阿拉伯半乳糖苷酶编码基因00578在制备重组桃胶多糖水解酶中的应用

1.本发明涉及桃胶多糖裂解酶技术领域，具体地，涉及阿拉伯半乳糖苷酶编码基因00578在制备重组桃胶多糖、阿拉伯半乳聚糖、半乳聚糖水解酶中的应用。


背景技术：

2.桃胶，属于蔷薇科植物胶，是桃树的树皮在机械受损后分泌出来的棕褐色的胶状物质。因与阿拉伯胶性质相似，桃胶也素有“国产阿拉伯胶”之称。与阿拉伯胶相比，同样浓度的桃胶透明度和粘性要比阿拉伯胶高，可替代阿拉伯胶用于粘合剂，定型剂，保护胶，增稠剂，成膜材料，乳化剂等行业中。还具有独特的药食同源特性，我国古医书记载桃胶对血淋、消渴、石淋和腹泻症状有效，现代医学证明可用于膀胱炎、二型糖尿病的治疗。具有较大的开发应用价值。
3.因天然桃胶结构复杂，难以溶解，只有降解后才能加工利用。目前对桃胶多糖的水解方法主要包括热水浸提法，酸碱水解法以及微波超声法。但这些处理对糖苷键是非定向水解，对水解产品的多糖聚合度、成分、粘度和质量等都难以把控。生物酶降解法，利用糖苷键特异性的酶法降解多糖可以实现定向水解，稳定生成特定的酶催化产物，还具有反应条件温和及环境友好等优势，但是目前，还未见商业化的桃胶水解酶报道。天然多糖一般由半乳糖，阿拉伯糖，木糖，鼠李糖和葡萄糖醛酸组成，但各单糖的含量因其品种和产地而不同，目前对桃胶多糖的分子结构还不是非常清楚，但现有研究表明与阿拉伯胶相似，半乳聚糖是这类多糖的主链结构，阿拉伯半乳聚糖是支链结构。可见，能够内切桃胶多糖的半乳聚糖主链骨架和水解阿拉伯半乳聚糖支链的酶是桃胶多糖裂解降解的关键酶。虽然中国专利cn104651340a公开了微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶，但其是通过从微杆菌a5驯化后发酵培养的培养物中分离、纯化得到，其得到的是桃胶多糖裂解酶为微生物代谢的复合产物，纯度并不高，并不适用于商业化制备桃胶水解酶制剂。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供阿拉伯半乳糖苷酶编码基因00578或其编码蛋白在降解桃胶、阿拉伯半乳聚糖或半乳聚糖中的应用。
5.本发明的另一目的在于提供所述阿拉伯半乳糖苷酶编码基因00578在制备重组桃胶多糖水解酶、阿拉伯半乳聚糖水解酶或半乳聚糖水解酶中的应用。
6.本发明的再一目的在于提供一种重组桃胶多糖水解酶的制备方法。
7.本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
8.microbacterium sp.china是发明人从环境中分离的具有降解桃胶多糖功能的菌株，发明人前期通过对microbacteriumsp.china的全基因组从头测序，获得其基因组dna信息，上传至ncbi数据库，登录号为cp027434。microbacteriumsp.china基因组的dna大小为3,478,219bp，共有3409个开放阅读框。经与 cazy数据库比对，同时挑选了其他杆菌来源
(bacillus thuringiensis serovartolworthi；bacillus thuringiensis serovar kurstaki str.hd-1；bacillus thuringiensisserovar kurstaki str.ybt-1520；bacillus thuringiensis mc28)的多糖水解酶基因蛋白序列(如bar87238.1，aie37653.1，ahz54600.1，afu18128.1)与基因组蛋白库对比，同时利用pfam分析比对多糖水解酶结构域分析，结合go、kegg、 cog注释，结合结构域比对筛选出有潜在桃胶多糖降解功能的基因orf00578(简称00578)，cazy数据库基因功能注释为半乳糖苷酶编码基因；经本发明验证，其编码的糖苷酶具有水解阿拉伯半乳糖聚糖、低聚半乳糖活性和桃胶多糖的活性，具有较好的桃胶多糖、阿拉伯半乳聚糖、半乳聚糖降解作用。
9.因此，本发明提供seq id no:1所示阿拉伯半乳糖苷酶编码基因00578或 seq id no:2所示新型阿拉伯半乳糖苷酶在降解桃胶、阿拉伯半乳聚糖或半乳聚糖中的应用。
10.还提供seq id no:1所示阿拉伯半乳糖苷酶编码基因00578在制备重组桃胶多糖水解酶、阿拉伯半乳聚糖水解酶或半乳聚糖水解酶中的应用。
11.一种重组桃胶多糖水解酶的制备方法，是将seq id no:1所示阿拉伯半乳糖苷酶编码基因00578连接至带6
×
his标签的表达载体pet22b(+)中，转化至大肠杆菌，得重组表达菌；再将重组表达菌进行iptg诱导表达重组蛋白，经镍亲和层析纯化后，得到重组桃胶多糖水解酶。
12.优选地，重组表达菌iptg诱导表达起点时a600
