一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法与流程

本发明属于牙髓干细胞
技术领域：
，具体涉及一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法。
背景技术：
：牙髓组织位于牙齿内部的牙髓腔内，是牙体组织中唯一的软组织。2000年gronthos等通过对人牙髓细胞的研究，发现了一种与骨髓间充质干细胞有着极其相似的免疫表型及形成矿化结节能力的细胞，细胞中形态呈梭形，可自我更新和多向分化，有着较强的克隆能力。这些由牙髓组织中分离出的成纤维状细胞就称为牙髓干细胞(dentalpulpstemcells,dpscs)。外泌体是指包含了复杂rna和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。目前牙髓干细胞的外泌体的提取方法主要有超速离心法、密度梯度离心、色谱法、磁珠免疫法、多聚物沉淀法。然而无论哪种方法，外泌体获取的量仍较少，这限制了外泌体的临床应用，如何使牙髓干细胞分泌更多的外泌体值得进一步研究。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法，以解决上述
背景技术：
中提出的目前牙髓干细胞的外泌体的提取方法获取的外泌体量较少，限制了外泌体的临床应用的问题。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法，包括以下步骤：步骤一：从年龄18至30岁的健康志愿者中提取出没有龋齿和牙周病变的第三磨牙，用75％酒精牙齿表面进行消毒，随后使用牙科钻头取出牙髓；步骤二：将牙髓用消毒后的小刀切成1mm的小块，共三小块；步骤三：用含有2.5％抗生素的pbs冲洗3次，随后将牙髓组织放入1.5mlep管中用3mg/ml的i型胶原酶消化-4mg/ml的分散酶37℃放置30分钟；步骤四：将牙髓细胞重悬至5％co2温箱中培养(培养基：dmem+10％的胎牛血清+100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素)，温度设置为20-40℃，5天之后换液，之后每3天更换一次；步骤五：待到第一代细胞融合至80％左右后，消化离心处理后，取出5000个左右细胞在45孔板中进行种植并进行免疫荧光鉴定，剩余细胞均匀种植在两个100mm的培养皿中，将两组细胞分别命名为对照组和实验组；步骤六：将牙髓干细胞接种在100mm培养基中，待到细胞融合至80％左右后，将对照组的培养基去除，用psb清洗三次后更换为无血清dmem培养基，将实验组的培养基更换为无糖dmem培养基，并将培养皿置于厌氧培养罐(三菱产气罐anaeropacktm)(37℃、100％co2、)中继续培养90min后，将培养板中的无糖dmem更换为dmed培养基并置于普通培养箱继续培养48小时；步骤七：分别对对照组和实验组内的牙髓干细胞的外泌体进行提取，随后对蛋白进行提取；步骤八：测定蛋白浓度和蛋白标记物cd63、cd9的含量，最后统计对照组和实验组的浓度差异。优选的，所述步骤五中，将所有细胞平均种植于两组培养皿中，随后再将两组培养皿分别命名为对照组和实验组，并对实验组内的牙髓干细胞进行糖氧剥夺处理。优选的，所述步骤七中，对对照组和实验组内的牙髓干细胞的外泌体进行提取时，采用多聚物沉淀法进行提取。优选的，所述步骤八中，对对照组和实验组的牙髓干细胞内的蛋白浓度进行测定时采用bca测定，二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的bcasolutiona(含有bca)相互作用产生敏感的颜色反应，两分子的bca螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物，水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。与现有技术相比，本发明提供了一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法，具备以下有益效果：1、本发明通过对培养的牙髓干细胞进行糖氧剥离处理，可以有效的促进牙髓干细胞分泌更多外泌体，大大促进了牙髓干细胞的外泌体在医学临床的应用，较传统的超速离心法、密度梯度离心、色谱法、磁珠免疫法、多聚物沉淀法等方法直接获取的牙髓干细胞的外泌体的量更多；2、本发明通过采用bca测定牙髓干细胞内的蛋白浓度，二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的bcasolutiona(含有bca)相互作用产生敏感的颜色反应，两分子的bca螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物，水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，从而根据吸光值可以推算出蛋白浓度，使对照组和实验组的牙髓干细胞内的蛋白浓度更加方便检测。