一种防控玉米种栖镰刀菌爆发的复合菌群及其应用

no.21324、嗜麦芽寡养单胞菌rfste
‑
1保藏编号为cgmcc no.21325、解淀粉芽孢杆菌rfbac
‑
1保藏编号为cgmcc no.21326、土壤溶杆菌rflys
‑
1保藏编号为cgmcc no.21327、路德维希肠杆菌rfent
‑
1保藏编号为cgmcc no.21328。
9.所述的复合菌群分离自健康玉米的根际微生物，通过宏基因组数据分析所得的在健康玉米根际稳定高效定殖的非冗余根际细菌进行构建。
10.所述菌群可以显著降低玉米幼苗根际和根内镰刀菌的含量以及减少玉米幼苗期镰刀菌的侵染率，且菌群对玉米种传镰刀菌的防控效果优于芽孢杆菌单独使用的防控效果。
11.所述菌群中解淀粉芽孢杆菌rfbac
‑
1是对玉米种栖镰刀菌有直接拮抗作用的功能菌，同时还有对宿主作物促生的功能。
12.所述菌群中的洋葱伯克氏菌rfbur
‑
1、路德维希肠杆菌rfent
‑
1、嗜麦芽寡养单胞菌rfste
‑
1、施氏假单胞菌rfpse
‑
1、日本假黄单胞菌rfpth
‑
1、鲍曼不动杆菌rfaci
‑
1和土壤溶杆菌rflys
‑
1均能促进解淀粉芽孢杆菌rfbac
‑
1的生长，其中洋葱伯克氏菌rfbur
‑
1促进芽孢杆菌生长的能力最强。
13.所述菌群中的土壤溶杆菌rflys
‑
1、日本假黄单胞菌rfpth
‑
1和嗜麦芽寡养单胞菌rfste
‑
1可以提高解淀粉芽孢杆菌rfbac
‑
1编码拮抗物质的基因表达，提高菌群的生防能力。
14.所述菌群中的鲍曼不动杆菌rfaci
‑
1、施氏假单胞菌rfpse
‑
1、日本假黄单胞菌rfpth
‑
1和嗜麦芽寡养单胞菌rfste
‑
1可以提高芽孢杆菌编码促生物质的基因表达，提高菌群的促生能力。
15.所述菌群中的路德维希肠杆菌rfent
‑
1、日本假黄单胞菌rfpth
‑
1和嗜麦芽寡养单胞菌rfste
‑
1具有提高菌群稳定性的能力，使菌群面临复杂土壤环境时能保持整体组成稳定，保证生防功能和促生功能稳定发挥。
16.所述的复合菌群在制备防控玉米种栖镰刀菌病害的制剂中的应用。
17.本发明所述的复合菌群在促进玉米幼苗生长中的应用。
18.本发明所述复合菌群在防控玉米种栖镰刀菌病害爆发中的应用。
19.作为本发明的一种优选，所述玉米种栖镰刀菌为玉米种子中存在的所有镰刀菌类型。
20.作为本发明的进一步优选，将所述的复合菌群液体发酵后制成复合菌剂施用于土壤。
21.一种复合菌剂，由所述的鲍曼不动杆菌rfaci
‑
1、施氏假单胞菌rfpse
‑
1、日本假黄单胞菌rfpth
‑
1、洋葱伯克氏菌rfbur
‑
1、嗜麦芽寡养单胞菌rfste
‑
1、解淀粉芽孢杆菌rfbac
‑
1、土壤溶杆菌rflys
‑
1和路德维希肠杆菌rfent
‑
1发酵制备得到。
22.所述的复合菌剂中鲍曼不动杆菌rfaci
‑
1：施氏假单胞菌rfpse
‑
1：日本假黄单胞菌rfpth
‑
1：洋葱伯克氏菌rfbur
‑
1：嗜麦芽寡养单胞菌rfste
‑
1：解淀粉芽孢杆菌rfbac
‑
1：土壤溶杆菌rflys
‑
1：路德维希肠杆菌rfent
‑
1的菌液按照(0.5～1.2)：(0.5～1.2)：(0.5～1.2)：(0.5～1.2)：(0.5～1.2)：(0.5～1.2)：(0.5～1.2)：(0.5～1.2)的体积比混合。
23.本发明所述的复合菌剂在防控玉米种栖镰刀菌病害爆发中的应用。
24.有益效果
25.本发明所构建的复合菌群接入土壤中可以显著的降低玉米种栖镰刀菌的爆发率，荧光定量pcr表明，这一菌群接入土壤中后，可以显著降低玉米根际和根内的镰刀菌数量，并且对玉米生长具有一定的促进效果。
附图说明
26.图1为种栖镰刀菌爆发对玉米生长的影响
27.图2为种栖镰刀菌爆发对玉米生理指标的影响
28.图3为种栖镰刀菌爆发对玉米叶片抗逆相关酶活性的影响
29.图4为健康玉米根际可培养菌株分离鉴定结果
30.图5为复合菌群中单菌与镰刀菌的平板对峙效果