nm
为0.5～0.8。
13.优选地，所述iptg诱导温度为17℃～37℃，iptg浓度为0.1～0.9mm，诱导时间为4～20h。
14.进一步优选地，所述iptg诱导温度为27℃，iptg浓度为0.3mm，诱导时间为12h。
15.本发明还请求保护上述任一所述方法制备得到的重组桃胶多糖水解酶。
16.本法发明制备得到的重组桃胶多糖水解酶可以作用于半乳糖苷键和阿拉伯糖苷键，具有裂解桃胶活性。因此，本发明还提供所述重组桃胶多糖水解酶在裂解桃胶中的应用。
17.优选地，酶解温度为30～50℃，酶解体系ph值为6～10。
18.进一步优选地，酶解温度为40℃，酶解体系ph值为6。
19.优选地，酶解体系中还添加有10mm的k
+
或na
+
。
20.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
21.本发明提供了阿拉伯半乳糖苷酶编码基因00578在制备重组桃胶多糖水解酶中的应用。通过将seq id no:1所示阿拉伯半乳糖苷酶编码基因连接至带6
×
his标签的表达载体pet22b(+)中，转化至大肠杆菌，得重组表达菌；再将重组表达菌进行iptg诱导表达重组蛋白，经镍亲和层析纯化后，得到重组桃胶多糖水解酶，得到单一种类的酶，所述重组桃胶多糖水解酶作用于阿拉伯半乳糖苷键、半乳糖苷键和阿拉伯糖苷键，具有良好的桃胶多糖降解活性，可用于制备低分子量和小分子桃胶水解酶，低聚阿拉伯半乳糖和低聚半乳糖水解酶，具有较大的应用前景。
附图说明
22.图1为orf-00578质粒构建中pcr产物和重组质粒双酶切电泳图。a：琼脂糖电泳分离00578pcr产物，1：pet22b(+)-00578-1；2：pet22b(+)-00578-2；3： pet22b(+)-00578-3；
b:琼脂糖电泳鉴定重组质粒双酶切结果，1： pet22b(+)-00578-1；2：pet22b(+)-00578-2；3：pet22b(+)-00578-3。
23.图2为00578重组蛋白的sds-page分析结果。泳道m：蛋白分子量标准。泳道1：野生型大肠杆菌bl21。泳道2：大肠杆菌空载体对照组。泳道3：00578 蛋白重组菌的全细菌裂解液。泳道4:00578蛋白重组菌的裂解离心沉淀。泳道5: 00578蛋白重组菌裂解液离心上清。
24.图3为00578重组蛋白的western-blotting分析结果。泳道1：bl21全细菌裂解液；泳道2：bl21-pet22b(+)裂解液；泳道3：重组菌培养液上清；泳道4：重组菌裂解液；泳道5：重组菌裂解液上清；泳道6重组菌裂解液沉淀。
25.图4为诱导温度对00578蛋白表达的影响。泳道m：蛋白分子量标准；17、 22、27、32、37℃分别为不同诱导表达温度下的00578重组菌裂解液，同一温度的每组样品左侧为裂解液上清，右侧为裂解液沉淀。
26.图5为诱导时间对00578蛋白表达的影响。泳道m：蛋白分子量标准；4、 8、12、16、20分别为不同诱导表达时间下的00578重组菌裂解液。
27.图6为诱导剂浓度对00578蛋白表达的影响。泳道m：蛋白分子量标准； 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9分别为不同诱导剂浓度下的00578重组菌裂解液。
28.图7天然构想重组蛋白镍亲和层析纯化sds-page分析结果。泳道1：细菌裂解液上清。泳道2：纯化柱穿出液。泳道3：纯化柱洗涤液。泳道4：纯化柱洗脱液。
29.图8为尿素变性重组蛋白镍亲和层析纯化sds-page结果。泳道1：细菌裂解液上清。泳道2：纯化柱穿出液。泳道3：纯化柱洗涤液。泳道4：纯化柱洗脱液。
30.图9为蛋白肽段质谱部分结果。
31.图10为桃胶多糖降解酶的重组菌和宿主菌裂解液对桃胶降解能力对比。
32.图11为桃胶多糖水解酶00578对不同糖苷键水解能力的tlc图谱。pnpgal：对硝基苯基-半乳糖苷；pnpara：对硝基苯基-阿拉伯糖苷；pnpglu：对硝基苯基-葡萄糖苷；gal：半乳糖；ara：阿拉伯糖；glu：葡萄糖。
33.图12为温度对桃胶多糖水解酶活性的影响。
34.图13为温度对桃胶多糖水解酶稳定性的影响。
35.图14为ph值对桃胶多糖水解酶活性的影响。
36.图15为ph对桃胶多糖水解酶稳定性的影响。
37.图16为金属离子及其螯合剂对桃胶多糖水解酶活力的影响。
38.图17为桃胶多糖水解酶00578米氏方程的双倒数图。
39.图18为重组水解酶00578对桃胶的降解能力验证。
40.图19为重组水解酶00578裂解桃胶多糖产物的检测。
41.图20为重组水解酶00578水解阿拉伯半乳聚糖活性的验证。
