一种促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株及构建方法及应用

1.本发明属于希瓦氏菌胞外电子转移的研究领域。具体地涉及一种可以促进生物膜形成并提高胞外电子转移能力的菌株及构建方法及应用


背景技术：

2.shewanella oneidensis mr
‑
1是一株重要的模式菌株，具有金属还原能力，能够在固体物质表面形成生物膜，实现微生物和胞外环境如电极之间的胞外电子传递，在环境修复、纳米材料的生物合成和生物发电等方面有着巨大的应用前景。这种生物膜具有电化学活性，可直接与胞外固态物质(腐殖质、金属氧化物或电极等)进行电子交流，既可将微生物消耗有机碳化合物产生的电子传递到电极表面，也能从周围环境中获得能量用于维持自身的生长。正是由于生物膜的这些特性，目前与生物膜相关研究已经被广泛关注。
3.电活性生物膜的形成过程可以分为四个阶段：阶段一涉及细胞与电极表面的可逆附着。即电极附近微环境的离子强度，渗透压，ph和营养条件等均不同于液体环境，浮游的细菌细胞识别出将要附着的电极表面并启动附着过程。首先细菌细胞表面会表现出理化性质的改变；随后，细菌细胞的鞭毛和菌毛先后进行附着，鞭毛和菌毛不仅增强与电极表面的粘附，同时起信号传递作用，促进胞内第二信使的产生，使细菌胞内对这种粘附做出响应；在起始附着阶段后期，基于酸碱作用力、范德华力、静电力等作用下，菌体在接触电极表面后引起细胞膜形变，最终完成与电极表面的可逆附着。在生物膜形成的第二阶段，在群体感应信号分子的表达和细胞外聚合物的形成介导下，细菌细胞不可逆地附着在基质表面。第三阶段涉及形成具有三维结构的成熟生物膜，该生物膜包含堆积成簇的细胞，簇之间具有通道，允许水和养分的运输以及代谢废物的排出。在阶段四，细菌细胞生物膜逐渐分离和分散，并开启新的生物膜形成。分散的细胞在形态上更类似于浮游细胞，并非成熟的生物膜细胞，浮游细胞对于再次发展成新的生物膜至关重要。
4.在自然条件下的电活性生物膜往往表现出厚度薄、生物量少以及结构不稳定等缺点，进而导致胞外电子传递效率低下。生物膜工程改造可以用来克服与电活性生物膜性能相关的限制。例如，控制生物膜厚度、维持ph值和营养物质在生物膜基质内的均匀分布，以维持细胞的生理状态和生物膜内的电梯度。近年来，对改善电极生物膜的成分、电子传递效率和厚度等进行了研究。如通过在s.oneidensis mr
‑
1中过表达来自大肠杆菌的c
‑
di
‑
gmp生物合成基因ydeh，增强了胞内第二信使c
‑
di
‑
gmp的表达，进而促进了生物膜的形成和胞外电子传递，此外，也有一些研究表明，通过敲除一些调控希瓦氏菌细胞表面多糖和edna合成的基因可以提高其生物膜的形成，但是对于生物膜厚度和胞外电子传递效率改善仍然不是很理想。然而生物膜上菌体形态对生物膜形成影响从未被研究。目前通过调控菌体形态，更多的报道是改善生物基化学品合成方面，用于改善生物膜形成还未有报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种促进生物膜形成的希瓦氏菌菌
株。
6.本发明的第二个目的是提供一种促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株的构建方法。
7.本发明的第三个目的是提供一种促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株促进生物膜形成的应用。
8.本发明的第四个目的是提供另一种促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株。
9.本发明的第五个目的是提供另一种促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株的构建方法。
10.本发明的第六个目的是提供另一种促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株促进生物膜形成的应用。
11.本发明的技术方案概述如下：
12.一种促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株的构建方法，包括如下步骤：
