一种检测alpha-synuclein蛋白的鼠单克隆抗体及其应用的制作方法

一种检测alpha
‑
synuclein蛋白的鼠单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明公开了一种检测alpha
‑
synuclein蛋白的鼠单克隆抗体及其应用，属于免疫学领域。


背景技术：

2.帕金森病(parkinson’s disease，pd)是一种渐进而又不可逆性的运动障碍神经系统退行性疾病，是中枢神经系统第二大常见的原发性神经退行性疾病，发病者以中老年人群为主，由多巴胺神经递质缺乏而引起一系列运动症状，以静止性颤动、肌肉紧张强直、运动迟钝缓慢、姿势步态异于正常为主要临床特点。对帕金森病的诊断主要根据患者所表现临床症状、体征，再结合患者对多巴胺能的反应性，综合性的进行诊断，所以往往只能发现中晚期病例，且容易漏诊和误诊。因此为达到早期干预和延缓病损，探索和发现一些敏感性高、特异性强的生物学指标用于pd的早期诊断已成为临床医学亟待解决的问题。
3.alpha
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突触核蛋白(alpha
‑
synuclein，as)是非beta淀粉样蛋白的前体蛋白，基因位于4q21.3
‑
q22，由6个外显子和若干个内含子组成，其编码的as由140个氨基酸组成，n端含有5
‑
7个不完全的重复序列(ktkegv共有基序)，是蛋白质的兼性区域；中央疏水区域(第61
‑
95位残基)含有非beta淀粉样成分结构域，是as聚集必须的成分。正常情况下as是以无规则卷曲的形式存在，在pd疾病中，错误折叠的as异常聚集、沉积，形成路易小体(lewybody)，并通过减少多巴胺释放，增加代谢产物，最终导致多巴胺能神经元变性，进而影响到pd的发生。as的异常折叠在帕金森病和其他突触核蛋白聚集障碍的发展中起着核心作用，因此as的变化被认为是能作为反应pd病理变化的潜在生物标志物
4.目前已有一些文献对pd病例和正常人群体液中as的含量变化进行了研究，但研究结果差异很大，不排除所用as抗体特异性的因素。本专利提供了一株能特异性识别细胞内源as蛋白的鼠单克隆抗体，具有极高的特异性。