42.图21为重组水解酶00578水解半乳聚糖的活性验证。a：半乳聚糖未加酶处理前，其中左图为半乳聚糖酶处理前低聚糖检测，右图为半乳聚糖酶处理前醛酸检测；b：重组00578对半乳聚糖降解后产物，其中左图为半乳聚糖+00578重组酶后低聚糖检测，右图为半乳聚糖+00578重组酶后醛酸检测。
具体实施方式
43.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
44.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
45.发明人前期已完成对通过对microbacteriumsp.china的全基因组从头测序，获得其基因组dna信息。microbacterium sp.china基因组的dna大小为 3,478,219bp，共有3409个开放阅读框。经与cazy数据库比对，go、kegg、 cog注释，结合pfam数据库结构域比对等生物信息学分析，筛选出有潜在桃胶多糖降解功能的基因orf00578，从而进行基因重组、克隆、纯化表达，并进行后续功能研究。
46.实施例1桃胶多糖降解相关酶编码基因orf-00578的克隆及重组质粒的构建
47.一、方法
48.1、pcr引物的设计
49.根据微杆菌基因组测序得到的orf 00578基因序列，使用软件primerpremier 5.0设计pcr引物，引物序列如下表1所示。引物交给上海生工生物工程公司合成。
50.表1
[0051][0052]
2、pcr反应
[0053]
(1)以微杆菌基因组dna作为pcr模板，按下表2所示加入各组分，混匀；
[0054]
表2
[0055][0056][0057]
(2)设置以下程序进行pcr反应
[0058]
pcr反应条件：98℃预变性10min；98℃变性45sec，55℃退火40sec， 72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸8min。
[0059]
(3)将pcr反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。
[0060]
3、使用dna凝胶回收试剂盒进行pcr产物凝胶回收。
[0061]
4、双酶切
[0062]
(1)将pcr凝胶回收产物按表3配制双酶切反应体系
[0063]
表3
[0064][0065]
(2)载体质粒双酶切体系
[0066]
表4
[0067][0068]
(3)上述体系各组分加入并混合均匀后，放置在37℃恒温水浴锅中孵育，酶切2h。
[0069]
(4)酶切结束后，短暂离心将管壁管盖上的液体甩下。用dna产物纯化试剂盒纯化。
[0070]
5、使用pcr产物回收试剂盒进行酶切产物纯化
[0071]
6、连接
[0072]
(1)pcr产物和载体的连接体系如下表5所示：
[0073]
表5
[0074][0075]
(2)将上述各组分加入pcr管中混匀，放入25℃金属浴连接仪中连接2h。
[0076]
7、制备大肠杆菌dh5α感受态细胞。
[0077]
8、转化。
[0078]
9、挑取单克隆。
[0079]
10、按照天根质粒小提试剂盒进行质粒抽提。
[0080]
11、双酶切鉴定
[0081]
(1)重组质粒进行双酶切，按照下表6加入各组分：
[0082]
表6
[0083][0084]
(2)往pcr管中加入上述组分，混合均匀，37℃水浴锅中酶切1h。
[0085]
(3)酶切产物用1％琼脂糖凝胶，以电压180v条件琼脂糖凝胶电泳20min。
[0086]
(4)电泳结束后将凝胶放在凝胶成像仪观察并拍照记录。符合预期分子量大小的质粒样品送生工生物测序。
[0087]
(5)测序结果通过ncbi序列比对，确认测序结果。
[0088]
12、将目的质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)中。
[0089]
二、结果
[0090]
使用细菌基因组快速提取试剂盒提取微杆菌microbacterium sp.china基因组dna，pcr扩增目的基因orf-00578，orf-00578pcr产物经琼脂糖电泳分离后结果与预期相符，如图1-a所示；orf-00578pcr产物经核酸内切酶处理后，用核酸连接酶连接到pet22b(+)载体上，分别转化至大肠杆菌dh5α中保存和 bl21中表达，并提取质粒双酶切鉴定，鉴定质粒是否目标产物。如图1-b所示，电泳结果显示双酶切的结果与实验预期结果相符，并将质粒样品送往上海生工进行序列测定验证，测序的具体结果与预期相符，所述orf-00578的核苷酸序列如 seq id no：1所示，其编码的氨基酸序列如seq id no：2所示。
[0091]
实施例2桃胶多糖降解相关酶编码基因orf-00578重组质粒的表达分析
