苹果树枝干腐烂病的致病菌鉴别引物及患病程度分级方法

本发明涉及致病菌鉴别技术领域，具体为苹果树枝干腐烂病的致病菌鉴别引物及患病程度分级方法。

背景技术：

苹果树的枝干腐烂病被果农称为果树的“癌症”，患病果树不仅会枝干残缺或整株死亡，甚至会传播至整片果园及周边果园，已成为制约苹果产业发展的主要因素之一。

现有技术对于病原菌的鉴别以患病组织的微生物分离培养结合dna条形码dnabarcode序列分析为主，病原菌的分离培养主要使用pda培养基，dna条形码序列包括rdna-its、核糖体大亚基片段、转录延长因子和β微管蛋白等。这种分离后鉴定的方式具有极其明确的针对性，将病原菌限定在真菌的范畴，而忽视了致病细菌在苹果树的枝干腐烂过程中的影响。此外，还存在很多无法培养的微生物，或者在现有培养条件下生长受到限制的微生物，都可能在苹果树的枝干腐烂过程中发挥着作用，但因无法分离纯化而被忽视。

本研究利用苹果树的枝干腐烂组织宏基因组构建rdna克隆文库，通过对患病组织的微生物种类和丰度进行定性和定量分析，应用主成分分析法pca筛选出高丰度的微生物，设计特异性的鉴定引物，利用qpcr技术对不同患病程度果树中的特定微生物进行定量分析，建立病害程度的检测和分级标准，为苹果树的枝干腐烂病的早期检测和科学防治提供技术支撑。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供苹果树枝干腐烂病的致病菌鉴别引物及患病程度分级方法，能够用来对苹果树枝干腐烂病的患病状态及患病程度进行效果良好的qpcr检测，进而实现对对苹果树枝干腐烂病的患病状态及患病程度的判定，有助于建立病害程度的检测和分级标准，为苹果树的枝干腐烂病的早期检测和科学防治提供技术支撑。

为实现上述目的，本发明苹果树枝干腐烂病的致病菌鉴别引物，鉴别引物的核苷酸序列为：

methylobacteriumbrachiatum-f：5’-agggaaccccggayctctc-3’，

methylobacteriumbrachiatum-r：5’-tccacgccgtaaacgaygaa-3’；

sphingomonasaquatilis-f：5’-gtatctaatcctgtttgctycc-3’，

sphingomonasaquatilis-r：5’-gctcaactccagaaytgcc-3’；

aureobasidiumpullulans-f：5’-aaattctactacgcytaaagcc-3’，

aureobasidiumpullulans-r：5’-catcgaatctttgaaygcac-3’；

valsamali-f：5’-gaaatgacgctcgaayaggc-3’，

valsamali-r：5’-tgcacccagaaaycctttgt-3’；

botryococcusbraunii-f：5’-ctaccttgttacgacytcacc-3’，

botryococcusbraunii-r：5’-gagccaacctcaaaaaycc-3’;

cladosporiumallicinum-f：5’-caccctttagcgaatagyttcc-3’，

cladosporiumallicinum-r：5’-gtcatttcaccactyaagcc-3’；

didymellakeratinophila-f：5’-gagacaaacaccyaacacc-3’，

didymellakeratinophila-r：5’-gcagcgaaatgcgayaagtag-3’；

stagonosporopsislupini-f：5’-gacaaacacccaacaycaag-3’，

stagonosporopsislupini-r：5’-cgcagcgaaatgcgayaag-3’；

cladosporiumdelicatulum-f：5’-ttaggggacagaagayccag-3’，

cladosporiumdelicatulum-r：5’-cgcagcgaaatgcgayaag-3’。

苹果树枝干腐烂病患病程度分级方法，有如下步骤：

s1.提取多组待测苹果树树皮样本宏基因组dna；

s2.以待测苹果树树皮样本宏基因组dna为模板，使用9对致病菌鉴别引物进行qpcr检测；

s2.1.qpcr检测条件为：95℃，600s；95℃，30s，53℃，30s；72℃，30s；在延伸阶段检测荧光强度，收集信号，45个循环；

s2.2.qpcr体系每10μl包括：

h2o:3.6μl;

forwardprimer:0.2μl;

reverseprimer:0.2μl;

