一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌及其构建方法和应用

本发明属于基因工程领域。具体涉及一株含突变的纳豆激酶重组基因的工程菌的构建及在真核系统中表达。

本发明中所称的一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌命名为komagataellaphaffiilnf012，已于2020年08月06日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmccno.20498。

背景技术：

纳豆激酶(nattokinase，nk)是一种由枯草芽孢杆菌(bacillussubtilisvarnatto)产生的碱性丝氨酸蛋白酶，经研究发现，纳豆激酶具有很好的溶解纤维蛋白(血栓的主要成分)能力。它的溶栓效果高于同类溶栓药物，且溶栓活性是纤溶酶的4倍。纳豆激酶包含三个部分，共381个氨基酸，从n端开始第1至第29个氨基酸构成信号肽，主要作用为介导蛋白质胞外分泌；第30至第106个氨基酸构成前导肽，主要起到帮助蛋白质折叠成正确的空间构象；剩余的275个氨基酸折叠构成具有活性的成熟肽。纳豆激酶具有催化三联体即asp32、his64、ser221，底物结合部位在serl25、leul26和glyl27。近年来，研究人员对纳豆激酶的溶栓作用机理有了进一步的了解：优球蛋白是一种难以溶解的血浆蛋白质，纳豆激酶能够结合到优球蛋白的表面，发挥催化作用，促进其溶解，间接的促进了纤维蛋白原的降解；内源纤溶酶原激活剂t-pa是一种血管内壁细胞所分泌出的能够激发纤溶酶活性的生理性激动剂，纳豆激酶能够与血管内壁细胞作用，诱导t-pa的产生，加强纤维蛋白的降解效果；纳豆激酶可激活尿激酶原生成尿激酶，激活后的尿激酶可以溶解血栓，和纳豆激酶共同作用于血栓溶解；纤溶酶原激活剂的抑制剂(pai-1)能够使t-pa失去活性并抑制其产生，纳豆激酶能够直接作用于pai-1使其降解，保持t-pa的活性，使血栓溶解。目前市面纳豆激酶多用于保健类产品。纳豆激酶与其他同类的溶栓药物产品相比，如尿激酶、链激酶等产品同样具有安全性高、生产成本低等的优势，因而在市场上具有强大的竞争力和市场前景。鉴于纳豆激酶功效及发展前景，急需构建一株全新的纳豆激酶工程表达菌。

技术实现要素：

本发明的目的是构建一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌komagataellaphaffiilnf012及在真核系统中表达。

本发明采用的技术方案是：一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌，所述含突变纳豆激酶重组基因的工程菌命名为komagataellaphaffiilnf012，于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmccno.20498。

一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1)获得纳豆激酶前导肽-成熟肽基因片段nkt：以枯草芽孢杆菌dna为模板，以primer1和primer2为引物，通过pcr方法扩增出nkt基因片段；

nkt基因片段引物序列为：

primer1：5’-gcggaattcggccggaaaaagcagtac-3’

primer2：5’-gcgctcgagttgtgcagctgcttgtac-3

2)获得nkt194突变片段：以nkt基因片段为模板，primer1和primer3为引物通过重叠延伸pcr扩增突变的上游片段nkt194f；以nkt基因片段为模板，primer4和primer2为引物通过重叠延伸pcr扩增下游片段nkt194r，通过t4连接酶，16℃过夜连接，将nkt194f和nkt194r连接合成nkt194突变片段；

突变的上游片段nkt194f引物序列为：

primer1：5’-gcggaattcggccggaaaaagcagtac-3’

primer3：5’-agccattacatcaagctctggtcctacgctggagaatg-3’

下游片段nkt194r引物序列为：

primer4：5’-cattctccagcgtaggtccagagcttgatgtaatggct-3’

primer2：5’-gcgctcgagttgtgcagctgcttgtac-3’