31.图6为复合菌群和芽孢杆菌单菌接种对我国主要玉米种植区的玉米品种的种栖镰刀菌防控率
32.图7为复合菌群和芽孢杆菌单菌接种对我国主要玉米种植区的玉米品种的根际镰刀菌数量的影响
33.图8为接种复合菌群对我国主要玉米种植区的玉米品种的地上生物量的影响
34.图9为复合菌群中所有菌株代谢产物对芽孢杆菌生长的影响
35.图10为株菌“敲除”对复合菌群组成稳定性的影响
36.图11为复合菌群中所有菌株代谢产物对芽孢杆菌生防功能相关基因表达的影响
37.图12为复合菌群中所有菌株代谢产物对芽孢杆菌促生功能相关基因表达的影响
38.生物材料保藏信息
39.rfent
‑
1，分类命名为路德维希肠杆菌enterobacter ludwigii，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号院中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年12月07日，保藏编号为cgmcc no.21328。
40.rflys
‑
1，分类命名为lysobacter soli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号院中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年12月07日，保藏编号为cgmcc no.21327。
41.rfaci
‑
1，分类命名为鲍曼不动杆菌acinetobacter baumannii，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号院中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年12月07日，保藏编号为cgmcc no.21321。
42.rfpse
‑
1，分类命名为施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号院中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年12月07日，保藏编号为cgmcc no.21322。
43.rfpth
‑
1，分类命名为日本假黄单胞菌pseudoxanthomonas japonensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号院中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年12月07日，保藏编号为cgmcc no.21323。
44.rfbur
‑
1，分类命名为burkholderia cenocepacia，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号院中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年12月07日，保藏编号为cgmcc no.21324。
45.rfste
‑
1，分类命名为嗜麦芽寡养单胞菌stenotrophomonas maltophilia，保藏于
中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号院中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年12月07日，保藏编号为cgmcc no.21325。
46.rfbac
‑
1，分类命名为解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号院中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年12月07日，保藏编号为cgmcc no.21326。
47.具体实施方法
48.实施例1：种栖镰刀菌爆发对玉米生长的影响
