Crbn基因在构建GSPT1敏感模型中的用途

本发明涉及生物
技术领域：
，特别是涉及crbn基因在构建gspt1敏感模型中的用途。
背景技术：
：免疫调节药物(imids)，包括沙利度胺(thalidomide)，来那度胺(lenalidomide)，和泊马度胺(pomalidomide)等。thalidomide最初于1957年上市，当时被人们称为“反应停”，用于治疗女性怀孕早期的呕吐。但由于它严重的致畸性，导致大量缺陷儿的出生，自1961年起，反应停被禁止作为孕妇止吐药物使用，但有关thalidomide的研究工作并未停止，特别是它的抗肿瘤作用日益引起广泛关注。2006起，美国fda陆续批准了imids用于多发性骨髓瘤等疾病的临床治疗。2014年后，imids的作用机制被解开，这类化合物能够增强泛素连接酶crl4(crbn)对血细胞生存依赖蛋白的泛素化降解，因此被形象地称之为分子胶水。随后一系列劫持crbn的分子胶水被陆续开发，比较有代表性的是2016年，celgene公司的研发团队在nature上报导的一个新的imids类化合物cc-885，能够促进crl4(crbn)对新的底物翻译终止因子gspt1的泛素化降解而杀死多种血液瘤和实体瘤细胞。gspt1，又名erf3，当翻译遇到终止密码子时，erf1-erf3-gtp复合物会占据核糖体的asite。gtp水解之后，erf3和gdp从复合物上解离，而留在核糖体上的erf1构象上发生了巨大的变化，最终核糖体两个亚基60s和40s发生解离，蛋白翻译终止。gspt1是细胞生存必须的蛋白，当其缺失时，处于增殖状态的细胞会因为细胞内产生大量错误的蛋白而引发细胞内压力最终走向凋亡。目前已有gspt1的降解剂进入临床实验。cc-885乃至其它gspt1降解剂能否通过降解gspt1而抑制肿瘤细胞的生长，进而成为抗肿瘤药物，值得深入研究。但目前尚缺乏研究cc-885等gspt1降解剂的小鼠模型。imids促进底物降解过程中，首先形成crbn-imids-cc-885三元复合物。小鼠与人的crbn有97％以上的同源率，但在imids结合区域有3个碱基不同，致使imids不能促进小鼠野生型crbn对底物的降解。这也是最初反应停在小鼠体内没有反应，而对人有强烈致畸作用的原因。研究imids的毒副作用需要合适的人源化小鼠模型。cc-885在促进gspt1的泛素化降解的过程中，形成了crbn-cc885-gspt1三元复合物，其中crbn的e(谷氨酸)377位点是关键位点。实验表明将crbn的e377位点突变成v(缬氨酸)，则cc-885不能引起gspt1的泛素化降解。小鼠的crbn对应于人的crbne377位点的氨基酸是v380，致使小鼠的crbn不能对cc-885起反应，野生型小鼠是不能用来研究cc-885的毒副作用的。亟需一种小鼠模型来研究cc-885的毒性作用，进而探究gspt1是否可以作为一个抗肿瘤药物的靶点。技术实现要素：鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供crbn基因在构建gspt1敏感模型中的用途，用于解决现有技术中的问题。为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供crbn基因在构建gspt1敏感细胞模型或gspt1敏感动物模型中的用途。本发明另一方面提供一种gspt1敏感细胞模型，所述gspt1敏感细胞模型的crbn基因包括v380e突变，所述gspt1敏感细胞模型来源于小鼠。本发明另一方面提供上述gspt1敏感细胞模型的构建方法，包括：在细胞中引入crbnv380e突变以提供上述gspt1敏感细胞模型，所述细胞来源于小鼠。本发明另一方面提供上述gspt1敏感动物模型的构建方法，包括：在小鼠中引入crbnv380e突变以提供上述gspt1敏感动物模型。本发明另一方面提供一种筛选gspt1降解剂的候选药物的方法，包括：将候选药物施用于上述的gspt1敏感细胞模型、或由上述的gspt1敏感动物模型的构建方法构建获得的gspt1敏感动物模型。附图说明图1显示为本发明实施例1中crbnv380e小鼠基因组测序结果示意图。图2显示为本发明实施例2、实施例3中的gspt1表达和细胞杀伤结果示意图。图3显示为本发明实施例4中miapaca2细胞和panc1细胞的细胞活力示意图。图4显示为本发明实施例5中gspt1降解示意图。图5显示为本发明实施例6中血压测量结果示意图。图6显示为本发明实施例7中注射cc-885后的生存曲线示意图。图7显示为本发明实施例8中剪切caspase3表达结果示意图。具体实施方式为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。本发明发明人经过大量实践研究，意外发现crbn基因的突变可以用于构建gspt1敏感细胞模型或gspt1敏感动物模型。