附图说明附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：图1为本发明提出的提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法中牙髓干细胞培养的工艺流程图；图2为本发明提出的提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法中对照组和实验组浓度比较图；图3为本发明提出的提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法中对照组和实验组cd63浓度比较图；图4为本发明提出的提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法中对照组和实验组cd9浓度比较图；具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。请参阅图1-4，本发明提供一种技术方案：一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法，包括以下步骤：步骤一：从年龄18至30岁的健康志愿者中提取出没有龋齿和牙周病变的第三磨牙，用75％酒精牙齿表面进行消毒，随后使用牙科钻头取出牙髓；步骤二：将牙髓用消毒后的小刀切成1mm的小块，共三小块；步骤三：用含有2.5％抗生素的pbs冲洗3次，随后将牙髓组织放入1.5mlep管中用3mg/ml的i型胶原酶消化-4mg/ml的分散酶37℃放置30分钟；步骤四：将牙髓细胞重悬至5％co2温箱中培养(培养基：dmem+10％的胎牛血清+100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素)，温度设置为20-40℃，5天之后换液，之后每3天更换一次；步骤五：待到第一代细胞融合至80％左右后，消化离心处理后，取出5000个左右细胞在45孔板中进行种植并进行免疫荧光鉴定，剩余细胞均匀种植在两个100mm的培养皿中，将两组细胞分别命名为对照组和实验组；步骤六：将牙髓干细胞接种在100mm培养基中，待到细胞融合至80％左右后，将对照组的培养基去除，用psb清洗三次后更换为无血清dmem培养基，将实验组的培养基更换为无糖dmem培养基，并将培养皿置于厌氧培养罐(三菱产气罐anaeropacktm)(37℃、100％co2、)中继续培养90min后，将培养板中的无糖dmem更换为dmed培养基并置于普通培养箱继续培养48小时；步骤七：分别对对照组和实验组内的牙髓干细胞的外泌体进行提取，随后对蛋白进行提取；步骤八：测定蛋白浓度和蛋白标记物cd63、cd9的含量，最后统计对照组和实验组的浓度差异。本发明中，优选的，步骤五中，将所有细胞平均种植于两组培养皿中，随后再将两组培养皿分别命名为对照组和实验组，并对实验组内的牙髓干细胞进行糖氧剥夺处理。本发明中，优选的，步骤七中，对对照组和实验组内的牙髓干细胞的外泌体进行提取时，采用多聚物沉淀法进行提取。本发明中，优选的，步骤八中，对对照组和实验组的牙髓干细胞内的蛋白浓度进行测定时采用bca测定，二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的bcasolutiona(含有bca)相互作用产生敏感的颜色反应，两分子的bca螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物，水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。实施例一一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法，包括以下步骤：步骤一：从年龄18至30岁的健康志愿者中提取出没有龋齿和牙周病变的第三磨牙，用75％酒精牙齿表面进行消毒，随后使用牙科钻头取出牙髓；步骤二：将牙髓用消毒后的小刀切成1mm的小块，共三小块；步骤三：用含有2.5％抗生素的pbs冲洗3次，随后将牙髓组织放入1.5mlep管中用3mg/ml的i型胶原酶消化-4mg/ml的分散酶37℃放置30分钟；步骤四：将牙髓细胞重悬至5％co2温箱中培养(培养基：dmem+10％的胎牛血清+100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素)，温度设置为20℃，5天之后换液，之后每3天更换一次；步骤五：待到第一代细胞融合至80％左右后，消化离心处理后，取出5000个左右细胞在45孔板中进行种植并进行免疫荧光鉴定，剩余细胞均匀种植在两个100mm的培养皿中，将两组细胞分别命名为对照组和实验组；步骤六：将牙髓干细胞接种在100mm培养基中，待到细胞融合至80％左右后，将对照组的培养基去除，用psb清洗三次后更换为无血清dmem培养基，将实验组的培养基更换为无糖dmem培养基，并将培养皿置于厌氧培养罐(三菱产气罐anaeropacktm)(37℃、100％co2、)中继续培养90min后，将培养板中的无糖dmem更换为dmed培养基并置于普通培养箱继续培养48小时；步骤七：分别对对照组和实验组内的牙髓干细胞的外泌体进行提取，随后对蛋白进行提取；步骤八：测定蛋白浓度和蛋白标记物cd63、cd9的含量，最后统计对照组和实验组的浓度差异。步骤五中，将所有细胞平均种植于两组培养皿中，随后再将两组培养皿分别命名为对照组和实验组，并对实验组内的牙髓干细胞进行糖氧剥夺处理。步骤七中，对对照组和实验组内的牙髓干细胞的外泌体进行提取时，采用多聚物沉淀法进行提取。步骤八中，对对照组和实验组的牙髓干细胞内的蛋白浓度进行测定时采用bca测定，二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的bcasolutiona(含有bca)相互作用产生敏感的颜色反应，两分子的bca螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物，水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。