13.(1)将编码抑制细胞分裂蛋白的基因sula连接在载体phg12
‑
lacuv5上，得到phg12
‑
lacuv5
‑
sula；
14.(2)将载体phg13
‑
tet
‑
ribabcde导入希瓦氏菌mr
‑
1中，得到菌株mr
‑
1/ptet5；
15.(3)将phg12
‑
lacuv5
‑
sula导入希瓦氏菌mr
‑
1/ptet5中，得到促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株mr
‑
1/ptet5/pl
‑
sula；
16.所述sula的核苷酸序列如seq id no.1所示；
17.所述载体phg12
‑
lacuv5的核苷酸序列如seq id no.2所示；
18.所述载体phg13
‑
tet
‑
ribabcde的核苷酸序列如seq id no.3所示。
19.上述方法构建的一种促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株。
20.上述一种促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株促进生物膜形成的应用。
21.另一种促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株的构建方法，包括如下步骤：
22.(1)将编码抑制细胞分裂蛋白的基因sula与启动子lacuv5连接，得到连接lacuv5的sula片段；
23.(2)将步骤(1)获得的连接lacuv5的sula片段连接在载体phg13
‑
tet
‑
ribabcde上，得到phg13
‑
tet
‑
ribabcde
‑
lacuv5
‑
sula；
24.(3)将phg13
‑
tet
‑
ribabcde
‑
lacuv5
‑
sula导入希瓦氏菌mr
‑
1中，得到促进生物膜形成的菌株mr
‑
1/ptet5
‑
sula；
25.所述sula的核苷酸序列如seq id no.1所示；
26.所述启动子lacuv5的核苷酸序列如seq id no.4所示；
27.所述载体phg13
‑
tet
‑
ribabcde的核苷酸序列如seq id no.3所示；
28.上述方法构建的一种促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株。
29.上述一种促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株促进生物膜形成的应用。
30.有益效果
31.本发明所构建的促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株mr
‑
1/ptet5/pl
‑
sula，在1mm iptg诱导下，48h的厌氧发酵，接种该工程菌的微生物燃料电池(mfcs)的阳极生物膜的生物量为509μg，是对照菌株mr
‑
1/ptet5(274μg)的～1.8倍，电功率密度为1414mw/m2，是对照菌株mr
‑
1/ptet5(707mw/m2)的～2倍，不仅促进了生物膜的形成，还提高了eet能力。
32.本发明所构建的促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株mr
‑
1/ptet5
‑
sula，在1mm iptg诱导下，48h的厌氧发酵，接种该工程菌的微生物燃料电池(mfcs)的阳极生物膜的生物量为
473μg，是对照菌株mr
‑
1/ptet5(274μg)的～1.7倍，电功率密度为998mw/m2，是对照菌株mr
‑
1/ptet5(707mw/m2)的～1.4倍，不仅促进了生物膜的形成，还提高了eet能力。
附图说明
33.图1为phg12
‑
lacuv5
‑
sula载体的图谱。
34.图2为phg13
‑
tet
‑
ribabcde
‑
lacuv5
‑
sula载体的图谱。
35.图3为促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株的电功率密度曲线。
36.图4为促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株的阳极生物量的测定。