[0092]
1、重组大肠杆菌bl21生长曲线测定，测得大肠杆菌bl21(de3)的对数生长期在喂养时间为2～2.5h之间，所对应的a600nm为0.5～0.8之间，故选择该时间段为后续iptg诱导起点。
[0093]
2、诱导表达重组目的蛋白
[0094]
(1)将大肠杆菌bl21表达菌以及质粒空载菌，按1％接种量接种至含有对应抗生素(kan)液体lb培养基中，以37℃，220rpm条件在恒温摇床中震荡培养活化过夜。
[0095]
(2)次日，将转接菌液按1％转接至新鲜lb培养基中，培养至分光光度计检测到大肠杆菌的od
600
值为0.5～0.6时，加入适量的iptg，使其终浓度为0.3mm，在恒温培养箱中以37℃，220rpm条件诱导培养6h。
[0096]
(3)诱导培养结束后，每种培养液分别拿两支1.5ml离心管，各取1ml菌液，室温10000rpm离心1min，收集菌体。
[0097]
(4)往其中离心管加入1mlpbs缓冲液，重悬菌体后10000rpm离心1min，去上清，清洗菌体。重复三次后均加入500mlpbs重悬菌体。
[0098]
(5)其中一支离心管直接加入125ml 5
×
sds-page loading buffer，吹打均匀后99℃金属浴中加热10min，使蛋白完全变性。-20℃冰箱保存备用。
[0099]
(6)另一只离心管放置在冰上，利用超声波细胞破碎仪超声破菌。超声破菌条件为400w工作3s，间隙3s，直至菌液变得澄清透亮时停止破菌。破菌结束后，放入预冷离心机中4℃，10000rpm离心10min。离心结束后，转移上清液至另一洁净ep管，加入500μl pbs缓冲液重悬沉淀。往两支离心管中均加入125μl 5
×
sds-page上样缓冲液。用移液器吹打均匀后，99℃金属浴中加热10min，使蛋白完全变性，sds-page电泳。
[0100]
结果：将重组大肠杆菌接种至含千分之一amp的新鲜培养基中，待a600 值达到0.5～0.8时，往其中加入适量的iptg使其终浓度达到0.3mm，随后在 16℃的恒温震荡培养箱中，220rpm分别诱导培养12h。培养结束后收集菌体，经超声波破碎或高压均质后收集上清和沉淀样品，样品经sds-page分离，并用考马斯蓝染色法显示观察电泳结果。如图2所示，在16℃的培养条件中，目的蛋白00578则大多是以可溶性的形式表达，可在上清样品中得到检测。后续实验可优化表达条件，以获得可溶性表达量最高的诱导培养条件。
[0101]
3、重组蛋白的western-boltting鉴定
[0102]
将步骤2诱导表达重组目的蛋白进行western-boltting鉴定，利用重组蛋白的his-tag通过western-blotting鉴定该重组蛋白，结果如图3所示，在重组菌的全细菌裂解液，裂解液上清和沉淀中均检测出重组蛋白00578，其中在上清液中蛋白量较多，且对照组均未检测出来，与sds-page结果一致，证明重组蛋白 00578表达成功。
[0103]
4、诱导表达重组蛋白条件优化
[0104]
根据sds-page结果判断重组蛋白是否以包涵体形式表达：如果在 sds-page电泳结果中，破菌沉淀样品显示出目的条带，则判断该蛋白为包涵体表达；若破菌上清样品中出现目的条带，认为该蛋白为可溶性表达。
[0105]
(1)诱导温度的优化：按照诱导表达重组蛋白的实验方法操作，加入适量的iptg使终浓度达到0.3mm后，分别在17，22，27，32，37℃的温度下在恒温培养箱中，诱导培养6h，设置不加iptg的阴性对照。收获蛋白样品后使用 sds-page来检测蛋白的相对含量，对比各个条件确定重组蛋白表达时最佳的诱导温度。
[0106]
结果：将00578重组菌株分别在17℃，22℃，27℃，32℃，37℃的恒温震荡培养箱中以终浓度为0.3mm的iptg诱导培养12h，sds-page检测重组蛋白表达量。如图4所示，27℃时上清样品中所检测到的可溶性样品最多，确定27℃为最佳诱导温度。
[0107]
(2)诱导时间的优化：按照诱导表达重组蛋白的实验方法操作，加入适量的iptg使达到终浓度为0.3mm后以最佳诱导温度分别诱导培养不同时间(如果最佳诱导温度为37℃，那么诱导培养时间分别设置为0h，2h，4h，6h，8h， 10h；如果最佳温度在30℃以下，那么诱导培养时间分别设置为0h，4h，8h， 12h，16h，20h)。收获蛋白样品之后，使用sds-page检测蛋白的相对含量，通过对比各个条件的蛋白量来确定重组蛋白表达最佳的诱导时间。
[0108]
结果：将00578重组菌株放置于27℃的恒温震荡培养箱中以终浓度为0.3mm 的iptg分别诱导培养4，8，12，16，20小时，sds-page检测重组蛋白表达量。结果如图5所示，12h时上清样品中所检测到的可溶性样品较多且后续的表达量变化不大，确定12h为最佳诱导时间。