3)密码子优化：根据毕赤酵母x33密码子偏爱性对nkt194突变片段进行优化和合成，获得优化的基因片段nkt2；

4)将优化的基因片段nkt2与表达质粒pgapzα-a分别在酶切位点ecorⅰ和xhoⅰ进行双酶切，然后t4连接酶连接，构建重组载体pgapzα-a-nkt2；

5)将重组载体pgapzα-a-nkt2转化到毕赤酵母x33中，获得含突变纳豆激酶重组基因的工程菌，命名为komagataellaphaffiilnf012。

进一步的，上述的构建方法，步骤1)中，pcr方法扩增的条件为：

pcr反应体系：primer12μl，primer22μl，2×estaqmastermix25μl；枯草芽孢杆菌dna1μl，ddh2o补至总体系50μl；

pcr反应条件：94℃预变性2min；94℃30s；53℃30s；72℃30s；30cycles；72℃延伸7min；4℃10min。

进一步的，上述的构建方法，步骤2)中，重叠延伸pcr扩增的条件为：

pcr反应体系：primer1(或primer4)2μl，primer3(或primer2)2μl，2×estaqmastermix25μl，nkt基因片段1μl，ddh2o补至总体系50μl；

pcr反应条件：94℃预变性2min；94℃30s；53℃30s；72℃30s；30cycles；72℃延伸7min；4℃10min。

进一步的，上述的构建方法，步骤3)中，所述优化是：保持nkt194突变片段的氨基酸序列不变的前提下，根据毕赤酵母x33密码子偏爱性对nkt194突变片段基因进行密码子优化。

进一步的，上述的构建方法，步骤5)中，将重组载体pgapzα-a-nkt2进行线性化后，再通过电转化法转化到毕赤酵母x33中。

更进一步的，上述的构建方法，线性化体系为：pgapzα-a-nkt21μg，10×quickcutbuffer2μl，quickcutenzymeavrⅱ1μl，ddh2o补至总体系20μl；反应条件为温度37℃，酶切时间为10min-15min。

本发明提供的含突变纳豆激酶重组基因的工程菌在表达纳豆激酶中的应用。

进一步的，方法如下：筛选含突变纳豆激酶重组基因的工程菌的阳性菌落，划线ypd固体培养基，28℃培养3-4d，挑取单菌落接种于100ml含zeocin的bmgy培养基中，在温度28℃，摇床转速220rmp/min下摇床培养，每培养24h向培养基中加入相对于培养基体积1％的甲醇溶液，培养4d后冷冻离心收集蛋白上清液，所得蛋白命名为纳豆激酶蛋白rnkt2。

进一步的，所述纳豆激酶蛋白rnkt2氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明的有益效果是：

1、本发明中，以枯草芽孢杆菌基因组为模板，通过pcr方法扩增出nkt基因片段，然后以nkt基因片段为模板，通过重叠延伸pcr扩增并连接成nkt194突变片段，其大小为1050bp，符合纳豆激酶前导肽+成熟肽的dna片段大小。根据毕赤酵母x33密码子偏爱性对纳豆激酶基因片段进行优化，优化后合成以及重组载体。

2、本发明构建了一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌lnf012及成功在真核系统中表达。采用基因工程技术，通过重叠延伸pcr扩增出nkt194突变片段，其大小为1050bp。根据毕赤酵母x33密码子偏爱性优化合成nkt2基因片段，并将其连接到真核表达载体构建重组载体pgapzα-a-nkt2，重组载体转化毕赤酵母x33得到重组菌株。使得原核表达蛋白纳豆激酶能够在真核体系中进行高效表达，表达出的纳豆激酶具有一定的热稳定性。

3、本发明构建的纳豆激酶高效表达菌株，纳豆激酶表达量达到4.33μg/μl，活性达到223.75iu/ml(按照尿激酶活性检测方法测定)与同期的原核表达纳豆激酶相比，更高产、高效。能够为今后纳豆激酶大规模的应用奠定基础。为探究纳豆激酶在心血管疾病中的作用机制提供了工具，并为开发预防心血管疾病药物奠定基础。

附图说明

komagataellaphaffiilnf012，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：cgmcc，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101。保藏日期为2020年08月06日，保藏编号为cgmccno.20498。