具体实施方式
37.下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。
38.本发明所用到的原始菌株希瓦氏菌shewanella oneidensis mr
‑
1来源为atcc保藏菌株(atcc 700550)。网址：https://www.atcc.org/products/all/700550.aspx#generalinformation，购买日期：2019年7月。
39.实施例1
40.一种促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株的构建方法，包括如下步骤
41.(1)将编码抑制细胞分裂蛋白的基因sula连接在载体phg12
‑
lacuv5上，得到phg12
‑
lacuv5
‑
sula，操作流程如下：
42.以shewanella oneidensis mr
‑
1基因组作为模板，以sula
‑
1和sula
‑
2为引物(见表1)进行pcr扩增，扩增sula基因片段(seq id no.1)，以phg12
‑
lacuv5质粒(seq id no.2)为模板，以phg12
‑
1和phg12
‑
2(见表1)为引物，进行pcr扩增线性化载体。最后将线性化载体片段phg12
‑
lacuv5和sula进行连接得到载体phg12
‑
lacuv5
‑
sula。测序检测无误。最终的质粒图谱如图1所示。
43.(2)将载体phg13
‑
tet
‑
ribabcde电转导入希瓦氏菌mr
‑
1中，得到菌株mr
‑
1/ptet5，操作流程如下：
44.将
‑
80℃冻存的菌株mr
‑
1在lb固体培养基上培养至长出单菌落，挑取单菌落接种到装有5ml lb液体培养基的试管中，在30℃、200rpm培养12h。以1％的接种量接种到装有100ml lb液体培养基的500ml三角瓶中，在30℃、200rpm培养大约2h，至od
600
为0.4
‑
0.6。将三角瓶取出置冰上冷却10min，然后将菌液转移至预冷的100ml离心管中，4℃离心收集菌体，再用1m山梨醇洗三次，然后用1ml1m预冷的山梨醇重悬菌体，最后分装到预冷的1.5ml无菌ep管中，每管100μl，得到制备好mr
‑
1的感受态。向mr
‑
1感受态中加入phg13
‑
tet
‑
ribabcde(seq id no.3)，混匀后加入电击杯中，使用micropulser(bio
‑
rad公司)电穿孔仪在1.2kv条件下电击4.5ms，电击后迅速加入800ml lb液体培养基，然后在30℃、200rpm复苏培养3h。复苏培养后，取100μl菌液涂布在含有终浓度为34μg/ml氯霉素抗性的lb固体培养基上，30℃培养至长出单菌落，用菌落pcr验证，得到质粒正确导入的菌株，命名为mr
‑
1/ptet5。
45.(3)将phg12
‑
lacuv5
‑
sula导入希瓦氏菌mr
‑
1/ptet5中，得到促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株mr
‑
1/ptet5/pl
‑
sula，操作流程如下：
46.将
‑
80℃冻存的菌株mr
‑
1/ptet5在含34μg/ml氯霉素抗性lb固体培养基上培养至长出单菌落，挑取单菌落分别接种到装有5ml含有34μg/ml氯霉素抗性的lb液体培养基的试管中，在30℃、200rpm培养12h。以1％的接种量接种到装有100ml含有34μg/ml氯霉素抗性lb液体培养基的500ml三角瓶中，在30℃、200rpm培养大约2h，至od
600
为0.4
‑
0.6。将三角瓶取出置冰上冷却10min，然后将菌液转移至预冷的100ml离心管中，4℃离心收集菌体，再用1m山梨醇洗三次，然后用1ml1m预冷的山梨醇重悬菌体，最后分装到预冷的1.5ml无菌ep管中，每管100μl，得到制备好mr
‑
1/ptet5的感受态。mr
‑
1/ptet5感受态中加入phg12
‑
lacuv5
‑
sula，混匀后加入电击杯中，使用micropulser(bio
‑