实施例二一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法，包括以下步骤：步骤一：从年龄18至30岁的健康志愿者中提取出没有龋齿和牙周病变的第三磨牙，用75％酒精牙齿表面进行消毒，随后使用牙科钻头取出牙髓；步骤二：将牙髓用消毒后的小刀切成1mm的小块，共三小块；步骤三：用含有2.5％抗生素的pbs冲洗3次，随后将牙髓组织放入1.5mlep管中用3mg/ml的i型胶原酶消化-4mg/ml的分散酶37℃放置30分钟；步骤四：将牙髓细胞重悬至5％co2温箱中培养(培养基：dmem+10％的胎牛血清+100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素)，温度设置为25℃，5天之后换液，之后每3天更换一次；步骤五：待到第一代细胞融合至80％左右后，消化离心处理后，取出5000个左右细胞在45孔板中进行种植并进行免疫荧光鉴定，剩余细胞均匀种植在两个100mm的培养皿中，将两组细胞分别命名为对照组和实验组；步骤六：将牙髓干细胞接种在100mm培养基中，待到细胞融合至80％左右后，将对照组的培养基去除，用psb清洗三次后更换为无血清dmem培养基，将实验组的培养基更换为无糖dmem培养基，并将培养皿置于厌氧培养罐(三菱产气罐anaeropacktm)(37℃、100％co2、)中继续培养90min后，将培养板中的无糖dmem更换为dmed培养基并置于普通培养箱继续培养48小时；步骤七：分别对对照组和实验组内的牙髓干细胞的外泌体进行提取，随后对蛋白进行提取；步骤八：测定蛋白浓度和蛋白标记物cd63、cd9的含量，最后统计对照组和实验组的浓度差异。步骤五中，将所有细胞平均种植于两组培养皿中，随后再将两组培养皿分别命名为对照组和实验组，并对实验组内的牙髓干细胞进行糖氧剥夺处理。步骤七中，对对照组和实验组内的牙髓干细胞的外泌体进行提取时，采用多聚物沉淀法进行提取。步骤八中，对对照组和实验组的牙髓干细胞内的蛋白浓度进行测定时采用bca测定，二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的bcasolutiona(含有bca)相互作用产生敏感的颜色反应，两分子的bca螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物，水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。实施例三一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法，包括以下步骤：步骤一：从年龄18至30岁的健康志愿者中提取出没有龋齿和牙周病变的第三磨牙，用75％酒精牙齿表面进行消毒，随后使用牙科钻头取出牙髓；步骤二：将牙髓用消毒后的小刀切成1mm的小块，共三小块；步骤三：用含有2.5％抗生素的pbs冲洗3次，随后将牙髓组织放入1.5mlep管中用3mg/ml的i型胶原酶消化-4mg/ml的分散酶37℃放置30分钟；步骤四：将牙髓细胞重悬至5％co2温箱中培养(培养基：dmem+10％的胎牛血清+100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素)，温度设置为30℃，5天之后换液，之后每3天更换一次；步骤五：待到第一代细胞融合至80％左右后，消化离心处理后，取出5000个左右细胞在45孔板中进行种植并进行免疫荧光鉴定，剩余细胞均匀种植在两个100mm的培养皿中，将两组细胞分别命名为对照组和实验组；步骤六：将牙髓干细胞接种在100mm培养基中，待到细胞融合至80％左右后，将对照组的培养基去除，用psb清洗三次后更换为无血清dmem培养基，将实验组的培养基更换为无糖dmem培养基，并将培养皿置于厌氧培养罐(三菱产气罐anaeropacktm)(37℃、100％co2、)中继续培养90min后，将培养板中的无糖dmem更换为dmed培养基并置于普通培养箱继续培养48小时；步骤七：分别对对照组和实验组内的牙髓干细胞的外泌体进行提取，随后对蛋白进行提取；步骤八：测定蛋白浓度和蛋白标记物cd63、cd9的含量，最后统计对照组和实验组的浓度差异。步骤五中，将所有细胞平均种植于两组培养皿中，随后再将两组培养皿分别命名为对照组和实验组，并对实验组内的牙髓干细胞进行糖氧剥夺处理。步骤七中，对对照组和实验组内的牙髓干细胞的外泌体进行提取时，采用多聚物沉淀法进行提取。步骤八中，对对照组和实验组的牙髓干细胞内的蛋白浓度进行测定时采用bca测定，二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的bcasolutiona(含有bca)相互作用产生敏感的颜色反应，两分子的bca螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物，水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。