[0109]
(3)诱导剂浓度的优化：按照诱导表达重组蛋白的实验方法操作，分别加入适量的
iptg使终浓度到达0mm，0.1mm，0.2mm，0.3mm，0.4mm，0.5mm 后，以最佳的诱导温度诱导培养最佳诱导时间，收获蛋白样品后使用sds-page 检测蛋白的相对含量，通过对比各个条件的蛋白量来确定重组蛋白表达最佳的诱导剂浓度。
[0110]
结果：将00578重组菌株在27℃的恒温震荡培养箱中诱导培养12h，设置诱导剂iptg终浓度分别为0.1，0.3，0.5，0.7，0.9mm。sds-page检测重组蛋白表达量。结果如图6所示，加入终浓度为0.3mm时上清样品中所检测到的可溶性样品较多，确定0.3mm为最佳诱导剂浓度。
[0111]
(4)重组菌株的扩大培养：按照确定好的最佳表达条件，诱导培养重组大肠杆菌表达菌，培养液的扩大培养的终体积为500ml。培养结束后分装到50ml 离心管中，放入离心机室温8000rpm离心5min后取出，倒去上清液。剩余的菌体沉淀加入适量的pbs缓冲液重悬后，放入离心机室温8000rpm离心5min。离心结束后，倒去上清。清洗步骤需重复三次以确保去除多余的培养基，菌体沉淀可进行后续实验或-20℃存放备用。
[0112]
(5)高压均质细菌破碎：取清洗过的菌体，加入约70ml含有10mm咪唑的细菌裂解液，充分重悬菌体，不可留有块状菌体。开启低温冷却液循环泵预冷至-10℃，组装好进样杯，打开高压均质机，设置循环功率为50hz。按顺序逐一加入乙醇，超纯水，细菌裂解液，达到清洗，浸润通道的目的。待上述组分流出后，往加样杯中倒入细菌悬液，出样管放进加样杯使其循环流动，排出通道中所有空气。开启压力计，缓慢地小心扭动加压阀，使压力慢慢上升到800-900bar，均质数分钟，直到杯中液体澄清透亮，可观察到进样孔为止。收集破碎菌液，0.45 μm滤膜过滤，4℃存放或直接进行后续实验。
[0113]
5、重组蛋白的镍亲和层析纯化条件研究
[0114]
(1)用玻璃棒搅拌重悬ni-nta superflow，将其缓缓引流入洁净的空层析柱中，待其慢慢沉降，形成固定相柱体，并不断加入30％乙醇防止干柱。
[0115]
(2)平衡：用恒流泵把平衡液以3ml/min流速平衡预装好的镍亲和层析柱，平衡液用量约为2～3个柱体积。
[0116]
(3)上样：用恒流泵把样品以1ml/min流速上样，上完样品后继续平衡，到蛋白检测仪检测到蛋白时，开始收集穿出液，直到基线平稳。
[0117]
(4)洗涤：用恒流泵把洗涤液以3ml/min流速洗涤镍亲和层析柱，收集洗涤液，直到基线平稳。
[0118]
(5)洗脱：用恒流泵把洗脱液以3ml/min流速洗涤镍亲和层析柱，收集洗脱液，直到基线平稳。
[0119]
(6)清洗：用恒流泵把清洗液以3ml/min流速清洗镍亲和层析柱，清洗 2-3个柱体积。
[0120]
(7)保存：用恒流泵把30％乙醇以3ml/min流速清洗镍亲和层析柱，清洗 2-3个柱体积后关闭柱子进出口，4℃冰箱保存。
[0121]
(8)将纯化前样品，穿出液，洗涤液，洗脱液各取一部分，加入适量5x sds 上样缓冲液进行sds-page，检测各组分的蛋白含量以此判断纯化效果。
[0122]
(9)因电泳验证的纯化效果不甚理想，往所有的纯化体系(包括细菌裂解液，平衡液，洗涤液和洗脱液)中加入5m尿素使蛋白变性，暴露出his-tag与 ni-nta结合从而达到好的纯化效果，洗脱液经透析后使用sds-page检测。
[0123]
结果：使用ni-nta层析柱以镍离子亲和层析的方法纯化重组蛋白00578。在纯化时，首先未加入变性剂，让其以天然构象的形式下进行镍离子亲和层析的方法纯化。但00578的天然构象均未与镍填料结合，目的蛋白并未从样品中分离出来，见图7。因此对纯化方法进行优化，在纯化体系中各试剂中加入5m尿素，使重组蛋白的his-tag暴露出来，从而让其与层析柱上的镍填料结合。结果如图 8，目的蛋白00578能从样品中分离出来纯化目的。
[0124]
6、目标蛋白的质谱鉴定
[0125]
将得到的纯化蛋白经sds-page分离后用考马斯蓝染色法显示，根据分子量标准把含有目的条带的凝胶样品用刀切割下来，将其送往深圳华大基因科技有限公司进行蛋白胶点质谱鉴定。鉴定是通过将sds-page胶点经过胰酶处理，萃取蛋白，得到的肽段经高效液相分离后进行质谱检测，得到质量谱图，并运用蛋白质鉴定软件鉴定蛋白。
[0126]
其测到的肽段序列和鉴定结果如表7所示。00578可以匹配到数据库中 microbacterium sp.str.'china'的对应蛋白。证实我们纯化得到的重组蛋白正是我们设计表达的目的蛋白，说明重组蛋白表达纯化成功。00578对应的肽段质谱图如图9所示。
