一种利用未成熟莲胚进行瞬间表达的方法与流程

1.本发明属于基因工程领域，具体涉及一种利用未成熟莲胚进行瞬间表达的方法。


背景技术：

2.荷花又称莲，是莲科(nelumbonaceae)莲属(nelumbo)多年生水生草本植物，是世界上著名的观赏、食用和药用植物，是印度和越南国花，也是中国的十大名花之一。
3.目前全世界的荷花品种约在2000多个，根据荷花的用途可以分为花莲、藕莲和子莲三大系列。花莲主要以观花欣赏为主，其中亚洲莲的花型较为丰富，有单瓣、半重瓣、重瓣、重台、千瓣等花型，花色有白色、粉红色、红色和复色系列，而美洲莲仅有单瓣黄色系列。藕莲主要用地下茎——藕作为蔬菜食用，借助南方地区特有的湖泊淡水自然资源，莲藕形成了独具特色的地方优质特色产区。而子莲主要是用于生产莲子，莲子营养丰富，味美，具有食疗功效；莲叶还可以制茶，具有调节血脂等保健作用。莲子、莲子胚芽、莲藕、藕节、荷叶及荷花等都可入药。荷花作为园林植物，不仅能美化环境，还可以净化水体。因此荷花具有十分重要的经济和文化价值。
4.目前，荷花育种研究主要采用传统的杂交育种的方式进行，但杂交性状受到父母本表型的限制。基因工程手段的应用能够加快植物分子育种的进程，荷花的基因组测序也已经完成，但荷花的分子育种研究依然远远落后于模式植物，主要原因是荷花遗传转化体系还不成熟。
5.由于荷花的遗传转化研究尚未成熟，中国发明专利cn106222195a中公开了一种将外源基因转入荷花花瓣进行瞬间表达的方法，该方法存在瞬间转化效率过低、花瓣采集受季节限制等因素影响。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种利用未成熟莲胚进行瞬间表达的方法，在受体植物原位进行，操作方法简便、瞬时表达率高，简单方便，所需时间短，用于荷花基因功能的快速验证，能有效地开展荷花分子育种以及功能基因的开发应用。
7.为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.一种利用未成熟莲胚进行瞬间表达的方法，包括以下步骤：
9.1)准备阳性农杆菌
10.将携带有外源基因的质粒转入植物农杆菌中，挑取单克隆，经pcr电泳检测获得阳性农杆菌，备用；
11.2)制备菌液
12.挑取单克隆阳性农杆菌，转入含卡那霉素的yeb液体培养基中，过夜摇动培养16～20小时，将摇好的菌液进行常温离心，去上清，收集菌体，用侵染缓冲液重悬，菌液浓度od600在0.4～0.8，获得侵染菌液，备用；
13.3)准备外植体
14.选取可食用时期到接近成熟时期的绿色莲蓬，剥出莲子，选择果皮全部或部分呈现绿色的莲子，将莲子用质量分数为10
‑
20％的次氯酸钠溶液消毒10
‑
30min，无菌水冲洗；
15.在无菌环境中除去水分，剥开莲子，分离出莲子的未成熟胚，除去两片子叶，使胚尖露出并创伤胚尖，得到胚尖外植体；
16.4)侵染、共培养
17.将获得的胚尖外植体放入待侵染菌液中，超声处理2～4min，后摇床侵染15
‑
120min，放入cab培养基中共培养3～4天，观察侵染效果。
18.优选地，所述创伤胚尖指用解剖刀在胚尖上纵划。
19.进一步，步骤4)中，超声处理时，功率为100w；所述侵染液的组成为1/2ms培养基，添加了葡萄糖15
‑
25g/l和蔗糖5
‑
15g/ll。
20.又，步骤4)中，所述cab培养基以msb培养基为基本培养基，添加了葡萄糖25
‑
35g乙酰丁香酮50
‑
500μm和半胱氨酸50
‑
500mg/l；所述msb培养基按照ms培养基的无机盐组成和b5培养基的有机盐组成配制。
21.优选地，步骤3)中，所述的绿色莲蓬在采收后4天以内进行处理。
22.又，步骤3)中，所述的绿色莲蓬在采收后21天以内进行处理。
23.进一步，步骤3)中，所述的绿色莲蓬采收后保存温度为2
‑
8℃。
24.又，所述外源基因为可在植物中表达的报告基因，例如gfp、rfp、gus基因、yfp基因等，但不限定于所列举的基因种类。
25.本发明中，莲子的选择与瞬间转化效率有关，经过实践摸索，确定了合适的采集对象，选择接近成熟期的绿色莲蓬，采集新鲜的快成熟莲子，其中的莲子果皮还呈现绿色，有利于获得有活力的幼胚，莲子幼胚接近成熟，此时易于分离胚尖，同时组织幼嫩、再生能力强，在本发明的侵染条件下进行农杆菌侵染，瞬间转化效率较高。如果选择莲子的时期过早或过晚，果皮已经变黄、变黑，转化效率会急剧下降，这是由于果皮变黄或变黑后，果皮会变硬，解剖时不利于切割，不容易分离出里面的未成熟胚，另外，储存时间过长也会导致内部组织腐烂，活力下降，容易产生污染，也导致农杆菌不易侵染。
26.本发明中，分离出莲子的未成熟胚后除去两片子叶，对露出的胚尖划伤，进行创伤处理，超声后进行侵染，创伤处理后进行超声处理，可以对胚尖进行二次微创，利于侵染，侵染在胚尖外植体原位进行，染色后，胚轴切口部分及胚尖处均有绿色荧光存在。
27.本发明的cab培养基中，葡萄糖的作用是活化农杆菌的vir区基因的表达，有利于侵染；乙酰丁香酮是酚类化合物，能够编码膜结合激酶的vira基因磷酸化自身并激活virg基因产物，从而刺激其他vir基因及其自身的转录，利于农杆菌对莲子胚尖的入侵；半胱氨酸作为还原剂，对农杆菌的转化有促进作用。
