一种特异性抗体递送平台及其制备方法和应用

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种特异性抗体递送平台及其制备方法和应用。

背景技术：

nk细胞是固有免疫系统的重要组成部分。nk细胞具有多种免疫功能，既能直接实现细胞杀伤又能分泌促炎因子，增强机体免疫反应。nk细胞对肿瘤细胞具有直接杀伤能力，基于nk细胞的抗肿瘤免疫疗法在21世纪发展迅速。虽然这些疗法还没有像过继性t细胞疗法一样在临床上取得巨大成功，但临床前和临床实验的成果都凸显了基于nk细胞治疗肿瘤的巨大潜力。在nk细胞发挥作用的过程中，nk细胞需要在促炎因此的作用下富集在肿瘤部位，随后通过“missingself”方式识别肿瘤，并通过颗粒酶、穿孔素直接杀死肿瘤细胞，或通过释放tnf和inf-γ等细胞因子发挥作用。因此，通过增强nk细胞在肿瘤部位的富集，利用nk细胞的非特异性杀伤能力，在肿瘤部位实现对肿瘤细胞的杀伤，以此来实现治疗肿瘤的效果。

目前已有的基于nk细胞的抗肿瘤免疫疗法包括三种：第一种是通过细胞因子或抗体激活nk细胞表面受体，增强nk细胞在肿瘤部位的杀伤能力，但由于细胞因子与抗体会分布在全身各处，可能会导致比较严重的副作用；第二种是通过在nk细胞表面修饰car来增强nk细胞识别肿瘤细胞的能力，增强其在肿瘤部位的富集，但car-nk的局限是只能用于治疗特异性抗原已知的肿瘤，但目前大部分肿瘤的特异性抗原都是未知的，这种方法没有充分利用nk细胞的非特异性杀伤能力；第三种是异体过继性nk细胞转移，通过增多体内nk细胞的总量来增强nk细胞在肿瘤部位的富集，但缺点是回输的nk细胞表面的kir可能无法被正常组织细胞的hla识别，导致副反应；另外回输的nk细胞纯度也无法保证，为了提高nk细胞的纯度，不可避免地会减少分选效率，为细胞的原始采集造成更大的负担。

因此，如果可以提高体内自身nk细胞在肿瘤部位的富集，则在促进nk细胞在肿瘤部位发挥作用的同时，也可以避免以上种种副反应。但不幸的是体内细胞迁移的调控手段目前还不成熟，还有很多未知待探索。

技术实现要素：

基于此，本发明的目的之一在于提供一种特异性抗体递送平台，其可与nk细胞结合并能促进nk细胞迁移，预示其在医学检测、血液筛查、靶向药物制备中具有广泛的应用前景。

实现上述目的的具体技术方案如下：

一种特异性抗体传送平台的制备方法，所述特异性抗体传送平台的制备方法为以nk细胞为靶点，通过对四氧化三铁纳米颗粒表面进行修饰，在偶联剂的作用下，使四氧化三铁纳米颗粒与特异性识别nk细胞的抗体经化学键合结合而成。

在其中的一些实施例中，上述制备方法，包括以下步骤：

(1)将表面羧基化的四氧化三铁纳米颗粒在水溶液中调节到合适的浓度，通过1-(3-二甲基氨丙基)-3-3乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺进行活化反应1小时，将颗粒表面部分羧基转化成活性酯；

(2)将步骤(1)得到的颗粒水溶液和特异性识别nk细胞的抗体水溶液按一定比例混合，4℃反应12小时；

(3)将所述纳米颗粒分离纯化，得到抗体修饰的磁性纳米颗粒。

在其中的一些实施例中，上述步骤1中的四氧化三铁纳米颗粒的浓度为0.5mg/ml；上述edci的使用浓度为0.05-5mmol/l，优选为0.5-1.5mmol/l；上述nhs的使用浓度为0.075-7.5mmol/l，优选为0.75-2.25mmol/l。