[0127]
表7 00578蛋白的lc-ms/ms鉴定结果
[0128][0129]
实施例3 00578目的蛋白的多糖水解功能验证
[0130]
1、dns显色法测定还原糖标准曲线的制作
[0131]
(1)取6支ep管依次编号；
[0132]
(2)分别加入不同浓度标准葡萄糖溶液各200μl，其浓度分别为0、0.1 mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml；
[0133]
(3)加入100μl 3,5-二硝基水杨酸试剂并摇匀；
[0134]
(4)沸水浴中加热5min，水浴结束后立即取出冷却，540nm处测定各体系吸光值变化；
[0135]
(5)根据吸光值和还原糖溶液浓度绘制标准曲线。
[0136]
2、dns显色法测定阿拉伯半乳糖苷酶的酶活力
[0137]
往pcr管中加入40μl 6％桃胶溶液和40μl粗酶溶液(即重组细菌裂解液上清)，同时设置对照组，(空白对照组加入等量桃胶溶液和ddh2o)，在恒温孵育器中以37℃保温孵育一定时间。随后加入40μl 3,5-二硝基水杨酸试剂并摇匀，沸水浴中加热5min，水浴结束后立即取出冷却，取100μl在550nm处测定吸光值。将各组吸光值减去空白对照组吸光值后代入标准曲线计算还原糖产量。
[0138]
结果如图10所示：过表达重组桃胶多糖降解酶00578的重组菌裂解液均可以降解桃胶释放出还原性糖或还原性寡糖链，这说明构建的基因工程菌可以过表达具有桃胶降解活性的重组酶。
[0139]
实施例4基因重组桃胶多糖水解酶00578的酶学性质研究
[0140]
由于桃胶多糖结构复杂，聚合度不一，即使同一批产品之间的成分和结构都可能有较大差异，而酶学性质研究需要使用成分清晰，质量稳定的底物进行定量实验。因此本实施例使用人工合成的糖苷结构类似物对硝基苯基-β-d-吡喃半乳糖苷(p-nitrophenyl-β-d-galactopyranoside,pnpgal)取代桃胶多糖，对重组酶水解糖苷键类型进行初步研究。
[0141]
1、基因重组桃胶多糖水解糖苷键特异性分析
[0142]
往pcr管中分别加入90μl的1m pnpgal(对硝基苯半乳糖苷)，1m pnpara (对硝基苯阿拉伯糖苷)和1m pnpglu(对硝基苯葡萄糖苷)，并加入10μl的酶，以加入10μl去离子水作为对照组，酶和底物混合后，在酶的最适条件下反应15min。孵育结束后，加入1.5倍体积的1m碳酸钠溶液终止反应，随后取2μl 反应液，tlc分离底物和产物，以测定酶的底物特异性。
[0143]
tlc方法：以正丁醇：乙酸：水＝2：1：1(体积比)为展开剂，以铝箔板上的硅胶g254为固定相，点样后在层析缸中展开。展开结束后，取出铝箔板，喷洒二羟基萘的硫酸乙醇溶液配制的显色液，110℃加热3～5min显色。
[0144]
结果：通过选择pnpgal、pnpara和pnpglu三种糖苷化合物作为酶水解糖苷键特异性实验的底物，用以确定00578是否能够水解该类人工糖苷底物。通过薄层层析水解实验分离产物，结果如图11所示，00578可作用于半乳糖苷和阿拉伯糖苷，降解pnpgal和pnpara，释放出gal和ara，但是对葡萄糖苷不起作用没有释放出葡萄糖。说明00578有阿拉伯半乳糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性。因为桃胶多糖主链主要由半乳聚糖构成，因此后续实验使用pnpgal作为底物探究00578的一些酶学性质。
[0145]
2、温度对基因重组桃胶多糖水解酶活性及稳定性的影响
[0146]
最适温度测定：往pcr管中加入99μl的1m pnpgal和1μl的酶，分别在 15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃中孵育15min，每组设置三个重复。孵育结束后，加入1.5倍体积的1m碳酸钠溶液终止反应，随后取100μl混合液测量a405nm，记录数据并绘制曲线。对比各个温度的酶活力，或得到最适温度，并以此作为后续实验的温度条件。
[0147]
温度稳定性测定：将酶先分别在15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃， 45℃，50℃，55℃，60℃中预孵育2h，4h，6h，8h，10h。之后往pcr管中加入99μl的1m pnpgal和1μl预孵育过的酶，在最适温度中孵育15min，每组设置三个重复。孵育结束后，加入150μl 1m碳酸钠溶液以终止反应及显现颜色，随后取100μl混合液测量a405nm，记录数据，分析结果并绘制曲线。
[0148]
结果：温度对00578酶活性的影响实验结果如图12所示，在30～50℃的温度范围之