图1是nkt片段pcr结果。

其中，m：marker；0：阴性对照；1：nktpcr产物。

图2是重叠延伸pcr扩增获得nkt194突变片段。

其中，m：marker；3：nkt194f片段；4：nkt194r片段。

图3是nkt194突变片段与blast比对结果。

图4是重组载体pgapzα-a-nkt2的电泳图。

其中，m：marker；1：重组载体pgapzα-a-nkt2；2：双酶切nkt2和质粒剩余片段。

图5是重组载体pgapzα-a-nkt2线性化图谱。

其中，m：marker；1：重组载体pgapzα-a-nkt2线性化条带；2：完整重组载体pgapzα-a-nkt2。

图6是rnkt2的sds-page分析图谱。

其中，m：marker；1：空白对照；2：rnkt2。(rnkt2表达包括α-factorsignalsequence，nkt2，mycepitope以及polyhistidinetag，rnkt2大小为50kd)

图7是rnkt2活性图谱。

其中，1：阳性对照；2：rnkt2水解纤维蛋白原形成透明圈。

具体实施方式

实施例

构建一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌及在真核系统中表达，步骤如下：

1、反复冻融法提取枯草芽孢杆菌dna：

将枯草芽孢杆菌在lb平板培养基上划线过夜培养。挑取单菌落，接种于10mllb液体培养基，180rpm37℃过夜培养。取1ml菌体，100℃水浴10min，之后置于-80℃冰箱10min。重复两次。6000rpm离心5min，取上清液，得到枯草芽孢杆菌dna。

2、获得纳豆激酶前导肽-成熟肽基因片段nkt：

通过对纳豆激酶nkt基因序列比对，分别设计引入酶切位点ecori(gaattc)的primer1以及引入酶切位点xhoi(ctcgag)的primer2。以枯草芽孢杆菌dna为模板，以primer1和primer2为引物，通过pcr方法扩增出nkt基因片段。

nkt基因片段引物：

primer1：5’-gcggaattcggccggaaaaagcagtac-3’

primer2：5’-gcgctcgagttgtgcagctgcttgtac-3

pcr反应体系(50μl)：

pcr反应条件：94℃预变性2min；94℃30s；53℃30s；72℃30s；30cycles；72℃延伸7min；4℃10min。

将pcr产物按照上海生工股份有限公司生产的pcr产物凝胶回收试剂盒提供的说明书步骤进行操作，所得产物于-20℃保存或直接用于后续实验。

将pcr产物经电泳检测，结果如图1所示，由图1可见，通过pcr方法获得的nkt基因片段，大小为1050bp，符合纳豆激酶前导肽-成熟肽nkt基因序列，并以其为模板获得突变片段nkt194。

3、获得nkt194突变片段：

以nkt基因片段为模板，通过重叠延伸pcr扩增和连接合成nkt194突变片段。根据纳豆激酶nkt基因序列分别设计引物，并分别引入酶切位点ecori(gaattc)和xhoi(ctcgag)。分别扩增突变的上游片段nkt194f和下游片段nkt194r。

以nkt基因片段为模板，primer1和primer3为引物通过重叠延伸pcr扩增突变的上游片段nkt194f；以nkt基因片段为模板，primer4和primer2为引物通过重叠延伸pcr扩增下游片段nkt194r，通过t4连接酶，16℃过夜连接，将nkt194f和nkt194r连接合成nkt194突变片段。

突变的上游片段nkt194f引物：

primer1：5’-gcggaattcggccggaaaaagcagtac-3’

primer3：5’-agccattacatcaagctctggtcctacgctggagaatg-3’

下游片段nkt194r引物：

primer4：5’-cattctccagcgtaggtccagagcttgatgtaatggct-3’

primer2：5’-gcgctcgagttgtgcagctgcttgtac-3’

pcr反应体系(50μl)：

pcr反应条件：94℃预变性2min；94℃30s；53℃30s；72℃30s；30cycles；72℃延伸7min；4℃10min。

将pcr产物按照上海生工股份有限公司生产的pcr产物凝胶回收试剂盒提供的说明书步骤进行操作，所得产物与-20℃保存或直接用于后续实验。

将pcr产物分别经电泳检测，结果如图2所示，由图2可见，分别获得nkt194上游和下游突变片段，大小分别为810bp和240bp。确定pcr结果成功。

通过t4连接酶过夜连接，获得nkt194突变片段。将所获得的nkt194突变片段的基因序列与blast比对，结果如图3所示，在846位由t突变为a。证明成功获得nkt194突变片段。