49.实验共设自然土种植(ns)和灭菌土种植(ss)两个处理，将150g自然土和灭菌土分别置于无菌组培瓶中，加入37.5ml无菌水，搅拌均匀，黑暗处培育1周，保证土壤含水量为20％
‑
25％。灭菌土壤采用γ射线灭菌，辐照剂量>50kgray。
50.将无菌平皿中催芽的长势一致的玉米种子移栽进组培瓶中，每个培养瓶中种植5棵玉米，设置6个重复。盆栽实验玉米种植条件为25℃，光照16h黑暗8h，湿度为50％。
51.玉米生长8天后统计玉米发病情况，并测定其株高、鲜重、叶绿素spad值、sod、pod、cat酶的活性。株高、鲜重使用卷尺和电子天平测定。叶绿素spad值使用叶绿素仪(spad
‑
502plus)测定。sod、pod、cat酶活性测定参照《植物生理生化实验原理和技术》说明，分别使用氮蓝四唑法、愈疮木酚法、紫外吸收法进行测定。
52.结果与分析
53.如图1所示，灭菌土壤中(ss)玉米种栖镰刀菌爆发，明显抑制了玉米的根系生长，导致叶片卷曲黄化。自然土壤(ns)中玉米长势正常。
54.如图2所示，分别测定了种栖镰刀菌爆发(ss)和健康玉米(ns)的相关生理指标。叶绿素spad值、茎粗、地上部鲜重以及株高显示种栖镰刀菌爆发会显著的降低玉米光合强度、鲜重以及株高，分别降低22.9％、41.9％和38.0％。
55.如图3所示，分别测定了种栖镰刀菌爆发(ss)和健康玉米(ns)抗逆相关的cat、pod、sod酶活性。在种栖镰刀菌爆发(ss)的玉米叶片中，cat、pod、sod酶的活性均显著高于健康玉米(ns)，分别较健康玉米提高了97.0％、134％以及5.4％，表明玉米受到种栖镰刀菌侵染的胁迫，启动了体内sod、pod、cat酶的防御系统。
56.实施例2：健康玉米根际可培养菌株分离鉴定
57.盆栽玉米种植条件同实施例1。
58.选择自然土中的健康玉米植株，与移栽后第8天采集玉米根际样品，通过宏培养组学分离和平板涂布相结合的方法分离玉米根际可培养菌株。
59.取根际土制备土壤微生物提取液，然后进行梯度稀释，选取10
‑4和10
‑5稀释度的微生物提取液在加有1:10(v/v)胰蛋白酶大豆肉汤培养基的96孔板中进行菌株分离。选取仅有30％
‑
40％孔有菌生长的微量滴定板进行菌株16s rrna基因鉴定，将菌液提取基因组dna，采用两步条形码标记引物的聚合酶链式反应(pcr)技术扩增，在含25mm naoh和0.2mm edta的10μl缓冲液中加入6μl细菌培养物，在95℃下孵育30min，然后在ph 7.5下加入10μl含40mm tris hcl的缓冲液以降低体系ph至7。采用含有孔板特异性条形码的简并引物799f和1193r(扩增16s rrna基因的v5
‑
v7区域)对96孔微量滴定板中的分离株进行两步pcr，合格pcr产物以等量混合样本，最后在hiseq 2500平台上进行测序，测序结果通过ncbi数据库
比对进行类群鉴定。
60.结果与分析
61.共分离到2156株单菌，其中非冗余菌株有237株，代表了健康玉米根际群落69.2％的高丰度otu(相对丰度高于0.1％)。本次分离获得的菌株主要包括放线菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门，如图4所示，内圈表示根际微生物群落测序所鉴定到的细菌类群，外圈(标黑点的类群)表示通过纯培养得到的可培养菌株。
62.实施例3：复合菌群中核心拮抗菌确定
63.将8株菌分别在固体tsb培养基上划线培养，置于30℃恒温培养箱。待形成单菌落后，分别挑取每株菌于3ml液体tsb培养基中，170rpm震荡过夜培养。吸取2ml菌液至无菌的离心管中，8000rmp离心5分种，再用pbs缓冲液重悬，获得供试菌株悬液。
64.将玉米种栖镰刀菌接种到pda平板中央，置于28℃恒温培养箱。待菌丝铺满平板后，使用无菌打孔器取真菌菌块，转接到新的pda固体平板中央。吸取10μl供试菌株悬液分别等距离接种于真菌菌块的两侧，置于30℃恒温培养箱培养8天。
65.结果与分析
66.如图5所示，复合菌群中，只有芽孢杆菌rfbac