rad公司)电穿孔仪在1.2kv条件下电击4.5ms，电击后迅速加入800ml lb液体培养基，然后在30℃、200rpm复苏培养3h。复苏培养后，取100μl菌液涂布在含有终浓度为50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素抗性的lb固体培养基，30℃培养至长出单菌落，用菌落pcr验证，得到质粒正确导入的菌株，命名为mr
‑
1/ptet5/pl
‑
sula。
47.本发明中的菌株代号是为了方便描述，但不应理解为对本发明的限定。
48.实施例2
49.一种促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株的构建方法，包括如下步骤：
50.(1)将编码抑制细胞分裂蛋白的基因sula与启动子lacuv5连接，得到连接lacuv5的sula片段，操作流程如下：
51.以phg12
‑
lacuv5
‑
sula载体为模板，以lac
‑
1和lac
‑
2为引物(见表1)用于pcr扩增，扩增lacuv5
‑
sula片段；
52.(2)将步骤(1)获得的lacuv5
‑
sula片段连接在载体phg13
‑
tet
‑
ribabcde上，得到phg13
‑
tet
‑
ribabcde
‑
lacuv5
‑
sula，操作流程如下：
53.以phg13
‑
tet
‑
ribabcde(seq id no.3)质粒为模板，以phg13
‑
1和phg13
‑
2为引物(见表1)进行pcr扩增，扩增线性化载体。最后将线性化载体片段phg13
‑
tet
‑
ribabcde和lacuv5
‑
sula进行连接，得到phg13
‑
tet
‑
ribabcde
‑
lacuv5
‑
sula。测序检测无误。最终的质粒图谱如图2所示。
54.(3)将phg13
‑
tet
‑
ribabcde
‑
lacuv5
‑
sula导入希瓦氏菌mr
‑
1中，得到促进生物膜形成的菌株mr
‑
1/ptet5
‑
sula：
55.将
‑
80℃冻存的野生型mr
‑
1在lb固体培养基上培养至长出单菌落，挑取单菌落接种到装有5ml lb液体培养基的试管中，在30℃、200rpm培养12h。以1％的接种量接种到装有100ml lb液体培养基的500ml三角瓶中，在30℃、200rpm培养大约2h，至od
600
为0.4
‑
0.6。将三角瓶取出置冰上冷却10min，然后将菌液转移至预冷的100ml离心管中，4℃离心收集菌体，再用1m山梨醇洗三次，然后用1ml1m预冷的山梨醇重悬菌体，最后分装到预冷的1.5ml无菌ep管中，每管100μl，得到制备好mr
‑
1的感受态。向mr
‑
1感受态中加入phg13
‑
tet
‑
ribabcde
‑
lacuv5
‑
sula，混匀后加入电击杯中，使用micropulser(bio
‑
rad公司)电穿孔仪在1.2kv条件下电击4.5ms，电击后迅速加入800ml lb液体培养基，然后在30℃、200rpm复苏培养3h。复苏培养后，取100μl菌液涂布在含有终浓度为34μg/ml氯霉素抗性的lb平板上，30℃培养至长出单菌落，用菌落pcr验证，得到质粒正确导入的菌株，命名为mr
‑
1/ptet5
‑
sula。
56.本发明中的菌株代号是为了方便描述，但不应理解为对本发明的限定。
57.所述sula的核苷酸序列如seq id no.1所示；
58.所述启动子lacuv5的核苷酸序列如seq id no.4所示；
59.所述载体phg13
‑
tet
‑
ribabcde的核苷酸序列如seq id no.3所示；
60.表1菌株构建所用引物序列
[0061][0062]
实施例3生物电化学表征
[0063]
1.生物燃料电池制备
[0064]
1.1 mfcs预处理
[0065]
(1)碳布电极的预处理：根据实验要求裁剪碳布(阳极1cm
×
1cm，阴极2.5cm
×
3cm)，。用水冲洗三次，然后加入1m hcl水溶液，浸泡过夜，再用无菌水冲洗三次，然后向烧杯中加入纯丙酮，浸泡过夜(注意烧杯用塑料薄膜密封，防止丙酮挥发)。最后，用无菌水清洗碳布为除去丙酮，干燥后保存备用。
[0066]