间，两种酶对pnpgal的活力都能保持最佳活力的50％以上的活力， 00578的最适反应温度为40℃，后续实验均沿用这个最适温度。在30～50℃温度范围，00578在10h内都可以保持最高活力的60％以上的酶活力，但温度高于 60℃会导致酶迅速失活(图13)。
[0149]
3、ph值对基因重组桃胶多糖水解酶活性及稳定性的影响
[0150]
最适ph测定：往pcr管中加入99μl的1m pnpgal和1μl的酶，分别在 ph值为4，5，6，7，8，9，10中孵育15min，每组设置三个重复。孵育结束后，加入150μl 1m碳酸钠溶液终止反应及显示颜色，随后取100μl混合液测量 a405nm，记录数据并绘制曲线。测定得到的最适ph作为后续实验的温度条件。
[0151]
ph稳定性测定：将酶先在ph为4，5，6，7，8，9，10缓冲液中4℃预孵育2h，4h，6h，8h，10h。之后往pcr管中加入99μl的1m pnpgal和1μl 预孵育过的酶，在最适温度和ph中孵育15min，每组设置三个重复。孵育结束后，加入1.5倍体积的1m碳酸钠溶液终止反应，随后取100μl混合液测量 a405nm，记录数据并绘制曲线。
[0152]
结果，如图14所示，00578酶对pnpgal的活性的ph范围为6～10，00578 酶活最适ph为6；00578在ph值6～10之间均能保持70％以上的酶活力，ph 低于6时这会失活(图15)，因此在该酶在保存或后续实验中都应该避免酸性条件以防止失活。
[0153]
4、金属离子及其螯合剂对重组桃胶多糖水解酶活性的影响
[0154]
往pcr管中加入99μl的1m pnpgal，并使不同金属离子或金属离子螯合剂(na
+
，k
+
，ca
2+
，mg
2+
，zn
2+
，fe
3+
，ni
2+
和edta)的终浓度为10mmol/l，在最适条件下孵育15min每组设置三个重复。孵育结束后，加入1.5倍体积的 1m碳酸钠溶液终止反应，随后取100μl混合液测量a405nm，记录数据并制作图表。
[0155]
结果：部分糖苷水解酶需要金属离子作为酶的激活剂提高酶活性，通过挑选了几种常见的金属离子，用于测定其对00578酶活力的影响。结果如图16所示，金属离子zn
2+
，fe
3+
，ni
2+
，ca
2+
，mg
2+
和edta会抑制00578pnpgal的活力，其中zn
2+
，fe
3+
，ni
2+
和edta的抑制效果尤为明显(只保留7％～21％)，然而 k
+
和na
+
可稍微提高04147的酶活力。这些结果说明无论是00578，应避免与zn
2+
， fe
3+
，ni
2+
和edta一起使用，但钾离子和钠离子可以考虑在两种酶的保存或应用中用于维持生理离子浓度。
[0156]
5、重组桃胶多糖水解酶酶学动力学参数的测定
[0157]
配制一定梯度浓度的pnpgal溶液(0.6，1.2，1.8，2.4，3)mmol/l，往pcr 管中分别加入90μl的pnpgal，并加入10μl的酶，在酶的最适条件下反应15min，每组设置三个重复。孵育结束后，加入150μl 1m碳酸钠溶液终止反应，随后取 100μl混合液测量a405nm。定义每毫升酶液在单位时间内降解桃胶，并且产生 1μmol还原糖所需要酶的量作为一个酶活力单位(u)，最后通过双倒数作图法 (lineweaver-burk法)来计算酶的动力学参数。
[0158]
结果：酶反应动力学参数包括是酶催化的反应速度以及影响反应速度的各种因素。我们定义每毫升酶液在单位时间内降解桃胶，并且产生1μmol还原糖所需要酶的量作为一个酶活力单位(u)，最后通过双倒数作图法(lineweaver-burk法) 来计算酶的动力学参数。通过研究pnpgal的浓度对酶活性影响计算出来的，实验结果如图17和表8所示，图17为00578的米氏方程双倒数图，表8为其酶动力学参数。00578对pnpgal的最大反应速率vmax为6.188(μmol min-1
ml-1
)，米氏常数km为0.402(mm)，反应常数和米氏常数之比kcat/km为 10.856(s-1mm-1)。
[0159]
表8 00578的酶促动力学参数
[0160][0161]
实施例5基因重组桃胶多糖水解酶00578对桃胶底物的降解效果测试
[0162]
dns显色法测定00578降解桃胶产生带还原端糖基多糖片段的效能力
[0163]
