两周后，car-t细胞扩增了50～100倍，流式检测gfp阳性细胞比例，即为转染成功的anti-fapcar-t细胞的比例。

实施例4anti-fapcar-t细胞体外杀伤肝星状细胞系

(1)将实施例3制备的anti-fapcar-t或nct分别与野生型a549细胞、过表达fap的a549细胞以及fap阳性肝星状细胞系lx2(肿瘤细胞均带荧光素酶)混合，效靶比(e:t)分别为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4，加入到96孔细胞培养板中，每组设3个复孔，置于37℃、5％co2培养箱共培养24小时；

(2)24小时后，向96孔细胞培养板中加入100μl/孔荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定rlu(relativelightunit)，测定时间为0.1秒，荧光素酶(luciferase)定量杀伤效率评估方法的杀伤比例计算公式为：

100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)

结果如图2、图3、图4和图5所示，说明anti-fapcar-t细胞可以特异性杀伤fap阳性细胞，效果显著，安全性好。

综上所述，本发明的嵌合抗原受体具有特异性结合活化肝星状细胞表面的fap标志物的能力，表达所述嵌合抗原受体的t细胞对活化肝星状细胞具有特异性靶向杀伤作用，拓展了细胞免疫疗法的应用范围，为临床治疗肝纤维化、肝硬化和非肿瘤疾病提供了新思路。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

sequencelisting

<110>湖南昭泰生物医药有限公司

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