(2)nafion 117质子交换膜的预处理：根据实验所需质子交换膜的大小，将质子交换膜切割成直径为5cm圆片，然后将切割好的质子交换膜放置在1m hcl水溶液中浸泡过夜，用无菌水冲洗三次，冲洗过程中应避免污染，再用无菌水浸泡，以防质子交换膜干燥，待用。
[0067]
(3)阳极液的制备：先于1l蓝盖瓶中制备好5
×
m9母液(30g na2hpo4和15g kh2po4,，2.5g nacl，5g nh4cl，加无菌水至1l)；取200ml 5
×
m9母液于另一干净的1l蓝盖瓶中，灭菌。在紫外线消毒过的超净工作台上，加入50ml lb培养基(酵母提取物5g/l、nacl 10g/l和胰蛋白胨10g/l)、10ml 20mm乳酸钠水溶液、1ml的0.1mm无菌cacl2水溶液、1ml的1m无菌mgso4水溶液、1ml的50mg/ml卡那霉素水溶液、1ml的34mg/ml氯霉素乙醇溶液、1ml的1mg/ml四环素水溶液和1ml的1m iptg水溶液。最后用无菌水补至1l。摇匀，放置备用。
[0068]
(4)电解液的制备：称取24.693g k3[fe(cn)6]、13.063g k2hpo4和10.207g kh2po4置于大烧杯中，加蒸馏水至1.5l，用干净的玻璃棒搅拌，摇匀，超声溶解完全，置于超净工作台上备用。
[0069]
1.2菌株培养
[0070]
将工程菌株mr
‑
1/ptet5，mr
‑
1/ptet5
‑
sula各取1ml加入100ml含有34μg/ml氯霉素抗性的lb液体中，置于30℃，200rpm摇床中培养12h，之后将细胞悬浮液浓度调节到同一水平(od
600
值等于0.7)并分别分装到制备好的微生物燃料电池的生物阳极，置于30℃培养箱中厌氧培养，48h进行生物电化学分析。
[0071]
将工程菌株mr
‑
1/ptet5/pl
‑
sula取1ml加入100ml含有50μg/ml卡那霉素抗性的lb液体中，置于30℃，200rpm摇床中培养12h，之后将细胞悬浮液浓度调节到同一水平(od
600
值
等于0.7)并分别分装到制备好的微生物燃料电池的生物阳极，置于30℃培养箱中厌氧培养，48h进行生物电化学分析。
[0072]
1.3生物电化学分析
[0073]
线性伏安法(lsv)曲线的测定，操作步骤如下：
[0074]
当mfcs的输出电压达到峰值并进入稳定期时，将电阻器与导线分开，并保持30分钟以稳定开路电压。当开路电压稳定时，将电化学工作站的绿色线夹夹在阳极室外的导线上，红色线夹夹在阴极室外的导线上，白色线夹夹在ag/agcl电极的红色线夹前面。
[0075]
设定扫描参数如下：
[0076]
初始电位(v)：
‑
0.87
[0077]
最终电位(v)：
‑
0.1
[0078]
初始扫描极化：positive
[0079]
扫描速率(v/s)：0.0001
[0080]
采样时间(v)：0.001
[0081]
静止时间(s)：30
[0082]
灵敏度(a/v)：1.e
‑
003
[0083]
1.4 lsv曲线扫描完成后，以.txt、.lsv格式文件保存到电脑中。
[0084]
1.5电化学分析结果如图3所示。在促进生物膜形成的希瓦氏菌菌株mr
‑
1/ptet5/pl
‑
sula和mr
‑
1/ptet5
‑
sula，电功率密度分别为1414mw/m2和998mw/m2，分别是是对照菌株mr
‑
1/ptet5(707mw/m2)的～2和～1.4倍，大大提高了eet的效率。
[0085]
实施例4阳极碳布上生物量的测定
[0086]
数据采集系统输出电压最高或略有下降时取样。在无菌工作台上，轻轻取下阳极室中的碳布电极(1cm
×
1cm)。剪刀用酒精灯火焰加热后冷却，将碳布切于5ml无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，pbs，ph＝7.2)中，旋紧盖子，避免细菌污染，旋涡2min，使碳布上的菌落完全悬浮于溶液中。96℃加热20min，冷却至室温用bca蛋白定量分析试剂盒测定碳布上的生物量，每次实验三次平行测定。接种mr
‑
1/ptet5/pl
‑
sula和mr
‑
1/ptet5
‑
sula的mfcs的阳极生物量分别为509μg和473μg，分别是对照菌株mr
‑
1/ptet5(274μg)的～1.8和～1.7倍。(见图4)。