抗菌肽Scybaumancin

9.本发明的拟穴青蟹抗菌肽scybaumancin
105
‑
127
由23个氨基酸组成，分子量为2511.06道尔顿，含2个赖氨酸、2个精氨酸和2个半胱氨酸残基，c端酰胺化修饰(
‑
nh2)(即第23位的组氨酸his经
‑
nh2修饰)。heliquest预测该抗菌肽电荷数为+4，疏水性为0.471。
10.所述抗菌肽scybaumancin
105
‑
127
可以以固体(如粉末等)、液体(如水溶液等)等多种形式应用。
11.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
12.一种抗菌肽scybaumancin
105
‑
127
在制备抗菌剂中的应用。
13.本发明提供的一种新型抗菌肽scybaumancin
105
‑
127
，作为一种新型的抗菌活性物质，可以用于制备抗菌剂，作为抗菌剂中的有效成分，用于抑制或杀灭革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌。
14.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
15.一种抗菌剂，所述抗菌剂包括氨基酸序列如seq id no.1所示的新型抗菌肽scybaumancin
105
‑
127
。
16.所述抗菌剂可抑制或杀灭革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌中的至少一种。
17.本发明所述的革兰氏阴性菌包括鲍曼不动杆菌、耐药鲍曼不动杆菌、福氏志贺氏菌、大肠埃希菌、耐药大肠埃希菌或铜绿假单胞菌中的至少一种；所述的真菌包括新型隐球菌；所述的革兰氏阳性菌包括单核细胞增生李斯特氏菌、屎肠球菌、耐药屎肠球菌或痤疮丙酸杆菌中的至少一种。
18.本发明所述的抗菌剂可以是药物形式的抗菌剂，即作为抗菌药物，也可以是非药物形式的抗菌剂，例如作为消毒产品，或作为纺织品、塑料等产品的添加剂等。
19.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：
20.一种抗菌肽scybaumancin
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‑
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在制备食品添加剂中的应用。
21.本发明提供的一种新型抗菌肽scybaumancin
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‑
127
，安全性好，可以作为一种新型的食品添加剂，抑制和/或杀灭食源性污染微生物，尤其对食源性污染的单核细胞增生李斯特氏菌具有较强的杀菌活性。
22.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之五是：
23.一种食品添加剂，所述食品添加剂包括氨基酸序列如seq id no.1所示的抗菌肽scybaumancin
105
‑
127
。所述食品添加剂尤其适合用于抑制和/或杀灭食源性污染的单核细胞增生李斯特氏菌。
24.本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
25.本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
26.本发明所述“大约”、“约”或“左右”等指的是所述范围或数值的
±
20％范围内。
27.本发明中，除有特别说明外，％均为质量百分比。
28.本技术方案与

背景技术：
相比，它具有如下优点：
29.1.本发明的拟穴青蟹抗菌肽scybaumancin
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‑
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水溶性好、抗菌谱广、抗菌活性高且安全无毒，是一条具有广阔应用前景的阳离子短肽。
30.2.本发明的拟穴青蟹抗菌肽scybaumancin
105
‑
127
对单核细胞增生李斯特氏菌、屎肠球菌、福氏志贺氏菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、新型隐球菌及痤疮丙酸
杆菌具有较强的抗菌活性，对hek
‑
293t、拟穴青蟹血细胞、epc细胞无细胞毒性。
附图说明
31.图1为抗菌肽scybaumancin
105
‑
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对鲍曼不动杆菌和新型隐球菌的杀菌动力学曲线，横坐标为时间(min)，纵坐标为cfu(菌落形成单位)/ml。
32.图2为抗菌肽scybaumancin
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‑
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处理鲍曼不动杆菌非临床耐药菌株cgmcc 1.6769和临床耐药菌株qz18050引起的形态结构变化。其中，a为鲍曼不动杆菌非临床耐药菌株，b为鲍曼不动杆菌非临床耐药菌株+6μm scybaumancin
105
‑
127