28.本发明所用的荷花不受品种限制，包括美洲莲和亚洲莲不同品种的莲子未成熟胚均可作为瞬间转化材料。
29.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
30.本发明以接近成熟期的莲子胚尖作为外植体，此时莲子幼胚接近成熟，易于分离胚尖，组织幼嫩，再生能力强，农杆菌侵染时可以极大的提高基因瞬间转化的效率，放置4天以内的新鲜莲子，瞬间表达率为100％，放置21天以内的莲子，其瞬间表达率在50％以上，大大提高了瞬间转化表达率，延长了基于荷花外植体的外源基因瞬间转化可操作时间。
31.本发明能够在短时间内有效的进行荷花基因功能的验证，将侵染后的外植体放入cab培养基中共培养3～4天，就可以观察侵染结果，莲子保存时间长，即使采用保存21天的新鲜莲子胚尖，也能获得较高的瞬间表达率，从而避开了荷花组织培养和外植体再生困难的历史难题，进行有目的的分子定向育种和荷花分子生物学的基础研究，市场应用潜力巨大。
附图说明
32.图1为本发明是实施例中阳性农杆菌的pcr检测结果。
33.图2为本发明是实施例中果皮为不同程度绿色的莲子比较，其中，完全呈黑色的弃去，a、b留用。
34.图3为本发明实施例中未成熟胚胚尖的参考图，其中，箭头部分为胚尖。
35.图4为本发明是实施例中gfp在胚尖处瞬时表达图。
具体实施方式
36.以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。
37.本发明实施例中的p183343质粒来自未米生物科技(江苏)有限公司。
38.实施例一种利用未成熟莲胚进行瞬间表达的方法，包括如下步骤：
39.1)带gfp蛋白的农杆菌的制备
40.将保存的感受态细胞eha105在冰上融化，加入含有gfp基因(其核苷酸序列参见seq id no.1)的0.5～1μg p183343质粒dna，同时以无菌水代替dna作为对照，冰上放置5min。液氮中速冻5min，取出后立即于37℃保温5min，每管中加入800μl yeb液体培养基，28℃恒温摇床缓慢振荡2～4h，取200μl菌液涂于含有50μg/ml卡那霉素的yeb固体筛选培养基上，于28℃恒温培养箱中培养，两天后观察菌落的生长情况。
41.挑取单克隆，经pcr电泳检测gfp片段大小(参见图1)，目标片段为630bp，获得阳性农杆菌，备用。
42.其中，pcr扩增时的引物序列如下：
43.egfp
‑
n：5
’‑
ctggtcgagctggacggcgacg
‑3’
；
44.egfp
‑
c：5
’‑
cacgaactccagcaggaccatg
‑3’
。
45.2)制备菌液
46.挑取单克隆阳性农杆菌，转入50ml含有50μg/ml卡那霉素的yeb液体培养基中，过夜摇动培养16～20小时，将摇好的菌液进行常温离心，去上清，收集菌体，用新鲜的yeb培养液，含有50μg/ml卡那霉素，重悬，菌液浓度od600在0.4～0.8，获得侵染菌液，备用。
47.其中，所述yeb培养基中，每升含有牛肉浸膏5g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，蔗糖5g，mgso4·
h2o 0.5g，ph 7.0。
48.3)制备外植体
49.采集合适时期的未成熟种子：以子莲品种
‘
建选17’为例，选取可食用时期到接近成熟时期的绿色莲蓬，剥出莲子，去除果皮黑色变硬的莲子，参见图2，选择果皮还是绿色的(见图2)未成熟的莲子，放置冰箱备用。
50.莲子的消毒：将经过4℃条件下不同储存时间(参见表1)的莲子用20％次氯酸钠消
毒15min，无菌水冲洗3次，洗净次氯酸钠残液。
51.未成熟胚胚尖的分离：在超净台中用无菌滤纸吸干水分，用无菌解剖刀剥开莲子，无菌镊子分离出莲子未成熟胚，用无菌解剖刀切除两片子叶，露出胚尖(参见图3)，并纵划进行创伤。
52.4)共侵染、培养
53.将新鲜莲子胚尖外植体放入盛有待侵染菌液的三角瓶中，三角瓶置入超声波仪中，功率100w条件下处理2～4min，后摇床侵染15min，放入cab培养基中共培养3～4天。
54.其中，所述cab培养基以msb培养基为基本培养基，添加了葡萄糖30g/l，乙酰丁香酮200μm和半胱氨酸200mg/l；所述msb培养基按照ms培养基的无机盐组成和b5培养基的有机盐组成配制。
55.5)观察gfp基因的瞬间表达
56.将瞬转后的胚尖外植体置于荧光体视显微镜观察下观察，激发波长为488nm，发射波长为507nm，可以看到切口处有绿色荧光存在(参见图4)，显示农杆菌可以侵染胚尖组织，结果参见及表1。
57.表1冰箱储存时间对转化的影响
[0058][0059][0060]
表1中，“/”前的数字表示成功进行瞬时表达的外植体个数，“/”后的数字表示本组内侵染外植体的个数。
[0061]
由表1可见，本发明利用采收后放置4天以内的新鲜莲子胚尖进行外源基因的瞬间表达，其表达率为100％，莲子放置时间在21天以内的胚尖外植体瞬间表达率为52.5％。