2xqpcrmix:5μl;

template:1μl。

进一步的，若qpcr检测结果表明待测苹果树样本的methylobacteriumbrachiatum、sphingomonasaquatilis或aureobasidiumpullulans菌株含量最高，未检测出或仅检测出微量的valsamali、botryococcusbraunii、stagonosporopsislupini、cladosporiumallicinum、didymellakeratinophila或cladosporiumdelicatulum菌株，则表明待测苹果树处于健康状态。

进一步的，若qpcr检测结果表明待测苹果树样本的valsamali或botryococcusbraunii菌株含量最高，未检测出或仅检测出微量的stagonosporopsislupini、cladosporiumallicinum、didymellakeratinophila或cladosporiumdelicatulum菌株，则表明待测苹果树已经患病。

进一步的，若qpcr检测结果表明待测苹果树样本的stagonosporopsislupini、cladosporiumallicinum、didymellakeratinophila或cladosporiumdelicatulum菌株含量最高，则表明待测苹果树已濒临死亡。

进一步的，所述的步骤s1.提取多组待测苹果树树皮样本宏基因组dna包括有如下步骤：

s1.1.对苹果树树皮样本进行液氮研磨；

s1.2.加入750μl的65℃预热的2%ctab缓冲液，再加入30μl的10%pvp液，最后于通风橱下加10μl的β-巯基乙醇，颠倒混匀；

s1.3.60~65℃恒温水浴1h，每隔10min左右颠倒混匀一次；

s1.4.水浴结束后，取出离心管，冷却至室温；

s1.5.通风橱下加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（v/v：25:24:1），轻轻颠倒混匀约10次；

s1.6.12000rpm离心10min，将上清液转至一新的ep管；

s1.7.加入0.6~0.8倍体积预冷的异丙醇，缓慢颠倒混匀，冰上放置30min；

s1.8.12000rpm，离心5min；

s1.9.弃上清，加入70%的乙醇漂洗1次，弃去上清液，4℃条件下，12000rpm，离心5min，齐去残留上清液，室温下干燥；

s1.10.dna沉淀干燥后，加入200μl的1×te（ph8.0）溶解dna，-20℃保存。

本发明的有益效果是：苹果树枝干腐烂病的致病菌鉴别引物的核苷酸序列为：methylobacteriumbrachiatum-f：5’-agggaaccccggayctctc-3’，

methylobacteriumbrachiatum-r：5’-tccacgccgtaaacgaygaa-3’；

sphingomonasaquatilis-f：5’-gtatctaatcctgtttgctycc-3’，

sphingomonasaquatilis-r：5’-gctcaactccagaaytgcc-3’；

aureobasidiumpullulans-f：5’-aaattctactacgcytaaagcc-3’，

aureobasidiumpullulans-r：5’-catcgaatctttgaaygcac-3’；

valsamali-f：5’-gaaatgacgctcgaayaggc-3’，

valsamali-r：5’-tgcacccagaaaycctttgt-3’；

botryococcusbraunii-f：5’-ctaccttgttacgacytcacc-3’，

botryococcusbraunii-r：5’-gagccaacctcaaaaaycc-3’;

cladosporiumallicinum-f：5’-caccctttagcgaatagyttcc-3’，

cladosporiumallicinum-r：5’-gtcatttcaccactyaagcc-3’；

didymellakeratinophila-f：5’-gagacaaacaccyaacacc-3’，

didymellakeratinophila-r：5’-gcagcgaaatgcgayaagtag-3’；

stagonosporopsislupini-f：5’-gacaaacacccaacaycaag-3’，

stagonosporopsislupini-r：5’-cgcagcgaaatgcgayaag-3’；

cladosporiumdelicatulum-f：5’-ttaggggacagaagayccag-3’，

cladosporiumdelicatulum-r：5’-cgcagcgaaatgcgayaag-3’。

鉴别引物具有良好的特异性，能够对健壮果树中methylobacteriumbrachiatum、sphingomonasaquatilis和aureobasidiumpullulans三种菌株、患病果树中valsamali和botryococcusbraunii两种菌株和患病后枯死果树中stagonosporopsislupini、cladosporiumallicinum、didymellakeratinophila和cladosporiumdelicatulum四种菌株基因组dna进行特异性扩增，无引物二聚体产生和非特异性扩增，能够用来对潜伏期的苹果树枝干腐烂病的患病状态及患病程度进行高精确度的检测，进而实现对对苹果树枝干腐烂病的患病状态及患病程度的判定，有助于建立病害程度的检测和分级标准，为苹果树的枝干腐烂病的早期检测和科学防治提供技术支撑。