在其中的一些实施例中，上述步骤2中的抗体与四氧化三铁纳米颗粒质量比为20％；所述抗体浓度为0.0125-0.2mg/ml，优选为0.1mg/ml。

本发明的目的之一还在于提供一种特异性抗体传送平台。

实现上述目的的具体技术方案如下：

一种特异性抗体传送平台，所述特异性抗体传送平台由上述制备方法制备得到。

在其中的一些实施例中，上述特异性抗体为cd56抗体、抗nk1.1抗体和cd49b抗体中的至少一种。

在其中的一些实施例中，上述特异性抗体传送平台为球形纳米颗粒，其颗粒终浓度为0.4mg/ml，其键合的抗nk1.1抗体抗体终浓度为0.08mg/ml。

本发明的目的之一还在于提供一种特异性抗体传送平台在肿瘤检测和/或疗效监测和/或预后判断和/或个性化用药指导中的应用。

本发明的目的之一还在于提供一种抗肿瘤药物。

实现上述目的的具体技术方案如下：

一种抗肿瘤药物制剂，所述药物制剂包括上述特异性抗体传送平台。

在其中的一些实施例中，上述药物制剂还包括辅料，优选为葡萄糖，进一步优选质量浓度为5％的葡萄糖溶液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的发明人开发了一种特异性抗体传送平台，其以nk细胞为靶点，通过对四氧化三铁纳米颗粒表面进行修饰，在偶联剂的作用下，使四氧化三铁纳米颗粒与特异性识别nk细胞的抗体经化学键合结合而成。该特异性传送平台，通过化学键合的方式将抗体与颗粒结合更稳定，可特异性识别nk细胞并与之结合，在磁场作用下还能进一步促进nk细胞迁移，从而可以快捷高效地实现nk细胞在肿瘤部位的富集，能够明显提高免疫治疗效果。预示其在医学检测、血液筛查、靶向药物制备中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中mnp进行抗体修饰得到mnp@nk1.1的制备示意图。

图2为实施例1中优化实验结果图，其中图2a、2b分别为使用不同浓度edci对mnp表面羧基活化成活性酯后的表面电势检测图和粒径表征图，图2c、2d分别为mnp表面修饰不同比例抗体时，抗体的结合率统计图和对应mnp@nk1.1颗粒与nk细胞的结合情况统计图。

图3为实施例1中抗nk1.1抗体与mnp结合方式的检测结果图，其中图3a为sds-page示意图，图3b为sds-page结果图。

图4为实施例1中mnp及其结合抗体后的检测图，其中图4a为粒径图，图4b为扫描电子显微镜拍摄图。

图5为实施例1中uplc检测抗nk1.1抗体与fe3o4磁性纳米颗粒的结合效率，其中图5a为不同浓度标准样品的峰形图，图5b为对照组和实验组上清抗体浓度的表征。

图6为实施例2中颗粒(mnp@nk1.1和mnp@igg2a)与nk细胞的结合情况，其中图6a为不同浓度的颗粒与nk细胞结合情况的流式图；图6b为6a中对应mnp@nk1.1颗粒浓度在不同孵育时间下与nk细胞的结合情况统计图；图6c为相同条件下，对照组颗粒mnp@igg2a和实验组颗粒mnp@nk1.1与nk细胞结合情况的比较结果图。

图7为实施例2中颗粒(mnp@nk1.1和mnp@igg2a)与pbmcs中的nk细胞和t细胞的结合情况，其中图7a为不同浓度的颗粒与nk细胞的结合检测图，图7b为不同孵育时间下，颗粒与nk细胞的结合情况检测图，图7c为mnp@nk1.1分别与t细胞、nk细胞的结合情况检测图，图7d为图7b的平均荧光强度统计图，7e为7c的平均荧光强度统计图。

图8为实施例2中激光共聚焦观察mnp@nk1.1颗粒与nk细胞的结合情况，其中图8a为对照组和实验组的nk细胞和mnp@nk1.1颗粒的荧光共定位，图8b为mnp@nk1.1颗粒与nk细胞结合的细节图。