构建获得的gspt1敏感细胞模型或gspt1敏感动物模型对于gspt1降解剂具有敏感性，从而可以被用于gspt1降解剂的候选药物的筛选，在此基础上完成了本发明。本发明第一方面提供crbn基因在构建gspt1敏感细胞模型或gspt1敏感动物模型中的用途。gspt1敏感通常指细胞或动物对于gspt1降解剂具有敏感性。例如，在被施用gspt1降解剂的情况下，细胞中或动物体内的gspt1会被明显降解(例如，gspt1的表达量被明显降低等)。再例如，在被施用gspt1降解剂的情况下，细胞或动物体会出现明显的毒性作用(例如，细胞活力降低、动物血压降低、生存率降低、剪切caspase3表达量升高等)。上述用途中，gspt1降解剂通常指可以降低gspt1的表达和/或功能的物质。例如，gspt1降解剂可以是降低gspt1的表达和/或功能，也可为完全消除gspt1的表达和/或其功能。对于本领域技术人员来说，应该可以知晓哪些物质能够作为gspt1降解剂、或者有潜力能够作为gspt1降解剂。例如，gspt1降解剂通常可以与crbn和gspt1进行结合，形成crbn-降解剂-gspt1三元复合物，从而达到降低gspt1的表达和/或功能的效果。再例如，gspt1降解剂可以是免疫调节剂(imids)等。在本发明一具体实施例中，gspt1降解剂可以是cc-885(cas1010100-07-8)等。本发明所提供的用途中，crbn基因所编码的多肽片段通常可以是：a)编码氨基酸序列包括seqidno.1所示序列的蛋白；或，b)编码氨基酸序列与seqidno.1所示的序列具有80％以上序列一致性、且具有a)所限定的蛋白的功能的蛋白。具体的，上述b)中的蛋白具体指：氨基酸序列如seqidno.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，或者在n-末端和/或c-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸序列如seqidno.1所示的蛋白的功能的蛋白，例如，可以是作为cullin4泛素连接酶复合体的底物受体蛋白等。上述b)中的蛋白的氨基酸序列可以与seqidno.1具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的一致性。两个多肽之间的“序列一致性(sequenceidentity)”通常指示序列之间相同氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列一致性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列一致性通常使用序列分析软件来测量，具体可使用ncbi数据库的blast等程序来确定一致性。通常来说，上述crbn基因可以来源于小鼠(musmusculus)。magegdqqdaahnmgnhlpllpdsededdeiemevedqdskearkpniinfdtslptshtylgadmeefhgrtlhdddscqvipvlpevlmilipgqtlplqlshpqevsmvrnliqkdrtfavlaysnvqereaqfgttaeiyayreeqefgievvkvkaigrqrfkvlelrtqsdgiqqakvqilpecvlpstmsavqleslnkcqvfpskpiswedqysckwwqkyqkrkfhcanltswprwlyslydaetlmdrikkqlrewdenlkddslpenpidfsyrvaaclpiddvlriqllkigsaiqrlrceldimnkctslcckqcqeteittkneifslslcgpmaayvnphgyvhetltvykasnlnligrpstvhswfpgyawtiaqckicashigwkftatkkdmspqkfwgltrsallptipetedeispdkvilcl(seqidno.1)上述用途中，在构建gspt1敏感细胞模型或gspt1敏感动物模型时，通常可以在crbn基因中引入v380e突变。由于小鼠crbn与人crbn的氨基酸序列的差异，野生型的小鼠或其细胞通常对于gspt1降解剂是不敏感的。而在小鼠的细胞中引入crbnv380e突变以后，所获得的小鼠细胞模型对于gspt1降解剂会具有敏感性，从而可以作为gspt1敏感细胞模型。而在小鼠的crbn基因中引入v380e突变以后，所获得的小鼠动物模型对于gspt1降解剂会具有敏感性，从而可以作为gspt1敏感动物模型。上述用途中，所构建的gspt1敏感细胞模型和/或gspt1敏感动物模型通常是来源于小鼠的，通常可以通过野生型小鼠、或可以通过改造后的人源化小鼠或其细胞构建获得。例如，可以是小鼠内脏细胞、小鼠脾脏细胞、小鼠肝脏细胞、小鼠胚胎成纤维细胞等。本发明第二方面提供一种gspt1敏感细胞模型，所述gspt1敏感细胞模型的crbn基因中存在v380e突变，所述gspt1敏感细胞模型来源于小鼠。