实施例四一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法，包括以下步骤：步骤一：从年龄18至30岁的健康志愿者中提取出没有龋齿和牙周病变的第三磨牙，用75％酒精牙齿表面进行消毒，随后使用牙科钻头取出牙髓；步骤二：将牙髓用消毒后的小刀切成1mm的小块，共三小块；步骤三：用含有2.5％抗生素的pbs冲洗3次，随后将牙髓组织放入1.5mlep管中用3mg/ml的i型胶原酶消化-4mg/ml的分散酶37℃放置30分钟；步骤四：将牙髓细胞重悬至5％co2温箱中培养(培养基：dmem+10％的胎牛血清+100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素)，温度设置为35℃，5天之后换液，之后每3天更换一次；步骤五：待到第一代细胞融合至80％左右后，消化离心处理后，取出5000个左右细胞在45孔板中进行种植并进行免疫荧光鉴定，剩余细胞均匀种植在两个100mm的培养皿中，将两组细胞分别命名为对照组和实验组；步骤六：将牙髓干细胞接种在100mm培养基中，待到细胞融合至80％左右后，将对照组的培养基去除，用psb清洗三次后更换为无血清dmem培养基，将实验组的培养基更换为无糖dmem培养基，并将培养皿置于厌氧培养罐(三菱产气罐anaeropacktm)(37℃、100％co2、)中继续培养90min后，将培养板中的无糖dmem更换为dmed培养基并置于普通培养箱继续培养48小时；步骤七：分别对对照组和实验组内的牙髓干细胞的外泌体进行提取，随后对蛋白进行提取；步骤八：测定蛋白浓度和蛋白标记物cd63、cd9的含量，最后统计对照组和实验组的浓度差异。步骤五中，将所有细胞平均种植于两组培养皿中，随后再将两组培养皿分别命名为对照组和实验组，并对实验组内的牙髓干细胞进行糖氧剥夺处理。步骤七中，对对照组和实验组内的牙髓干细胞的外泌体进行提取时，采用多聚物沉淀法进行提取。步骤八中，对对照组和实验组的牙髓干细胞内的蛋白浓度进行测定时采用bca测定，二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的bcasolutiona(含有bca)相互作用产生敏感的颜色反应，两分子的bca螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物，水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。实施例五一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法，包括以下步骤：步骤一：从年龄18至30岁的健康志愿者中提取出没有龋齿和牙周病变的第三磨牙，用75％酒精牙齿表面进行消毒，随后使用牙科钻头取出牙髓；步骤二：将牙髓用消毒后的小刀切成1mm的小块，共三小块；步骤三：用含有2.5％抗生素的pbs冲洗3次，随后将牙髓组织放入1.5mlep管中用3mg/ml的i型胶原酶消化-4mg/ml的分散酶37℃放置30分钟；步骤四：将牙髓细胞重悬至5％co2温箱中培养(培养基：dmem+10％的胎牛血清+100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素)，温度设置为40℃，5天之后换液，之后每3天更换一次；步骤五：待到第一代细胞融合至80％左右后，消化离心处理后，取出5000个左右细胞在45孔板中进行种植并进行免疫荧光鉴定，剩余细胞均匀种植在两个100mm的培养皿中，将两组细胞分别命名为对照组和实验组；步骤六：将牙髓干细胞接种在100mm培养基中，待到细胞融合至80％左右后，将对照组的培养基去除，用psb清洗三次后更换为无血清dmem培养基，将实验组的培养基更换为无糖dmem培养基，并将培养皿置于厌氧培养罐(三菱产气罐anaeropacktm)(37℃、100％co2、)中继续培养90min后，将培养板中的无糖dmem更换为dmed培养基并置于普通培养箱继续培养48小时；步骤七：分别对对照组和实验组内的牙髓干细胞的外泌体进行提取，随后对蛋白进行提取；步骤八：测定蛋白浓度和蛋白标记物cd63、cd9的含量，最后统计对照组和实验组的浓度差异。步骤五中，将所有细胞平均种植于两组培养皿中，随后再将两组培养皿分别命名为对照组和实验组，并对实验组内的牙髓干细胞进行糖氧剥夺处理。步骤七中，对对照组和实验组内的牙髓干细胞的外泌体进行提取时，采用多聚物沉淀法进行提取。步骤八中，对对照组和实验组的牙髓干细胞内的蛋白浓度进行测定时采用bca测定，二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的bcasolutiona(含有bca)相互作用产生敏感的颜色反应，两分子的bca螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物，水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。bca蛋白浓度测定：蛋白浓度计算：样本od值样本稀释后浓度原浓度对照组10.54630.4883620.976724对照组20.56480.5070271.014053对照组30.48610.4276260.855253实验组10.61560.5582791.116558实验组20.64750.5904631.180926实验组30.59480.5372941.074587综上所述，当培养温箱的培养温度为35℃时，培养出的对照组和实验组的牙髓干细胞的外泌体蛋白浓度和cd63灰度值最高，牙髓干细胞的外泌体蛋白浓度最高为实验组的1.12mg/ml，cd63的灰度值最高为1.4×107，且得出的结论为糖氧剥夺可以促进牙髓干细胞分泌更多外泌体。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。当前第1页12