图9为实施例3中磁场作用下mnp@nk1.1颗粒促进nk细胞迁移能力的验证结果图，其中图9a为操作示意图，图9b为荧光显微镜结果图。

图10为实施例4中mnp@nk1.1颗粒小鼠实验流程示意图。

图11为实施例4中磁性纳米颗粒治疗黑色素瘤小鼠结果，其中图11a为磁性纳米颗粒抑制黑色素瘤生长的曲线图；图11b为治疗过程中小鼠的体重变化图，图11c为每只小鼠的肿瘤生长情况统计图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明涉及缩略语和术语定义如下：

mnp：磁性纳米颗粒，羧基功能化四氧化三铁纳米颗粒。

edci：1-(3-二甲基氨丙基)-3-3乙基碳二亚胺盐酸盐。

nhs：n-羟基琥珀酰亚胺。

peg-pla：聚乙二醇聚乳酸。

sec柱：尺寸排阻层析柱。

sem：扫描电子显微镜。

dls：动态光散射。

实施例1mnp@nk1.1的制备

实验材料：

anti-mousenk1.1抗体，购于biocell，美国；mnp，购于西安瑞禧生物科技有限公司；edci，购于东京化成工业株式会社(tci)；nhs，购于阿拉丁，上海。

制备流程如图1所示，先将mnp与活化剂结合进行酯化反应，将表面部分羧基活化为活性酯；再将所得带有活性酯的mnp与能特异性识别nk细胞的抗体上的氨基反应，得到能体内识别并结合nk细胞的磁性纳米颗粒。

性能表征及优化：

1.1活化剂浓度的优化：

颗粒表面的羧基可以在活化剂的作用下发生酯化反应生成活性酯，进一步与抗体上的氨基相互作用，通过酰胺键将颗粒与抗体连接。四氧化三铁纳米颗粒不同于白蛋白或peg-pla等通过材料自身亲疏水性组装成的颗粒，四氧化三铁颗粒必须通过表面电荷的静电排斥来维持其在水溶液重点稳定性。因此，将四氧化三铁表面羧基转换成活性酯的活化剂浓度需要在一定范围才能既保证颗粒的稳定性，又保证颗粒表面有足够多的活性酯与抗体相互作用生成酰胺化学键。

如图2a所示，随着活化剂edci的浓度从0增加到2.1mm(nhs的浓度始终是edci的1.5倍)，颗粒的表面负电荷逐渐减少，体现了颗粒表面羧基逐渐转化为活性酯的过程。如图2b所示，在活化剂浓度较低时，颗粒依然能维持在水溶液中的稳定性，当edci浓度升高到1.6mm时颗粒粒径从100nm增加到了180nm，说明颗粒逐渐开始团聚，变得不稳定；当edci浓度升高到2.1mm时，颗粒粒径达到了600nm，此时颗粒表面的负电荷产生的静电排斥力已不足以维持四氧化三铁颗粒在水溶液中的稳定性，因此选择了低于1.6mm的edci浓度进行进一步优化。

1.2颗粒表面抗体修饰比例的优化：

四氧化三铁颗粒表面修饰抗体是为了实现颗粒与靶细胞的特异性结合，因此颗粒表面修饰的抗体量应该由修饰抗体后颗粒结合靶细胞的能力来决定。如图2c所示，为了验证不同抗体修饰比例对颗粒结合靶细胞能力的影响，我们先在四氧化三铁颗粒表面修饰了相同浓度的cy5荧光分子，随后又在四氧化三铁纳米颗粒表面修饰了不同比例的抗体，其中抗体与颗粒的质量比分别是5％、10％、15％、20％和25％。通过bca试剂盒检测其上清中的抗体量辅助验证了在这些比例下抗体都完全结合在了颗粒表面。具体的抗体结合率计算公式如下：