，c为鲍曼不动杆菌临床耐药菌株，d为鲍曼不动杆菌临床耐药菌株+12μm scybaumancin
105
‑
127
。
33.图3为mts法检测拟穴青蟹抗菌肽scybaumancin
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‑
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对hek
‑
293t细胞、拟穴青蟹血细胞(hemocytes)和epc细胞的细胞毒性实验；横坐标为scybaumancin
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‑
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蛋白浓度(μm)，纵坐标为细胞存活率(cell viability)(％)。
具体实施方式
34.下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
35.实施例1：拟穴青蟹抗菌肽scybaumancin
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‑
127
36.本实施例的一种拟穴青蟹抗菌肽scybaumancin
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的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体为：
37.v
‑
v
‑
t
‑
c
‑
r
‑
l
‑
a
‑
h
‑
m
‑
a
‑
l
‑
k
‑
s
‑
a
‑
k
‑
s
‑
s
‑
r
‑
s
‑
l
‑
l
‑
c
‑
h
‑
nh2，c端酰胺化修饰(
‑
nh2)。
38.本实施例委托南京金斯瑞有限公司以固相合成方法合成获得纯度达95％以上的拟穴青蟹抗菌肽scybaumancin
105
‑
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，并提供多肽分子量、hplc等检测信息，用helixquest预测其电荷和疏水性，其他理化参数均用protparam预测，拟穴青蟹抗菌肽scybaumancin
105
‑
127
理化参数如表1所示。
39.表1拟穴青蟹抗菌肽scybaumancin
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‑
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理化参数
[0040][0041]
实施例2：scybaumancin
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‑
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最小杀菌浓度(mbc：minimum bactericidal concentration)的测定
[0042]
1、本实施例涉及到的菌株有：单核细胞增生李斯特氏菌(listeria monocytogenes)、屎肠球菌(enterococcus faecium)、福氏志贺氏菌(shigella flexneri)、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)、大肠埃希菌(escherichia coli)、
铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、新型隐球菌(cryptococcus neoformans)购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心；痤疮丙酸杆菌(propionibacterium acnes)购自广东省微生物菌种保藏中心；临床耐药菌qz18080、qz18081、qz18050、qz18055、qz18109、qz18110来源于福建医科大学附属第二医院检验科。
[0043]
2、具体方法如下：
[0044]
(1)活化菌种，将保种菌株划线于营养肉汤(nb：nutrient broth)平板，37℃培养箱中静置培养(痤疮丙酸杆菌用脑心浸液(bhi：brain heart immersion)+1％葡萄糖培养，并置于厌氧袋中培养；真菌划线于ypd平板，28℃培养箱中静置培养。)
[0045]
(2)待菌落生长至合适大小，随机挑取3～5个单克隆于nb液体培养基中，37℃摇床，180rpm培养至对数期(痤疮丙酸杆菌挑克隆至bhi+1％葡萄糖培养，培养基液面上方加液体石蜡封顶；真菌挑克隆至ypd液体培养基，28℃摇床，230rpm培养至对数期)。
[0046]
(3)4000g，离心3min收集细菌，最后用10mm磷酸钠缓冲液(napb，ph＝7.4)与mh液体培养基混合液稀释细菌(napb:mh＝3:2)，使得菌体的最终浓度约为5
×
105cfu/ml(真菌抗菌条件为napb:ypd＝3:2，菌体量约为5
×
104cfu/ml)。
[0047]
(4)将已合成的scybaumancin
105
‑
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粉末溶于无菌milli
‑