4、密码子优化

将nkt194突变片段和表达质粒pgapzα-a分别在酶切位点ecorⅰ和xhoⅰ进行双酶切，然后t4连接酶连接，构建重组载体pgapzα-a-nkt194。将重组载体pgapzα-a-nkt194送到武汉金开瑞生物工程有限公司，在保持nkt194突变片段的氨基酸序列不变的前提下，将nkt194根据毕赤酵母x33密码子偏爱性对nkt194突变片段基因进行密码子优化和合成，获得优化的基因片段，命名为nkt2。

经武汉金开瑞生物工程有限公司检测，优化合成后的nkt2基因序列如seqidno.1所示。

5、构建重组载体pgapzα-a-nkt2

将nkt2和表达质粒pgapzα-a分别在酶切位点ecorⅰ和xhoⅰ进行双酶切，然后t4连接酶连接，构建重组载体pgapzα-a-nkt2。

经电泳检测，结果如图4所示，由图4可见，经过酶切位点ecorⅰ和xhoⅰ进行双酶切后，切下的片段大小为1070bp与nkt2片段大小一致。证明重组载体pgapzα-a-nkt2构建成功。

6、转化

将重组载体pgapzα-a-nkt2进行线性化，再电转化到毕赤酵母x33中，获得含突变纳豆激酶重组基因的工程菌，具体为：

将重组载体pgapzα-a-nkt2进行线性化：

线性化体系为(20μl)：

反应条件为：温度37℃，酶切时间为10min-15min。

取3-5μg线性化完成的重组载体pgapzα-a-nkt2，加入到80μl毕赤酵母x33感受态细胞中，在冰上将二者混匀；然后将混合物加到转化电极杯的底部，将电击杯放到冰上冰置大约5min，之后进行电转；电击完成产物加入1ml1m山梨醇溶液重悬混合物，将电击杯中混合物转移至灭菌的ep管中，随后加入500μl灭菌的ypd液体培养基；将ep管放入摇床震荡培养，培养后6000rpm/min离心5min，吸取上清液，获得含突变纳豆激酶重组基因的工程菌，命名为komagataellaphaffiilnf012。剩余上清液用移液枪将菌体吹打混匀后涂布在含zeocin的ypd固体培养基，直至平板上无明显肉眼可见水迹。

图5是重组载体pgapzα-a-nkt2线性化图谱。为了将重组质粒转入毕赤酵母x33中，需将重组质粒进行线性化。由图5可见，重组质粒线性化成功。

7、含突变纳豆激酶重组基因的工程菌表达纳豆激酶：

将pcr验证成功的阳性菌落重新划线ypd固体培养基，28℃培养3-4d。挑取平板上的单菌落接种于100ml含zeocin的bmgy培养基中，在温度为28℃，摇床转速220rmp/min下摇床培养；每培养24h向培养基中加入相对于培养基体积1％的甲醇溶液。培养4d后冷冻离心，收集蛋白上清液，即为纳豆激酶蛋白，命名为纳豆激酶rnkt2。

经武汉金开瑞生物工程有限公司检测，纳豆激酶rnkt2氨基酸序列如seqidno.2所示。

图6是rnkt2的sds-page分析图谱。重组质粒pgapzα-a-nkt2在真核宿主毕赤酵母x33中表达，由图6可见，表达出的蛋白大小为50kd。

8、测定rnkt2表达量及活性：

rnkt2为可溶性蛋白。

利用bca蛋白试剂盒测定rnkt2表达量，纳豆激酶rnkt2表达量达到4.33μg/μl。

利用纤维蛋白平板法测定rnkt2活性，结果如图7所示，由图7可见，纳豆激酶rnkt2活性达到223.75iu/ml(按照尿激酶活性检测方法测定)。

<110>辽宁大学

<120>一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌及其构建方法和应用

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