结合效率(％)＝(抗体投入量-离心后上清中的抗体量)/抗体投入量×100％···(1-1)

将上述制备的不同抗体修饰比例的颗粒以1μg/ml的浓度在含有0.2％牛血清白蛋白的1×pbs中与密度为1×10⁶/ml的nk细胞，在37℃共孵育30min后，用流式细胞仪检测nk细胞的cy5荧光强度。由于颗粒表面修饰了cy5荧光分子，细胞结合的颗粒越多，则细胞的cy5荧光就越强。通过nk细胞的平均荧光强度可以比较不同抗体修饰比例下颗粒与细胞的结合能力的强弱。如图2d所示，在抗体比例较低时，nk细胞的平均荧光强度随着抗体修饰比例增加而增加，说明此时颗粒与nk细胞结合的能力在逐渐增强。当修饰比例达到20％时，nk细胞的平均荧光强度不再增加，说明此时继续增加颗粒表面的抗体修饰比例不会再提高颗粒与nk细胞的结合能力。因此，后续实验选择抗体与四氧化三铁纳米颗粒质量比为20％作为最佳抗体修饰比例。

1.3抗体结合效率的精确检测：

通过超高效液相色谱(uplc)的凝胶色谱柱可以有效分离抗nk1.1抗体与其他分子量不同于抗体的杂质，可以实现对抗体的特异性检测。当样品中只含有一种抗体时，使用uplc可以实现特异性更强、精确度更高的检测效果。实验方法如下：

按照上述制备mnp@nk1.1的方法制备mnp@nk1.1颗粒，制备后离心取上清作为样品进行检测。在相同实验条件下，制备一组不加颗粒的对照组，与样品一起检测。抗体的结合效率计算公式与公式(1-1)相同。对照组和样品组经过的sec柱，以ph7.4的10mmpb缓冲盐为流动相，通过tuv检测器检测280nm的吸收峰可以在3-4.5min时检测到抗nk1.1抗体的峰。如图3a、b所示，可通过标准样品的峰面积绘制标准曲线，以此来计算样品组和对照组的颗粒浓度。如图3c所示，对照组的抗体浓度与投入量相同，而实验组上清中检测不到抗体，说明抗体完全结合在了颗粒表面。

综合上述优化实验结论，得到最佳制备方式如下：

取羧基化四氧化三铁磁性纳米颗粒加超纯水稀释至0.5mg/ml，加入edci水溶液至终浓度为1mm，加入nhs水溶液至终浓度为1.5mm。37℃避光活化1h。

去除edci和nhs：9391g×20min离心颗粒，并弃掉上清，并用超纯水重悬颗粒，使其浓度为0.5mg/ml，重复洗涤三次。

将抗nk1.1抗体使用100kda超滤管超滤2～3次，将抗体的溶剂置换成超纯水。再将上述活化的颗粒与抗体混合，将抗体浓度调整至0.1mg/ml，充分混匀后4℃反应12h。反应结束后根据需要使用25％葡萄糖水溶液调节渗透压，使其颗粒终浓度为0.4mg/ml，抗体终浓度为0.08mg/ml，葡萄糖终浓度为5％。

1.4mnp表面修饰抗体前后的粒径改变和表面形貌变化：

如图4a所示，mnp表面修饰抗nk1.1抗体后，经动态光散射(dls)检测，颗粒的平均流体动力学直径从100nm增加到了120nm。如图4b所示，经sem拍摄，四氧化三铁纳米颗粒原本表面有凹凸不平的表面形貌，当表面修饰了抗nk1.1抗体后，表面变得光滑，形成了一层蛋白冠结构。