技术实现要素：

5.为了克服上述不足，本发明公开了一种检测alpha
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synuclein蛋白的鼠单克隆抗体及试剂盒。
6.本发明人发现并鉴定了一种检测alpha
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synuclein蛋白的鼠单克隆抗体，命名为：3f6，能够能特异性识别细胞内源的alpha
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synuclein蛋白，具有极高的特异性。
7.更详细地，本发明还提供了下列技术方案：
8.一种检测alpha
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synuclein蛋白的鼠单克隆抗体，其重链可变区的氨基酸序列为seq id no：1，其轻链可变区的氨基酸序列为seq id no：2。
9.进一步地，本发明一种检测alpha
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synuclein蛋白的组合试剂，组合试剂中包括上述的鼠单克隆抗体。
10.进一步地，本发明还提供给了一种试剂盒或试纸条，包含所述鼠单克隆抗体及其他一些组合试剂。
11.所述组合试剂、试剂盒或试纸条还包含现有技术中常见的检测抗体的显色试剂，在此不做过多说明，另外，试剂盒中还可能包括其他添加物，诸如缓冲液、洗涤液等，试剂盒的成分以预定比例提供，各试剂的相对量适当地变化以使测定法灵敏度最大化。
12.本发明的有益效果是：
13.本发明提供了一株能特异性识别细胞内源as蛋白的鼠单克隆抗体，具有极高的特异性，可作为临床研究筛选的重要抗体试剂原料。
附图说明
14.图1是本发明实施例中4株结合his
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alpha
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synuclein重组蛋白的单克隆细胞株：分别为1b5、3f6、5a1、6h5；
15.图2是本发明实施例中4株单克隆抗体的sds
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page电泳检测纯度；
16.图3是本发明实施例中4株单克隆抗体的elisa检测结果；
17.图4是本发明实施例中4株单克隆抗体与sk
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n
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sh细胞，hepg2细胞的免疫化学染色反应。
具体实施方式
18.下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
19.实施例1：抗alpha
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synuclein蛋白单克隆抗体的制备
20.动物免疫
21.取4
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6周雌性balb/c小鼠三只，采用his
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alpha
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synuclein重组蛋白为免疫原蛋白，完全弗氏佐剂乳化后皮下多点注射，免疫剂量为100μg/只/次。免疫三次后断尾采血，his
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alpha
‑
synuclein重组蛋白作为检测抗原(2μg/ml)包被酶标板，梯度稀释法测定血清效价，od450为1.0时，血清效价应大于1:4w。选择血清效价最好的一只小鼠进行免疫加强，取脾融合。
22.细胞融合
23.按常规方法获得小鼠脾细胞，采用peg法与骨髓瘤细胞sp2/0进行融合，融合细胞数量比率为脾细胞：sp2/0＝1:5。将融合细胞重悬于hat完全培养基，分铺于96孔细胞培养板，37℃，5％co2恒温培养箱中培养。待杂交瘤细胞长至孔面积1/3以上时，取培养上清进行elisa检测。同时将杂交瘤细胞孔更换为新鲜hat完全培养基继续培养24h，取培养上清elisa重复检测。
24.阳性杂交瘤细胞筛选
25.采用间接elisa进行筛选：用alpha
‑
synuclein重组蛋白作为筛选原，2μg/ml浓度包被酶标板，4℃包被过夜；洗板机pbst洗涤三次，5％脱脂奶粉室温封闭2h；洗板机pbst洗涤三次，加入100μl杂交瘤细胞培养上清，37℃反应1h；洗板机pbst洗涤三次，加入羊抗鼠
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hrp二抗(sigma a2554，1:10000)，37℃反应1h；洗板机pbst洗涤三次，加入100μl tmb，37℃显色10min；加入50μl 2n h2so4终止反应；酶标仪od450nm处读数。测试结果以od450读数大于1.0为阳性。
26.单克隆细胞筛选
27.挑选阳性细胞孔，小心吹打制成细胞悬液，按白细胞计数方法准确计算出细胞悬液浓度，并通过系列稀释最终得到每毫升ht完全培养基中含有10个杂交瘤细胞。取一块96孔细胞培养板，每孔中加入100μl ht细胞悬液，即每孔理论应只含有一个细胞，37℃，5％co2恒温培养箱中培养。4天后取出并观察细胞团簇数(代表单细胞数)，板孔做好相应标记，同时更换1/2的新鲜ht完全培养基。一周后待细胞长至孔面积1/3以上时收取单细胞培养上清进行elisa检测。选择细胞生长状态好，阳性值强的细胞孔，转移至24孔培养48h后进行elisa重复检测。测试结果以od450读数大于1.5为阳性。若第一次未拿到阳性单细胞，则重复单细胞筛选过程。经过筛选，共获得4株结合his
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alpha
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synuclein重组蛋白的单克隆细胞株：1b5、3f6、5a1、6h5(如图1)。
28.单抗制备
29.选8
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10周龄的balb/c雌性小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡进行预处理。1
‑
2周后腹腔内接种单克隆细胞悬液，细胞用量为1x107个/只。一周后观察，待小鼠腹部明显膨大时，用注射器抽取腹水。1ml腹水液用pbs稀释4倍后，以protein a/g亲和柱层析法进行纯化。收集蛋白峰流出液，用磷酸盐缓冲液(pbs)透析处理后紫外分光光度计测定od280，计算抗体蛋白浓度，sds
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page电泳检测纯度，elisa检测抗体效价。其中sds
‑
page检测结果见图2：结果显示，4株单克隆抗体均能够得到有效的纯化，电泳纯度显示在90％以上。elisa检测结果见图3：以his
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alpha
‑
synuclein重组蛋白为检测抗原时，6h5效价最高，5a1效价最低。
30.实施例2：特异性识别细胞内源alpha
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synuclein蛋白的单克隆抗体筛选
31.采用的细胞株为：表达alpha
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synuclein的人神经母细胞瘤细胞sk
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n
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sh；以及来自于肝癌组织、不表达alpha
‑
synuclein的hepg2细胞。对这两株细胞进行免疫细胞化学染色实验。具体实验方法如下：
32.sk
‑
n
‑
sh，hepg2细胞分别接种于96孔细胞培养板中，37℃，5％co2培养24
‑
36h；去除培养基，pbs小心润洗两遍，4％多聚甲醛固定液室温固定15min；pbs润洗三次，每次3min；每孔加入100μl 1％triton x
‑
100，室温放置10min；pbs润洗三次，每次3min；每孔加入100μl 3％过氧化氢，室温处理10min，封闭内源性过氧化物酶；pbs润洗三次，每次3min；加入纯化的anti
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alpha
‑
synuclein鼠单克隆抗体，4℃孵育过夜；pbst润洗四次，每次3min；加入anti
‑
mouse igg(fc specific)
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peroxidase antibody(sigma a2554)(1:1000)二抗，37℃孵育1h；pbst润洗四次，每次3min；加入dab显色液(北京中杉金桥zli
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9017)，室温反应(反应时间不超过10min)，显微镜下观察显色结果，蒸馏水洗涤终止显色。
33.结果见图4：
34.单克隆抗体3f6仅与表达alpha
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synuclein蛋白的sk
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n
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sh细胞有免疫化学染色反应，而与不表达alpha
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synuclein蛋白的hepg2细胞并无免疫化学染色反应；1b5既与sk
‑
n
‑
sh有免疫染色反应，同时也与hepg2有较强的免疫染色反应；5a1和6h5与sk
‑
n
‑
sh和hepg2均无免疫染色反应。即四株单抗中，只有3f6能特异性识别细胞内源的alpha
‑
synuclein蛋白。
35.实施例3：单克隆抗体基因调取
36.参照invitrogen“trizol reagent”操作手册提取单克隆细胞株3f6的total mrna。参照fermantas“revertaid first strand cdna synthesis kit说明书进行反转录，并设计合成5’和3’端引物，用所得到的cdna为模板扩增单克隆抗体基因，反应条件：94℃，1min；94℃，30s；57℃，30s；72℃，1min(30个cycle)；72℃，5min。回收pcr产物条带，连接至
pmd
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19t载体上，并转化top10感受态细胞，涂布到带有iptg，x
‑
gal的lb平板，进行蓝白斑筛选。挑取白色单菌落接种到2ml lb培养基(amp+)，37℃培养过夜后抽提菌液dna送去测序。其重链可变区的氨基酸序列为seq id no：1，其轻链可变区的氨基酸序列为seq id no：2。
37.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。