如上所述，在小鼠的细胞中引入crbnv380e突变以后，小鼠细胞模型对于gspt1降解剂会具有敏感性，从而可以作为gspt1敏感细胞模型。上述gspt1敏感细胞模型中，gspt1敏感细胞模型通常可以通过小鼠内脏细胞构建获得。例如，可适用的小鼠细胞可以包括小鼠内脏细胞、小鼠脾脏细胞、小鼠肝脏细胞、小鼠胚胎成纤维细胞等中的一种或多种的组合。通常来说，gspt1敏感细胞模型可以来源于其对应基因型的人源化小鼠。上述gspt1敏感细胞模型中，gspt1敏感细胞模型中crbnv380e突变可以是杂合的(crbnv380e/+)，也可以是纯合的(crbnv380e/v380e)，优选为纯合的。通常来说，crbnv380e/v380e纯合突变gspt1敏感细胞模型相对于crbnv380e/+杂合突变gspt1敏感细胞模型对于gspt1降解剂具有更强的敏感性。本发明第三方面提供本发明第二方面所提供的gspt1敏感细胞模型的构建方法，包括：在细胞中引入crbnv380e突变以提供上述gspt1敏感细胞模型，所述细胞来源于小鼠。本领域技术人员可选择合适的方法构建crbnv380e突变细胞。例如，可以通过crbnv380e突变的小鼠动物模型，提供crbnv380e突变细胞。再例如，可适用的小鼠细胞可以是小鼠内脏细胞，具体可以包括小鼠内脏细胞、小鼠脾脏细胞、小鼠肝脏细胞、小鼠胚胎成纤维细胞等中的一种或多种的组合。本发明第四方面提供一种gspt1敏感动物模型，所述gspt1敏感动物模型的crbn基因中存在v380e突变，所述gspt1敏感动物模型来源于小鼠。如上所述，在小鼠体内引入crbnv380e突变以后，小鼠动物模型对于gspt1降解剂会具有敏感性，从而可以作为gspt1敏感动物模型。上述gspt1敏感动物模型中，gspt1敏感动物模型通常可以通过小鼠构建获得。通常来说，gspt1敏感动物模型可以来源于野生型小鼠。上述gspt1敏感动物模型中，gspt1敏感动物模型中crbnv380e突变可以是杂合的，也可以是纯合的，优选为纯合的。通常来说，crbnv380e/v380e纯合突变gspt1敏感动物模型相对于crbnv380e/+杂合突变gspt1敏感动物模型对于gspt1降解剂具有更强的敏感性。本发明第五方面提供本发明第四方面所提供的gspt1敏感动物模型的构建方法，包括：在小鼠中引入crbnv380e突变以提供上述gspt1敏感动物模型。本领域技术人员可选择合适的方法构建crbnv380e突变的小鼠动物模型(即gspt1敏感动物模型)。例如，可以通过crisprcas9基因编辑技术等方法，被施用的对象可以是小鼠受精卵细胞等。具体来说，可以通过crisprcas9基因编辑技术将crbnv380e引入小鼠受精卵细胞，育种和/或筛选以后即可获得crbnv380e突变的动物模型(例如，可以将构建获得的受精卵细胞植入雌鼠子宫内，饲养并做基因鉴定，即可获得带有crbnv380e染色体的f0代小鼠，进一步繁殖传代即可获得crbnv380e/v380e纯合突变的动物模型)。再例如，可以通过野生型小鼠细胞进行构建。本发明第六方面提供一种筛选gspt1降解剂的候选药物的方法，包括：将候选药物施用于本发明第二方面所提供的gspt1敏感细胞模型、或本发明第四方面所提供的gspt1敏感动物模型。通常来说，在施用候选药物以后，可以通过被施用候选药物的gspt1敏感细胞模型和/或gspt1敏感动物模型的变化，筛选gspt1降解剂的候选药物。例如，可以将被施用候选药物以后的gspt1敏感细胞模型和/或gspt1敏感动物模型，与对照模型(例如，未施用候选药物的gspt1敏感细胞模型和/或gspt1敏感动物模型)进行比较，观察被施用候选药物的gspt1敏感细胞模型和/或gspt1敏感动物模型的变化(例如，被施用候选药物以后的gspt1敏感细胞模型和/或gspt1敏感动物模型是否出现明显的对于gspt1降解剂的敏感性)，从而可以对候选药物进行筛选。上述筛选gspt1降解剂的候选药物的方法中，筛选出的候选药物还可以进一步构成一个筛选库，还可以对这些物质进行进一步的筛选实验(例如，细胞实验、动物实验、和/或临床试验等)，以进一步确证上述物质作为gspt1降解剂的潜在可能。本发明提供了crbn基因在构建gspt1敏感细胞模型或gspt1敏感动物模型中的用途，并进一步提供gspt1敏感细胞模型和gspt1敏感动物模型和它们的构建方法，这些细胞模型和动物模型对于gspt1降解剂具有明显的响应，从而可以被用于gspt1降解剂的研究，能够节约物质成本、人力成本和时间成本，具有良好的产业化前景。下面通过实施例对本申请予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
技术领域：