附图说明

图1为本发明引物设计时树皮宏基因组电泳图；

图2为本发明以5组枝干腐烂样本的宏基因组dna为模板使用不同引物扩增rdna图；

图3为本发明touchdownpcr扩增结果图；

图4为本发明统发育树示意图；

图5为本发明枝干腐烂样本中各微生物的丰度图；

图6为本发明枝干腐烂样本中微生物丰度pca分析图；

图7为本发明提取的苹果树树皮样本宏基因组dna琼脂糖凝胶电泳图；

图8为本发明健壮苹果树树皮样本的微生物丰度图；

图9为本发明患病苹果树树皮样本的微生物丰度图；

图10为本发明患病后枯死苹果树树皮样本的微生物丰度图；

图11为本发明1号未知样本枝干腐烂病致病菌丰度检测结果；

图12为本发明2号未知样本枝干腐烂病致病菌丰度检测结果；

图13为本发明3号未知样本枝干腐烂病致病菌丰度检测结果。

具体实施方式

本发明苹果树枝干腐烂病的致病菌鉴别引物，鉴别引物的核苷酸序列为：

methylobacteriumbrachiatum-f：5’-agggaaccccggayctctc-3’，

methylobacteriumbrachiatum-r：5’-tccacgccgtaaacgaygaa-3’；

sphingomonasaquatilis-f：5’-gtatctaatcctgtttgctycc-3’，

sphingomonasaquatilis-r：5’-gctcaactccagaaytgcc-3’；

aureobasidiumpullulans-f：5’-aaattctactacgcytaaagcc-3’，

aureobasidiumpullulans-r：5’-catcgaatctttgaaygcac-3’；

valsamali-f：5’-gaaatgacgctcgaayaggc-3’，

valsamali-r：5’-tgcacccagaaaycctttgt-3’；

botryococcusbraunii-f：5’-ctaccttgttacgacytcacc-3’，

botryococcusbraunii-r：5’-gagccaacctcaaaaaycc-3’;

cladosporiumallicinum-f：5’-caccctttagcgaatagyttcc-3’，

cladosporiumallicinum-r：5’-gtcatttcaccactyaagcc-3’；

didymellakeratinophila-f：5’-gagacaaacaccyaacacc-3’，

didymellakeratinophila-r：5’-gcagcgaaatgcgayaagtag-3’；

stagonosporopsislupini-f：5’-gacaaacacccaacaycaag-3’，

stagonosporopsislupini-r：5’-cgcagcgaaatgcgayaag-3’；

cladosporiumdelicatulum-f：5’-ttaggggacagaagayccag-3’，

cladosporiumdelicatulum-r：5’-cgcagcgaaatgcgayaag-3’。

苹果树枝干腐烂病患病程度分级方法，有如下步骤：

s1.提取多组待测苹果树树皮样本宏基因组dna；

s2.以待测苹果树树皮样本宏基因组dna为模板，使用9对致病菌鉴别引物进行qpcr检测；

s2.1.qpcr检测条件为：95℃，600s；95℃，30s，53℃，30s；72℃，30s；在延伸阶段检测荧光强度，收集信号，45个循环；

s2.2.qpcr体系每10μl包括：

h2o:3.6μl;

forwardprimer:0.2μl;

reverseprimer:0.2μl;

2xqpcrmix:5μl;

template:1μl。

进一步的，若qpcr检测结果表明待测苹果树样本的methylobacteriumbrachiatum、sphingomonasaquatilis或aureobasidiumpullulans菌株含量最高，未检测出或仅检测出微量的valsamali、botryococcusbraunii、stagonosporopsislupini、cladosporiumallicinum、didymellakeratinophila或cladosporiumdelicatulum菌株，则表明待测苹果树处于健康状态。