1.5验证抗体与颗粒的结合方式：

常见的颗粒表面抗体修饰方法有两种，一种是静电吸附，另一种是化学键合。相比于静电吸附，化学键合的方式将抗体与颗粒结合更稳定，抗体不容易从颗粒表面脱落。抗体上的氨基带有正电荷，颗粒表面的羧基则提供了负电荷，因此抗体可能会通过静电吸附的方式剂盒在颗粒表面，只检测颗粒上清中的抗体浓度不能证明抗体是通过哪种方式结合在颗粒表面。我们通过非还原性的sds-page实验验证了抗体是通过化学键合的方式结合在四氧化三体纳米颗粒表面的。实验方法具体如下：取anti-nk1.1抗体10μg加水稀释至20μl，取含同样浓度anti-nk1.1抗体的mnp@nk1.1颗粒溶液20μl，分别加入5μl5×蛋白上样缓冲液混匀，室温静置10min后，放入99℃金属浴加热10min，待样品冷却后上样；以120mv跑胶3h，并拍摄样品条带，考马斯亮蓝染色观察条带情况。

实验结果如图5a所示，当抗体以静电吸附结合在颗粒表面时，在电场的作用下，抗体会离开颗粒，通过考马斯亮蓝染色可以观察到迁移后的抗体条带；而通过化学键合方式结合的抗体不会在静电作用下脱离颗粒，就不会有抗体的迁移。并且如图5b所示，游离组和吸附组都有明显的游离抗体条带，而键合组没有条带。说明mnp@nk1.1颗粒的抗体是通过化学键合结合在颗粒表面的，因此不会在电场作用下由负极向正极迁移，抗体在颗粒表面的键合是稳定的。

实施例2mnp@nk1.1颗粒与nk细胞的特异性结合

实验材料：小鼠b16-f10黑色素瘤细胞系来源于美国标准生物品收藏中心(atcc)。spf级雌性c57bl/6小鼠，5～6周龄，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。小鼠饲养在华南理工大学实验动物中心，动物实验流程遵循华南理工大学实验动物管理规范条例的相关规定。

anti-mousenk1.1抗体购自美国biocell公司。

2.1mnp@nk1.1颗粒与nk细胞的结合

为了评估磁性纳米颗粒mnp@nk1.1结合nk细胞的能力，我们首先对mnp@nk1.1颗粒与nk细胞相互作用的能力进行探究。先通过nk细胞磁珠分选试剂盒按照说明书操作步骤将c57b/6小鼠脾脏中的nk细胞分选出来，再将nk细胞(6×10⁵细胞/ml)分别与cy5标记的mnp@igg2a颗粒和cy5标记的mnp@nk1.1颗粒在37℃下共孵育(颗粒浓度为0，3.125，6.25，12.5和25μg/ml)，并通过流式细胞仪评价mnp@nk1.1的靶向能力：当nk细胞与颗粒结合后，nk细胞会呈现cy5阳性，且细胞上结合的颗粒越多，细胞的荧光强度越强。

实验结果如图6a所示，nk细胞的平均荧光强度随mnp@nk1.1颗粒浓度的增加而增加。如图6b所示，nk细胞的平均荧光强度随孵育时间的延长而增加：mnp@nk1.1颗粒与nk细胞孵育30min，nk细胞的平均荧光强度比孵育15min时显著增强；相比于孵育30min，孵育60min时nk细胞的平均荧光强度增加不大。与之相比，对照组mnp@igg2a颗粒与nk细胞的结合较弱(图6c)，说明mnp@nk1.1与细胞的结合取决于携带的单克隆抗体的抗原特异性识别与结合。

2.2mnp@nk1.1颗粒与pbmcs中nk细胞的结合

考虑到体内复杂的细胞成分，我们还将颗粒与外周血单核细胞(pbmcs)共孵育，并通过流式细胞仪检测颗粒与不同免疫细胞的结合情况。

检测结果如图7a所示，在孵育30min的条件下，随着mnp@nk1.1颗粒浓度的增加，pbmcs中的nk细胞平均荧光强度逐渐增强；并且，在相同颗粒浓度(25μg/ml)下及相同孵育时间(0，30，60，120min)的条件下，相比于mnp@igg2a颗粒，经mnp@nk1.1颗粒处理的pbmcs中的nk细胞平均荧光强度更强，说明mnp@nk1.1颗粒与nk细胞有更强的结合(图7b和d)。同时，分别将pbmcs中的nk细胞和t细胞与mnp@nk1.1颗粒(25μg/ml)37℃共孵育0，30，60，120min，流式细胞术结果显示，mnp@nk1.1颗粒与pbmcs中的nk细胞的结合更强，而与pbmcs中的t细胞基本没有结合作用(图7c和e)。