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。实施例1crbnv380e小鼠的构建1、利用crispr技术构建crbnv380e人源化的小鼠模型针对于小鼠crbn基因序列：acagtgcacagctggtttcccgg(seqidno.12)，设计并构建介导crbn基因切割的sgrna载体，将下述序列构建到px459载体上：sg#1：f：5’–caccgacagtgcacagctggtttcc–3’(seqidno.2)r:3’–ctgtcacgtgtcgaccaaaggcaaa–5’(seqidno.3)oligo退火的体系：oligo1(100μm)oligo2(100μm)10xt4ligationbuffer(neb)1μlddh2o补足至10μl退火的程序为：37℃30min95℃5minandthenrampdownto25℃at5℃/minpx459载体的切割：plasmid1μgfastdigestbbsi(fermentas)1μlfastap(fermentas)1μl10xfastdigestbuffer2μlddh2o补足至20μl37℃消化3h，之后切胶回收。连接退火产物和px459载体：16℃过夜。之后转化到dh5a感受态中，最终得到构建好的sgrna载体(px459withsgrna)，并测序验证。2、准备转录模板，转录完整的sgrna和cas9mrna：2.1、准备sgrna模板：t7promotertaggedprimerf：taatacgactcactataggacagtgcacagctggtttcc；(seqidno.4)r：aaaagcaccgactcggtgcc；(seqidno.5)反应体系：pcr程序为：tostep2for29cycles72℃3min将pcr产物进行回收。2.2、转录sgrna和cas9mrnasgrna的templatedna由以上2.1中得到，cas9的templatedna为从addgene公司购买的质粒。37℃反应4小时，之后加入1μlturbodnase，37℃反应15min。之后利用megacleartmkit(thermofisher)回收转录产物备用。3、将转录好的sgrna、cas9mrna以及合成的修复模板ssdna注射到受精3.5天的受精卵中(sgrna:10ng/μl，cas9mrna：10ng/μl，ssdna：10ng/μl)。在体外利用ksom小鼠胚胎培养基(millipore)将受精卵培养至两细胞期。之后移植入假孕0.5天的icr雌鼠子宫内。等待19-21天，可以得到f0代小鼠。aaagcgtccaacctgaatctgataggccggccttctactgagcacagctggtttcccgggtaatacagctgtttacttttcttgttgactcttcatttagttttagatgaactttctaggaagatacaaaacaaacaggacaggaatagtttgatcacttcatgaatgggttaaaagcagggacatgaga(seqidno.6)190nt，a是v380e的突变，t是引入的同义突变，方便之后鉴定。4、f0代小鼠的鉴定和筛选。primerf：gcaacagaatatctgccaacctc(seqidno.7)；primerr：gccacttccaaagtaaaaggga(seqidno.8)。f0代小鼠基因型的检测结果如图1a。5、对f0代进行鉴定之后，我们选择了一只杂合子与野生型小鼠进行繁殖，并将其子代自交，最终得到crbnv380e/v380e小鼠。在繁育过程中得到了野生型，杂合子和纯合子，基因型如图1b所示。6、同时评估了基因编辑对小鼠发育的影响，发现基因编辑不会影响小鼠发育。小鼠的出生比率符合孟德尔遗传定律，结果如图1c所示。实施例2crbnv380e人源化小鼠对cc-885是响应的从野生型小鼠和crbnv380e/+小鼠中取出脾脏组织，并在40μm的筛网上研磨出脾脏细胞，脾脏细胞用rpmi1640培养基(包含10％hifbs，20mmhepes，1mmsodiumpyruvate，0.05mm2-mercaptoethanol，1×glumax，1×青霉素链霉素双抗)，37℃5％co2恒温培养。脾脏分于6孔板中(2.5×107/孔)，并以人hl60细胞((1×107/孔)，1640培养基，10％胎牛血清，1×青霉素链霉素双抗)作为阳性对照，每组培养基中直接加入梯度浓度0、10、100nmcc-885，经过37℃，24h处理后收集细胞并用ripa提取细胞总蛋白，使用免疫印迹法检测gspt1的表达。收集细胞，蛋白上样缓冲液(50mmtris-hcl，2％sds，0.025％bpb，1％β-巯基乙醇，10％甘油)，98℃变性10min。用sds-page法分离蛋白并转移到pvdf膜(millipore，ipvh00010)中，再用5％脱脂牛奶(溶于tbst缓冲液)封闭后，在4℃条件下与一抗gspt1(abcam，ab49878)和vinculin(sigma，v9131)过夜孵育，再与二抗室温孵育1小时，用化学发光法(ecl化学发光试剂盒，碧云天生物公司，p0018am)检测膜上的条带。