往pcr管中加入40μl 6％桃胶溶液和40μl水解酶00578溶液(10mg/ml)，同时设置对照组，(空白对照组加入等量桃胶溶液和ddh2o)，在恒温孵育器中以37℃保温孵育6小时。随后加入40μl 3,5-二硝基水杨酸试剂并摇匀，沸水浴中加热5min，水浴结束后立即取出冷却，取100μl在550nm处测定吸光值。将各组吸光值减去空白对照组吸光值后代入标准曲线计算还原糖产量。酶活力单位定义(u)：在30℃，每毫升酶液单位时间内降解桃胶产生1μg还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(u)。酶的比活力(specific activity)：是指每毫克质量蛋白质中所含的酶活力单位(u)。
[0164]
结果：基因重组桃胶多糖水解酶00578有降解桃胶产生带还原端糖基多糖片段的活性(图18)。用离子色谱法对00578降解桃胶的产物进行了分析，结果显示水解产物中有阿拉伯糖、半乳糖、木糖、甘露糖、果糖以及半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等成分，说明00578具有裂解桃胶获得不同类型还原糖的能力，结果如图 19所示。用dns还原糖法检测到00578酶活力为8.09u/mg，原始菌株裂解液对桃胶降解的酶比活力仅为1.01u/mg，重组酶比活力明显提高。
[0165]
实施例6基因重组桃胶多糖水解酶00578对阿拉伯低聚半乳糖的降解效果测试
[0166]
1.5ml ep管中加入浓度为20mg/ml的阿拉伯低聚半乳糖0.5ml和20mg/ml 的酶溶液0.5ml，加样结束后用封口膜封好(整个操作在超净台中进行)，样品放入摇床中40℃孵育12小时，孵育结束后样品离心(10000
×
g；时间10min)，将上清转移到新的ep管中，并用sevage法脱蛋白，冷冻干燥去除有机溶剂；进行离子色谱分析，色谱条件为：离子色谱仪型号：dionex ics-3000(美国戴安公司)；
[0167]
色谱柱：dionexcarbopac pa10分离柱(4mm
×
250mm)；au电极，脉冲安培检测，agcl参比模式，糖标准四电位波形；流动相梯度洗脱：单糖淋洗液：水:naoh＝96％:4％，naoh浓度为250mmol/l；醛酸淋洗液：naoh:naac＝1:1，浓度均为250mmol/l；色谱结果与系列单糖和双糖标准品色谱峰进行比对鉴定样品组成。
[0168]
结果：以阿拉伯低聚半乳糖为底物，分析其降解产物，实验结果如图20所示。整个分析过程样品体系只出现了一个明显的色谱峰，该糖类物质在系统中的保留时间为5.583min，为阿拉伯糖，产物中无醛酸类物质。阿拉伯低聚半乳糖为阿拉伯糖和半乳糖通过不同类型糖苷键形成的中性多糖，具有多分支结构，在β-1,3或β-1,6-糖苷键的半乳糖链中接有β-1,3-糖苷键的阿拉伯糖侧链，此次实验酶解产物检测到了阿拉伯糖，说明重组00578蛋白酶可降解阿拉伯低聚半乳糖侧链的β-1,3-糖苷键，获得阿拉伯糖。
[0169]
实施例7基因重组桃胶多糖水解酶00578对半乳聚糖的降解效果测试
[0170]
1.5ml ep管中加入浓度为20mg/ml的半乳聚糖0.5ml和20mg/ml的酶溶液0.5ml，加样结束后用封口膜封好(整个操作在超净台中进行)，样品放入摇床中40℃孵育12小时，孵育结束后样品离心(10000
×
g；时间10min)，将上清转移到新的ep管中，并用sevage法脱蛋
白，冷冻干燥去除有机溶剂；进行离子色谱分析，色谱条件为：离子色谱仪型号：dionex ics-3000(美国戴安公司)；色谱柱： dionexcarbopac pa10分离柱(4mm
×
250mm)；au电极，脉冲安培检测，agcl 参比模式，糖标准四电位波形；流动相梯度洗脱：单糖淋洗液：水:naoh＝96％:4％， naoh浓度为250mmol/l；醛酸淋洗液：naoh:naac＝1:1，浓度均为250mmol/l；色谱结果与系列单糖和双糖标准品色谱峰进行比对鉴定样品组成。
[0171]
结果：以半乳聚糖作为底物分析其产物分布，底物降解前单糖和醛酸离子色谱分析结果如图21-a所示，系统1.5min之前走基线，基线较为平稳， 1.5min～3.0min出现溶剂峰，3.5min后没有检测出色谱峰且基线走势平稳。可以得出结论所选用的低聚半乳糖样品纯度较高没有单糖及双糖杂质。底物降解后实验结果如图21-b，低聚半乳糖降解后单糖色谱检测体系中出现了一个色谱峰，该产物在系统中保留时间为7.557min，比对7种阿拉伯糖、半乳糖、木糖、甘露糖、果糖以及半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等单糖及双糖标准品保留时间，该产物为非以上7种标准品；醛酸色谱检测结果显示降解产物中无醛酸类物质；实验中我们所使用的低聚半乳糖为4个糖原通过β-1,4糖苷键连接，只有单糖、双糖和醛酸能用离子色谱检测出信号峰，因此证明此次实验中低聚半乳糖的降解产物应为一种双糖聚体二聚半乳糖，所以说明00578重组酶能以内切的形式降解β-1,4半乳糖苷键。