进一步的，若qpcr检测结果表明待测苹果树样本的valsamali或botryococcusbraunii菌株含量最高，未检测出或仅检测出微量的stagonosporopsislupini、cladosporiumallicinum、didymellakeratinophila或cladosporiumdelicatulum菌株，则表明待测苹果树已经患病。

进一步的，若qpcr检测结果表明待测苹果树样本的stagonosporopsislupini、cladosporiumallicinum、didymellakeratinophila或cladosporiumdelicatulum菌株含量最高，则表明待测苹果树已濒临死亡。

进一步的，所述的步骤s1.提取多组待测苹果树树皮样本宏基因组dna包括有如下步骤：

s1.1.对苹果树树皮样本进行液氮研磨；

s1.2.加入750μl的65℃预热的2%ctab缓冲液，再加入30μl的10%pvp液，最后于通风橱下加10μl的β-巯基乙醇，颠倒混匀；

s1.3.60~65℃恒温水浴1h，每隔10min左右颠倒混匀一次；

s1.4.水浴结束后，取出离心管，冷却至室温；

s1.5.通风橱下加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（v/v：25:24:1），轻轻颠倒混匀约10次；

s1.6.12000rpm离心10min，将上清液转至一新的ep管；

s1.7.加入0.6~0.8倍体积预冷的异丙醇，缓慢颠倒混匀，冰上放置30min；

s1.8.12000rpm，离心5min；

s1.9.弃上清，加入70%的乙醇漂洗1次，弃去上清液，4℃条件下，12000rpm，离心5min，齐去残留上清液，室温下干燥；

s1.10.dna沉淀干燥后，加入200μl的1×te（ph8.0）溶解dna，-20℃保存。

本发明在引物设计时，在果园随机采取5组枝干腐烂树皮样本，使用步骤s1的方法提取腐烂树皮样本宏基因组，并以提取的5组枝干腐烂样本的宏基因组dna，图1为模板，图1中，1-5为枝干腐烂样本的宏基因组dna，m为λ-ecot14idigestmarker；以不同rdna区域的引物进行pcr扩增，结果如图2所示，图2中m为trans2k®plusiidnamarker，不同引物均可扩增得到相应的rdna片段，其中以引物rd1（aaggaggtgatccagcc）/27f（agagtttgatcmtggctcag）和its4（tcctccgcttattgatatgc）/its5（ggaagtaaaagtcgtaacaagg）扩增得到的条带亮度高，条带非特异性扩增少、相对单一。但以2号枝干腐烂样本宏基因组dna为模板均未得到扩增产物，因此利用touchdownpcr方法，以rd1/27f和its4/its5为引物对pcr条件进行优化，所有样本均得特异性的扩增产物，如图3所示，图3中m为λ-ecot14λ-ecot14idigestmarker。胶回收扩增得到的rdna片段，分别克隆至载体puc57，构建得到rdna克隆文库。随机挑选出119个克隆送测，测序共得到29种不同rdna序列，blast序列比对结果表明，克隆出17种真菌、8种细菌和4种叶绿体dna序列，以最大似然法ml构建系统发育树如图4所示。

进行枝干腐烂病致病菌的特异性鉴别引物筛选，针对之前鉴别得到的29种微生物，分别设计qpcr检测引物，作为各微生物的特异性鉴别引物，如表1所示。以梯度稀释(1×10²-1×10⁸copies/μl)的含有不同真菌和细菌rdna序列的质粒为模板，制作绝对定量标准曲线，并定量检测5个枝干腐烂样本中各微生物的丰度。结果如图5所示，qpcr共定量检测出17种微生物，其中细菌4种，真菌13种。依据各微生物的丰度copies/ng宏基因组dna，使用r语言vegan包进行主成分分析pca，结果图6所示，表明成分1和成分2的累积方差贡献率为83.9%，成分1中valsamali、aureobasidiumpullulans等有较高的因子载荷，成分2中trebouxiasp.和loriellopsiscavernicola等有较高的因子载荷。图6中，中间重叠的部分表示此处集中成分的累积方差贡献率非常小。依据各微生物丰度在成分1和成分2中的因子载荷，选取了11个高因子载荷的微生物作为枝干腐烂病的分级指标，其特异性鉴别引物如表2所示。