结果如图2a所示。从怀孕时长12.5天的母鼠中分离出小鼠幼儿胚胎，在去掉头和内脏团后，用手术剪剪碎肢体，再用胰酶消化20min，得到野生型、crbnv380e/+杂合小鼠、crbnv380e/v380e纯合小鼠、crbni391v/i391v纯合小鼠的mef细胞。mef细胞用dmem培养基(10％fbs，青霉素链霉素双抗)，37℃恒温箱内进行培养扩增。各个基因型的mefs分装于6孔板中(4×105/孔)，每组培养基中直接加入梯度浓度0、10、100nmcc-885，经过37℃，24h处理后收集细胞并用ripa提取细胞总蛋白，使用上述免疫印迹法(westernblot)检测gspt1的表达，结果如图2b所示。由图2a、图2b可见，只有在crbnv380e小鼠的细胞中gspt1被cc-885降解了。说明野生型小鼠对cc-885是不响应的，v380e突变后可以使小鼠对cc-885敏感，crbnv380e纯合突变比杂合突变的小鼠对cc-885更为敏感，gspt1降解更明显。实施例3cc-885对crbnv380e小鼠细胞具有杀伤作用用图2b中相同的方法提取和培养crbnv380e/+杂合小鼠mef细胞和crbni391v/i391v纯合小鼠mef细胞，以相同的密度种于6孔板中，经过间隔为2倍的梯度浓度的cc-885处理60h后，用cck-8试剂盒和酶标仪检测450nm吸收波长来判断细胞活力，生存曲线图(graphpadprism5软件作图)如图2c所示，图中，***，p<0.001。由图2c可知，huh7对cc-885非常敏感，hep1-6(阴性对照，gibcodmem培养基，10％胎牛血清，1×青霉素链霉素双抗，4×105/孔)对cc-885没有响应，crbni391v/i391v纯合小鼠mef细胞对cc-885没响应，而crbnv380e/+杂合小鼠mef细胞对cc-885较为敏感，1μmcc-885作用72h可以将50％以上的crbnv380e细胞杀死。说明人源化的crbnv380e可以使小鼠对cc-885响应。用图2b中相同的方法提取和培养野生型、crbnv380e/+杂合和crbnv380e/v380e纯合小鼠的mef细胞，经过间隔为10倍的梯度浓度的cc-885处理72h后，用cck-8试剂盒和酶标仪检测450nm吸收波长来判断细胞活力，并绘制生存曲线图，结果如图2d所示，图中，***，p<0.001。可见cc-885对crbnv380e纯合小鼠的mef细胞比杂合的mef细胞更敏感。实施例4cc-885的毒性作用是通过降解gspt1实现质粒及细胞株构建方法：gspt1敲除质粒及细胞系的构建：gspt1基因对应的sgrna序列gatgctggcaagtcaaccat(seqidno.9)克隆到cellecta#svcru6t16-l载体上(按照说明书操作)。将上述载体与pspax2及vsvg质粒共同感染293ft细胞以包装病毒。感染过程中质粒用量为：svcru6t16质粒3.75μg，pspax2质粒5.5μg，vsvg3.75μg，细胞用量为1.2×107，转染试剂(eztransreagents，lifeilabbio，shanghai)用量为55μl，60小时后收病毒，感染miapaca2和panc1细胞(来自atcc，用dmem培养基，10％fbs，1×青霉素链霉素双抗培养)。病毒感染24小时后换新鲜培养基。恢复一天后，用200ng/mldox诱导3天，收取细胞样本进行gspt1的表达检测，进行后续实验。将密码子优化过的gspt1序列(同义突变，减少gc含量)连接在phblv载体上，gspt1序列在克隆时加上flag标签，phblv与pspax2及vsvg质粒共同包装病毒(病毒包装方法参照上述gspt1敲除病毒的构建方法)，及感染miapaca2和panc1细胞，用1μg/mlpuromycin进行筛选，收取细胞检测基因的表达情况。gspt1g575n突变体构建：进行环状pcr(takara，maxdnapolymerase)，引物序列：g575n-f：5"gacaaaaaatcaaatgaaaaaagtaagacccgacccc(seqidno.10)，g575n-r：tcatttgattttttgtctaccaagcagattaa(seqidno.11)，pcr条件为：98℃3min，35个循环(98℃30s，55℃30s，72℃1min)，72℃1min，pcr之后进行dpn1(neb)消化2小时，将突变体转化入stab3感受态，挑取单克隆，进行测序。将各种构建好的细胞种入96孔板，1000细胞/孔。加入不同浓度的cc-885，72小时后，用cck-8试剂盒和酶标仪检测450nm吸收波长来判断细胞活力，绘制曲线，结果如图3所示。