q水，用0.22μm滤膜过滤，倍比稀释蛋白浓度至6μm、12μm、24μm、48μm、96μm、192μm；
[0048]
(5)在96孔细胞培养板上，每种待测菌设置空白对照组、阴性对照组和待测实验组，每组设置三个平行：
[0049]
a空白对照组：50μl待测蛋白样品和50μl稀释菌液的培养基
[0050]
b阴性对照组：50μl无菌milli
‑
q水和50μl菌悬液
[0051]
c待测实验组：50μl待测蛋白样品和50μl菌悬液
[0052]
将96孔细胞培养板置于37℃或28℃培养箱中，培养24h后吹打混匀取2μl点板至nb或ypd平板，于37℃或28℃培养，观察并记录mbc结果。
[0053]
3、拟穴青蟹抗菌肽scybaumancin
105
‑
127
最小杀菌浓度(mbc)观察结果如表2所示。
[0054]
表2拟穴青蟹抗菌肽scybaumancin
105
‑
127
的抗菌活性
[0055][0056]
注：mbc：最小杀菌浓度(μm)，用a～b表示。a：平板可见菌落生长的最高蛋白浓度；b：平板未见菌落生长的最低蛋白浓度
[0057]
实施例3：scybaumancin
105
‑
127
杀菌动力学曲线
[0058]
1、涉及到的菌株有：鲍曼不动杆菌cgmcc 1.6769和新型隐球菌cgmcc 2.1563。
[0059]
2、具体方法如下：
[0060]
抗菌实验方法同最小杀菌浓度的测定一致，抗菌肽和细菌共孵一定时间后，不同时间点取10μl共孵的混合液至490μl pbs，充分混匀后取50μl稀释液涂nb平板，如果预实验涂板的菌落计数<50个克隆，则取25μl共孵的混合液直接涂板，37℃培养箱静置培养12h后，进行菌落计数(真菌共孵的混合液用pbs稀释10倍后，涂ypd平板，置于28℃培养箱静置培养48h后，进行菌落计数)。
[0061]
3、拟穴青蟹抗菌肽scybaumancin
105
‑
127
对鲍曼不动杆菌和新型隐球菌的杀菌动力学曲线如图1所示。
[0062]
实施例4：扫描电镜观察scybaumancin
105
‑
127
处理后鲍曼不动杆菌的形态结构变化
[0063]
1、涉及到的菌株有：
[0064]
鲍曼不动杆菌的非耐药菌株cgmcc 1.6769和临床耐药菌株qz18050。
[0065]
2、具体实验方法如下：
[0066]
(1)扫描电镜样品制备
[0067]
活化菌种，待克隆长至合适大小，随机挑取3～5个克隆至nb液体培养基，摇至对数生长期，测od
600
，离心去上清，用mh培养基重悬菌体，调至od为0.1，取500μl菌液+等体积抗菌肽，37℃共孵30min后，离心去上清，用pbs洗一次后收集菌体。
[0068]
(2)固定、清洗、滴片：
[0069]
用300μl 2.5％戊二醛重悬收集的菌体，4℃冰箱固定1.5h或更长时间。
[0070]
固定后的菌体用pbs洗三次(20min/次)后，制成高浓度悬液，滴至已切割好的载玻片上，黏附30min，用滤纸吸干后进行乙醇梯度脱水。
[0071]
(3)脱水：
[0072]
30％乙醇5min；50％乙醇5min；70％乙醇10min，可4℃冰箱过夜。
[0073]
以上操作在冰盒里进行。
[0074]
80％乙醇10min；95％乙醇15min；100％乙醇15min
×
2次。
[0075]
(4)临界点干燥后，10ma电流，喷金60s；扫描电镜观察并拍片记录。
[0076]
3、拟穴青蟹抗菌肽scybaumancin
105
‑
127
对鲍曼不动杆菌的非耐药菌cgmcc 1.6769和临床耐药菌株qz18050形态结构变化如图2所示。
[0077]
实施例5：mts法检测和评价scybaumancin
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‑
127
的细胞毒性
[0078]
1、选取人肾上皮细胞(hek
‑
293t)、拟穴青蟹血细胞(hemocytes)、鲤鱼上皮细胞(epc)细胞，横坐标为scybaumancin
105
‑
127
蛋白浓度(μm)，纵坐标为细胞存活率(％)，对拟穴青蟹抗菌肽scybaumancin
105
‑
127
细胞毒性进行测定。
[0079]
2、具体方法如下：
[0080]
(1)收集生长状态良好的细胞，用对应的细胞培养基(hek
‑
293t、epc用dmem+10％fbs；hemocytes用l15+5％fbs+1.2％nacl)稀释细胞浓度至103～104个/ml，在96孔细胞培养板中每孔加入上述细胞悬液100μl，hek
‑
293t置于37℃细胞培养箱，5％co2；epc和hemocytes置于28℃细胞培养箱，5％co2条件下静置培养。
[0081]
(2)小心吸出50μl培养基，加入含有不同浓度scybaumancin
105
‑
127
的相应培养基，置于相应的细胞条件下静置培养24h。
[0082]
(3)加入20μl mts
‑
pms混合溶液，孵育4h后，使用酶标仪测得od
492
值，评价scybaumancin
105
‑
127
的细胞毒性。
[0083]
3、结果如图3。在浓度0～96μm范围内，scybaumancin
105
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127
对hek
‑
293t、拟穴青蟹血细胞、epc细胞无细胞毒性。
[0084]
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。