表1.患枝干腐烂病的苹果树携带微生物的特异性鉴别引物

表2.枝干腐烂病致病菌的特异性鉴别引物

健康果树携带的微生物丰度检测：

取3组健壮苹果树树皮样本，首先根据步骤s1.1到步骤s1.10对每组样本进行宏基因组dna提取，并对提取到的苹果树树皮样本宏基因组dna进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图7所示，dna条带均单一、清晰，可满足后续qpcr试验条件，图中，m为marker：λ-ecot14idigest；1-1、1-2和1-3为健壮苹果树样本宏基因组dna。

根据步骤s1和s2，使用表文中的11对枝干腐烂病致病菌的特异性鉴别引物对3组健壮苹果树树皮样本进行qpcr检测，结果如图8所示，健壮苹果树样本中methylobacteriumbrachiatum、sphingomonasaquatilis和aureobasidiumpullulans菌株含量最高，宏基因组dna分别达到4988copies/ng、6308copies/ng、3583copies/ng，均显著高于其他8种微生物的含量。因此，检测到高丰度的methylobacteriumbrachiatum、sphingomonasaquatilis或aureobasidiumpullulans等3种微生物，并且未检测出或仅检测到微量的其他8种微生物，表明苹果树处于健康状态。

枝干腐烂病患病果树携带的微生物丰度检测：

取3组患病苹果树树皮样本，首先根据步骤s1.1到步骤s1.10对每组样本进行宏基因组dna提取，并对提取到的苹果树树皮样本宏基因组dna进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，dna条带均单一、清晰，可满足后续qpcr试验条件，图中，m为marker：λ-ecot14idigest；2-1、2-2和2-3为患病苹果树样本宏基因组dna。

根据步骤s1和s2，使用表2中的11对枝干腐烂病致病菌的特异性鉴别引物对3组患病苹果树树皮样本进行qpcr检测。结果如图9所示，患病苹果树样本中valsamali和botryococcusbraunii菌株含量最高，宏基因组dna分别达到2.25×10⁵copies/ng和2.74×10⁴copies/ng，均显著高于其他9种微生物的含量。因此，检测到高丰度的valsamali或botryococcusbraunii等2种微生物，并且未检测出或仅检测到微量的其他9种微生物，表明该苹果树已经患枝干腐烂病。

枝干腐烂病致死果树携带的微生物丰度检测：

取3组患病后枯死苹果树树皮样本，首先根据步骤s1.1到步骤s1.10对每组样本进行宏基因组dna提取，并对提取到的苹果树树皮样本宏基因组dna进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，条带均单一、清晰，可满足后续qpcr试验条件，图中，m为marker：λ-ecot14idigest；3-1、3-2和3-3为患病后枯死苹果树样本宏基因组dna。

根据步骤s1和s2，使用表2中的11对枝干腐烂病致病菌的特异性鉴别引物对3组患病后枯死苹果树树皮样本进行qpcr检测。结果如图10所示，患病后枯死苹果树样本中stagonosporopsislupini、cladosporiumallicinum、didymellakeratinophila和cladosporiumdelicatulum菌株含量最高，宏基因组dna分别达到2.48×104copies/ng、2.39×104copies/ng、1.52×104copies/ng、1.21×104copies/ng，均显著高于其他7种微生物的含量。

因此，检测到高丰度的stagonosporopsislupini、cladosporiumallicinum、didymellakeratinophila和cladosporiumdelicatulum等4种微生物，并且未检测出或仅检测到微量的其他7种微生物，表明该苹果树已经因患枝干腐烂病而濒临死亡。

分别在某地3个果园中采集苹果树皮样本，分别标注为1号、2号、3号未知样品。根据本步骤s1.提取待测苹果树树皮样本宏基因组dna；使用本发明的9对枝干腐烂病致病菌的特异性鉴别引物，根据步骤s2.对待测苹果树样品的患病程度进行鉴别。qpcr检测条件为：95℃，600s；95℃，30s，53℃，30s；72℃，30s；在延伸阶段检测荧光强度，收集信号，45个循环；qpcr体系每10μl包括：h2o:3.6μl;forwardprimer:0.2μl;reverseprimer:0.2μl;2xqpcrmix:5μl;template:1μl;