图中，ko_gspt1表示gspt1基因敲除细胞中又过表达野生型gspt1的细胞，ko_gspt1g575n表示gspt1基因敲除细胞中又过表达gspt1g575n突变的细胞，nt_gspt1表示感染crispr空质粒的细胞中过表达野生型gspt1，nt_gspt1g575n表示感染crispr空质粒的细胞中过表达gspt1g575n，nt_vec表示感染crispr空质粒的细胞感染过表达phblv空载体，ko_vec表示gspt1基因敲除的细胞感染过表达phblv空载体。前期研究已证明gspt1g575n是不能被cc-885降解的，但保持了野生型gspt1的生物学功能。如图3所示，当转入gspt1g575n时，细胞对cc-885的敏感性显著降低了。这提示cc-885是通过降解gspt1而发挥毒性的。因此能够响应cc-885的小鼠是可以用于研究gspt1降解的毒副作用的。实施例5cc-885可以降解小鼠组织的gspt1给野生型和crbnv380e/+小鼠分别腹腔注射5mg/kg的cc-885，在crbnv380e小鼠注射cc-885不同时间点处死小鼠，收取脾脏组织。脾脏组织用ripa和冷冻研磨仪(上海净信)进行裂解，取得的蛋白样进行免疫印迹，检测gspt1的表达，结果如图4所示。由图4可知，cc-885可导致小鼠体内gspt1表达丰度的降低。实施例6cc-885可致crbnv380e基因型小鼠血压下降crbnv380e(两只crbnv380e/+杂合小鼠和两只crbnv380e/v380e纯合小鼠)和crbni391v小鼠(对照组，6只)分别腹腔注射5mg/kg的cc-885，在10h、20h、30h之时用无创血压仪(kentscientificcorporation)测量血压，结果如图5所示。由图5可知，crbnv380e小鼠出现血压明显降低的表型，而crbni391v小鼠在注射cc-885后，血压较为平稳。实施例7cc-885对crbnv380e小鼠的有毒性给crbnv380e(两只crbnv380e/+杂合小鼠和两只crbnv380e/v380e纯合小鼠)和crbni391v(对照组，6只)分别注射5mg/kg的cc-885，观察小鼠死亡情况，并绘制生存曲线，结果如图6所示。由图6可知，crbnv380e小鼠在注射cc-88548h内相继死亡，而crbni391v小鼠在腹腔注射cc-885未观察到异常表型。实施例8crbnv380e小鼠的小肠组织剪切caspase3表达升高对crbnv380e小鼠在死亡时立即进行解剖(实施例6中提供)，而crbni391v小鼠在所有crbnv380e小鼠死亡后进行解剖。取小肠组织进行石蜡包埋和免疫组化，其中免疫组化所用到试剂盒为超敏二步法免疫组化试剂盒(bioss，pv-0024)，一抗为anti-cleavedcaspase3(cst)，结果如图7所示，由图7可知，crbnv380e小肠组织切片中，可观察到剪切caspase3表达的升高，图中，scalebar＝50μm。综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属
技术领域：
中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。序列表<110>上海科技大学<120>crbn基因在构建gspt1敏感模型中的用途<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>444<212>prt<213>musmusculus<400>1metalaglygluglyaspglnglnaspalaalahisasnmetglyasn151015hisleuproleuleuproaspsergluaspgluaspaspgluileglu202530metgluvalgluaspglnaspserlysglualaarglysproasnile354045ileasnpheaspthrserleuprothrserhisthrtyrleuglyala505560aspmetglugluphehisglyargthrleuhisaspaspaspsercys65707580glnvalileprovalleuprogluvalleumetileleuileprogly859095glnthrleuproleuglnleuserhisproglngluvalsermetval100105110argasnleuileglnlysaspargthrphealavalleualatyrser115120125asnvalglngluargglualaglnpheglythrthralagluiletyr130135140alatyrargglugluglnglupheglyilegluvalvallysvallys145150155160alaileglyargglnargphelysvalleugluleuargthrglnser165170175aspglyileglnglnalalysvalglnileleuproglucysvalleu180185190proserthrmetseralavalglnleugluserleuasnlyscysgln195200205valpheproserlysproilesertrpgluaspglntyrsercyslys210215220trptrpglnlystyrglnlysarglysphehiscysalaasnleuthr225230235240sertrpproargtrpleutyrserleutyraspalagluthrleumet245250255aspargilelyslysglnleuargglutrpaspgluasnleulysasp260265270aspserleuprogluasnproileaspphesertyrargvalalaala275280285cysleuproileaspaspvalleuargileglnleuleulysilegly290295300seralaileglnargleuargcysgluleuaspilemetasnlyscys305310315320thrserleucyscyslysglncysglngluthrgluilethrthrlys325330335asngluilepheserleuserleucysglyprometalaalatyrval340345350asnprohisglytyrvalhisgluthrleuthrvaltyrlysalaser355360365asnleuasnleuileglyargproserthrvalhissertrpphepro370375380glytyralatrpthrilealaglncyslysilecysalaserhisile385390395400glytrplysphethralathrlyslysaspmetserproglnlysphe405410415trpglyleuthrargseralaleuleuprothrileprogluthrglu420425430aspgluileserproasplysvalileleucysleu435440<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2caccgacagtgcacagctggtttcc25<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ctgtcacgtgtcgaccaaaggcaaa25<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ctgtcacgtgtcgaccaaaggcaaa25<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5aaaagcaccgactcggtgcc20<210>6<211>190<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6aaagcgtccaacctgaatctgataggccggccttctactgagcacagctggtttcccggg60taatacagctgtttacttttcttgttgactcttcatttagttttagatgaactttctagg120aagatacaaaacaaacaggacaggaatagtttgatcacttcatgaatgggttaaaagcag180ggacatgaga190<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gcaacagaatatctgccaacctc23<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gccacttccaaagtaaaaggga22<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gatgctggcaagtcaaccat20<210>10<211>37<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10gacaaaaaatcaaatgaaaaaagtaagacccgacccc37<210>11<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tcatttgattttttgtctaccaagcagattaa32<210>12<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12acagtgcacagctggtttcccgg23当前第1页12