2.3mnp@nk1.1颗粒结合位点检测

通过激光扫描共聚焦显微镜(clsm)拍摄颗粒与nk细胞的结合情况，拍摄结果如图8所示通过激光扫描共聚焦显微镜(clsm)拍摄颗粒与nk细胞的结合情况，可以观察到颗粒结合在细胞表面而不是颗粒被细胞摄取。因此mnp@nk1.1颗粒结合在nk细胞表面，结合在细胞表面相比于被细胞摄取对细胞的影响更小，可以保证nk细胞的杀伤能力不被破坏。

以上结果均证明，nk1.1受体分子可作为mnp@nk1.1的结合位点。

实施例3mnp@nk1.1颗粒在磁场作用下促进nk细胞迁移

为了验证mnp@nk1.1颗粒能否在外加磁场作用下促进nk细胞发生迁移，我们在培养皿中将nk细胞与mnp@nk1.1颗粒共孵育。细胞密度为1×10⁶细胞/ml，颗粒浓度25μg/ml，孵育条件为37℃培养箱孵育30min。

检测结果如图9所示，在外加磁场的作用下nk细胞聚集在培养皿边缘，说明颗粒具有促进nk细胞迁移的能力。

实施例4动物水平抗肿瘤治疗

取32只c57bl/6小鼠，右侧背部皮下注射50μl密度为5×10⁶细胞/ml的b16-f10黑色素瘤细胞。植瘤8天后，开始给药治疗并监测小鼠肿瘤生长情况和体重变化。将上述小鼠随机分为4组，每组8只小鼠：第一组小鼠为control组，尾静脉注射625μl的5％葡萄糖水溶液；第二组小鼠记为m-mnp@igg2a组，尾静脉注射625μl的mnp@igg2a(颗粒浓度为0.4mg/ml，抗体浓度为0.08mg/ml，溶解在5％葡萄糖水溶液中)，并在给药半小时后在肿瘤部位放置外加磁场处理2h；第三组小鼠记为mnp@nk1.1组，尾静脉注射625μlmnp@nk1.1(颗粒浓度为0.4mg/ml，抗体浓度为0.08mg/ml，溶解在5％葡萄糖水溶液中)，不进行磁场处理；第四组小鼠记为m-mnp@nk1.1组，尾静脉注射625μl的mnp@nk1.1(颗粒浓度为0.4mg/ml，抗体浓度为0.08mg/ml，溶解在5％葡萄糖水溶液中)，并在给药半小时后在肿瘤部位放置外加磁场处理2h。

每两天给药一次，共给药4次。整个治疗过程中，每天用游标卡尺对肿瘤大小进行测量，并对各组小鼠体重进行监测。肿瘤体积的计算公式如下：

体积(mm³)＝0.5×长×宽²。

检测结果如图11所示，其中图11a为磁性纳米颗粒抑制黑色素瘤生长的曲线图，图11c为每只小鼠的肿瘤生长情况统计图，control组、m-mnp@igg2a组和mnp@nk1.1组肿瘤生长迅速。m-mnp@nk1.1实验组具有明显的抑制肿瘤生长效果，这是由于磁性颗粒先与体内nk细胞结合，并在外加磁场的作用下使nk细胞富集在了肿瘤部位。如图11b所示，在整个治疗过程中，各组小鼠体重均未出现明显变化，证明了各组组分未对小鼠造成严重的毒性，药物具有较好的生物相容性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。