‑
1和伯克氏菌rfbur
‑
1对镰刀菌有直接拮抗作用，且芽孢杆菌rfbac
‑
1的拮抗能力显著强于伯克氏菌rfbur
‑
1。
67.复合菌群中其他菌株，肠杆菌rfent
‑
1、窄食单胞菌rfste
‑
1、溶杆菌rflys
‑
1、假黄单胞菌rfpth
‑
1、不动杆菌rfaci
‑
1以及假单胞菌rfpse
‑
1对镰刀菌均没有直接拮抗效果，表明复合菌群中主要起拮抗作用的菌为芽孢杆菌rfbac
‑
1。
68.实施例4：复合菌群和芽孢杆菌单菌接种对种栖镰刀菌的防控效果
69.株菌单菌落培养同实施例3。
70.分别挑取每株菌的单菌落，转接到3ml tsb液体培养基中，置于30℃恒温摇床，170rpm震荡过夜培养。吸取200μl菌液接入20ml tsb液体培养基中，置于30℃恒温摇床，170rmp振荡培养至每株菌od
600nm
＝1.0。将菌液加入50ml无菌离心管中，8000rpm离心10分钟，弃上清取菌体沉淀，用无菌蒸馏水将菌体重悬至菌体浓度为1*109cfu/ml。将所有菌体按照等体积比例混合获得复合菌群接种剂。
71.盆栽玉米种植条件同实施例1。
72.将8个玉米品种(分别为，隆平、豫玉、郑单、登海、联创、丰田、正大和京科)分别催芽后种植在3个不同土壤处理中，分别为灭菌土，以及灭菌土中接入复合菌群接种剂和单接芽孢杆菌菌剂的处理，复合菌群和芽孢杆菌均以1*107cfu/g土壤的接种量进行接种，共24个处理，每个处理6个重复。
73.玉米生长8天后，统计不同处理对玉米种栖镰刀菌的防控效率，并采用实时荧光定量pcr检测玉米根际镰刀菌数量。
74.结果与分析
75.如图6所示，灭菌土中，种栖镰刀菌的防控率为0，接种芽孢杆菌单菌和复合菌群能显著提高对种栖镰刀菌的防控效率，其中单接种芽孢杆菌的处理防控效率约为48％，而接种复合菌群的防控效率达到86％以上，显著高于单接芽孢杆菌的防控效率。
76.如图7所示，灭菌土中，种栖镰刀菌的拷贝数最高，接种芽孢杆菌单菌和复合菌群能显著降低玉米根际镰刀菌拷贝数，其中接种复合菌群后玉米根际的镰刀菌数量显著低于
单接种芽孢杆菌的处理，表明接种复合菌群对玉米种栖镰刀菌的防控效果更加稳定。
77.实施例5：复合菌群和芽孢杆菌单菌接种对玉米植株的促生效果
78.盆栽玉米种植条件同实施例1，复合菌群接种剂制备方法同实施例4。
79.玉米生长8天后，测定玉米地上部生物量，测定方法同实例1。
80.如图8所示，灭菌土中，玉米受到种栖镰刀菌爆发的抑制作用，生物量最低。接种复合菌群和芽孢杆菌单菌能在一定程度上防控种栖镰刀菌，提高玉米地上部生物量。与在自然土中相比，单接种芽孢杆菌的玉米生物量并没有显著差异，而接种复合菌群可以显著增加玉米的地上部鲜重，表明复合菌群还能显著促进玉米生长。
81.实施例6：复合菌群中所有菌株代谢产物影响芽孢杆菌生长
82.株菌单菌落培养同实施例3。
83.分别挑取每株菌的单菌落，转接到3ml tsb液体培养基中，置于30℃恒温摇床，170rpm震荡过夜培养。吸取200μl菌液接入20ml tsb液体培养基中，置于30℃恒温摇床，170rmp振荡培养至每株菌od
600nm
＝1.0。将菌液加入50ml无菌离心管中，8000rpm离心10分钟，取上清，过0.22μm滤膜除菌，所得液体即为菌株发酵液。
84.将od
600nm
＝1.0的芽孢杆菌rfbac
‑
1的菌液加入50ml无菌离心管中，8000rpm离心10分钟，弃去上清，用等体积无菌tsb重悬，获得芽孢杆菌菌株悬液。
85.按照1％的接种量将芽孢杆菌rfbac
‑
1菌株悬液分别接种到复合菌群中其余各菌株的发酵液中，使用bioscreen测定芽孢杆菌rfbac
‑
1在24h内的生长曲线。每个处理设10个重复。对照为将1％的接种量将芽孢杆菌rfbac
‑
1菌株悬液接种到等体积tsb液体培养基中。
86.结果与分析
87.如图9所示，将芽孢杆菌rfbac
‑
1单独接入tsb液体培养基中，24h后的最终od
600nm
＝0.87。而将芽孢杆菌接入其他菌株的发酵液中时，其24h后的od