鉴别引物的核苷酸序列为：

methylobacteriumbrachiatum-f：5’-agggaaccccggayctctc-3’，

methylobacteriumbrachiatum-r：5’-tccacgccgtaaacgaygaa-3’；

sphingomonasaquatilis-f：5’-gtatctaatcctgtttgctycc-3’，

sphingomonasaquatilis-r：5’-gctcaactccagaaytgcc-3’；

aureobasidiumpullulans-f：5’-aaattctactacgcytaaagcc-3’，

aureobasidiumpullulans-r：5’-catcgaatctttgaaygcac-3’；

valsamali-f：5’-gaaatgacgctcgaayaggc-3’，

valsamali-r：5’-tgcacccagaaaycctttgt-3’；

botryococcusbraunii-f：5’-ctaccttgttacgacytcacc-3’，

botryococcusbraunii-r：5’-gagccaacctcaaaaaycc-3’;

cladosporiumallicinum-f：5’-caccctttagcgaatagyttcc-3’，

cladosporiumallicinum-r：5’-gtcatttcaccactyaagcc-3’；

didymellakeratinophila-f：5’-gagacaaacaccyaacacc-3’，

didymellakeratinophila-r：5’-gcagcgaaatgcgayaagtag-3’；

stagonosporopsislupini-f：5’-gacaaacacccaacaycaag-3’，

stagonosporopsislupini-r：5’-cgcagcgaaatgcgayaag-3’；

cladosporiumdelicatulum-f：5’-ttaggggacagaagayccag-3’，

cladosporiumdelicatulum-r：5’-cgcagcgaaatgcgayaag-3’。

检测结果显示分别如图11、图12和图13所示，如图11所示，1号未知样本中患病致死标志微生物cladosporiumallicinum含量最高，宏基因组dna达到9492±1513copies/ng，同时检出较高丰度的健康果树标志微生物aureobasidiumpullulans和sphingomonasaquatilis，宏基因组dna含量分别达到5757±419宏基因组dna和4592±63copies/ng，但未检测出或仅检测到微量的枝干腐烂病标志微生物valsamali和botryococcusbraunii。表明1号未知样本目前虽表现为健康状态，但因有高丰度患病致死标志微生物的检出，说明其生长状态存在隐患，需要加强果园管理，防止树势衰弱，导致枝干腐烂病致病菌侵染。

如图12所示，2号未知样本检测出高丰度的患病致死标志微生物stagonosporopsislupini的宏基因组dna为16968±1571copies/ng和枝干腐烂病标志微生物valsamali的宏基因组dna为15126±804copies/ng，并且仅检测到微量的健康果树标志微生物，表明2号未知样本已出现较为严重的枝干腐烂病情况，且有患病致死的可能性，需要立即采取治疗措施。

如图13所示，3号未知样本检测出高丰度的患病致死标志微生物cladosporiumallicinum宏基因组dna含量达到3784±500copies/ng，其含量显著高于其他患病等级的标志性微生物，表明3号未知样本已濒临死亡，需要及时移除患病树木，减少养分浪费。

本发明共公布11对枝干腐烂病致病菌的特异性鉴别引物，其中9对引物可用于对苹果树枝干腐烂病患病程度的分级判别，能够对健壮果树中methylobacteriumbrachiatum、sphingomonasaquatilis和aureobasidiumpullulans三种菌株、患病果树中valsamali和botryococcusbraunii两种菌株和患病后枯死果树中stagonosporopsislupini、cladosporiumallicinum、didymellakeratinophila和cladosporiumdelicatulum四种菌株基因组dna进行特异性扩增，无引物二聚体产生和非特异性扩增。通过对苹果树枝干腐烂病的患病状态及患病程度进行高灵敏度的检测，进而实现对潜伏期的苹果树枝干腐烂病的患病状态及患病程度的判定，有助于建立病害程度的检测和分级标准，为苹果树的枝干腐烂病的早期检测和科学防治提供技术支撑。