600nm
值均大于1.0，表明其他菌株的发酵液菌均能促进芽孢杆菌rfbac
‑
1的生长，根据24h后的od
600nm
值排列其促进效果由强到弱依次为，伯克氏菌rfbur
‑
1、溶杆菌rflys
‑
1、肠杆菌rfent
‑
1、不动杆菌rfaci
‑
1、嗜麦芽寡养单胞菌rfste
‑
1、假单胞菌rfpse
‑
1、假黄单胞菌rfpth
‑
1。
88.实施例7：维持复合菌群稳定的核心菌株
89.复合菌群所有菌株的菌株悬液制备同实施例4。
90.复合菌群株菌“敲除”，即每次分别去除菌群中的一株菌，将其他菌株共培养，通过测定菌群组成变异评估菌群稳定性，由此判断该“敲除”的菌株对整体菌群稳定的影响能力。如
‑
bac，即将复合菌群中芽孢杆菌rfbac
‑
1去除，将其他的菌株混合后接种于固体tsb培养基中。其余各处理分别为
‑
aci、
‑
bur、
‑
ent、
‑
lys、
‑
pth、
‑
pse、
‑
ste。
91.结果与分析
92.将结果如图10所示，“敲除”菌群中的肠杆菌rfent
‑
1后(
‑
ent)的群落组成bray
‑
curtis距离显著增加，其次是在“敲除”假单胞菌rfpth
‑
1(
‑
pth)和嗜麦芽寡养单胞菌rfste
‑
1(
‑
ste)的处理。表明维持复合菌群稳定性的最重要菌株成员是肠杆菌rfent
‑
1，其次是假单胞菌rfpth
‑
1和嗜麦芽寡养单胞菌rfste
‑
1。
93.实施例8：功能菌株rfbac
‑
1的拮抗基因表达
94.复合菌群所有菌株的菌株发酵液和菌株悬液制备同实施例4。
95.将200μl rfaci
‑
1、rfbur
‑
1、rfent
‑
1、rflys
‑
1、rfpth
‑
1、rfpse
‑
1、rfste
‑
1的菌株
发酵液分别加入200μl od
600nm
＝1.0的芽孢杆菌rfbac
‑
1的菌株悬液中，置于30℃恒温摇床，170rpm诱导40min。设置不添加任何物质培养芽孢杆菌rfbac
‑
1的菌株悬液为对照，每个处理4个重复。
96.诱导完成的培养液通过液氮冷冻，再使用omeg bacterial rna kit试剂盒提取rna。rna提取完毕后使用vazyme hiscript ii q rt supermix for qpcr试剂盒进行反转录，得到cdna后使用vazyme chamq sybr color qpcr master mix进行功能基因定量pcr。
97.结果与分析
98.结果如图11所示，共测定了功能菌rfbac
‑
1中6个与拮抗病原菌相关的功能基因表达情况。溶杆菌rflys
‑
1能促进功能菌rfbac
‑
1的bacilysin合成相关baca基因、bacillaene合成相关baec基因和surfactin合成相关sfp基因的表达。假黄单胞菌rfpth
‑
1和嗜麦芽寡养单胞菌rfste
‑
1能促进功能菌rfbac
‑
1的fengycin合成相关fen基因、bacilysin合成相关baca基因和diffcidin合成相关dfn基因的表达。
99.实施例9：功能菌株rfbac
‑
1的促生基因表达
100.实验方法同实施例6
101.结果与分析
102.如图12所示，共测定了功能菌rfbac
‑
1中6个与促生相关的功能基因表达情况。
103.不动杆菌rfaci
‑
1、假黄单胞菌rfpth
‑
1和嗜麦芽寡养单胞菌rfste
‑
1能促进功能菌rfbac
‑
1的2,3
‑
butanediol合成相关alss基因表达。不动杆菌rfaci
‑
1、假黄单胞菌rfpth
‑
1、假单胞菌rfpse
‑
1和嗜麦芽寡养单胞菌rfste
‑
1能促进功能菌rfbac
‑
1的phytase合成相关phy基因表达。不动杆菌rfaci
‑
1、假黄单胞菌rfpth
‑
1和假单胞菌rfpse
‑
1能促进功能菌rfbac
‑
1的ferrichrome合成相关yclo基因表达。所有菌株均能促进功能菌rfbac
‑
1的acetoin合成相关acoa基因表达。