二氧化钛纳米粒子培养基的制备方法

本发明涉及培养基制备技术领域，特别涉及一种二氧化钛纳米粒子培养基的制备方法。

背景技术：

二氧化钛纳米粒子，也被称为钛白粉，是直径在100nm以下，外观为白色疏松粉末，具有抗菌、抗氧化的功能，目前被广泛应用于化妆品、功能纤维、塑料、涂料乃至食品等领域。但如此广泛的应用也导致二氧化钛被大量的排放入环境，被人体直接或间接吸收，成为潜在的毒性物质。有鉴于此，环境毒理学中均需针对二氧化钛的生物效应及毒副作用展开研究。

体外细胞实验是进行生物效应评价的主要手段之一。然而，二氧化钛纳米粒子不溶于水，进入培养基后极易聚团沉淀，使培养基中的纳米粒子浓度迅速降低，因此给其生物学评价试验带来了巨大的不便。目前的研究中多采用高盐(8％，质量浓度)溶液配合超声进行，但由于细胞培养中的盐浓度有限，原本的高盐溶液被培养基稀释后，盐浓度降低，进而失去原本的分散效果，纳米粒子依然会迅速聚团，仍不利于生物效应研究。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种二氧化钛纳米粒子培养基的制备方法，通过结合表面活性剂及超声分散的方法使二氧化钛纳米粒子均匀分散于培养基中，进而可用于生物效应研究中。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种二氧化钛纳米粒子培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)将二氧化钛纳米粒子与吐温20混合，得到的混合液在冰浴条件下超声处理；

2)将步骤1)得到的二氧化钛-吐温20混合液加入血清的质量分数为1％-10％的细胞培养基中；

3)将步骤2)得到的混合溶液进行超声处理，得到二氧化钛纳米粒子培养基。

优选的是，所述步骤1)中二氧化钛纳米粒子的质量与吐温体积的比例小于50mg:1ml。

优选的是，所述步骤1)中二氧化钛纳米粒子的粒径小于20nm。

优选的是，所述步骤1)具体为：将二氧化钛纳米粒子与吐温20加入容器中混合后，将该容器置于冰浴中，再利用超声细胞裂解仪超声处理1分钟。

优选的是，所述超声细胞裂解仪进行超声处理的具体参数为：在频率40khz、功率900w下，超声处理1s，间隔1s，循环30次。

优选的是，所述步骤2)中加入到细胞培养基中的二氧化钛-吐温20混合液的体积不超过细胞培养基体积的0.5％。

优选的是，所述细胞培养基为dmem培养基、dmem/f12培养基、rpmi1640培养基或william'se培养基。

优选的是，所述步骤3)具体为：将步骤2)得到的混合溶液置于容器中，然后将该容器置于超声清洗仪中，超声处理1-2h。

优选的是，所述步骤3)中，超声清洗仪进行超声处理的具体参数为：频率10khz，功率100w。

本发明的有益效果是：本发明通过结合表面活性剂及超声分散的方法使二氧化钛纳米粒子能均匀稳定分散于培养基中，所制备的培养基能够稳定保持至少2天，从而便于在体外研究二氧化钛纳米粒子的生物效应；本发明的制备方法简单易行、易于操作，且可重复性强，可为纳米粒子生物效应研究提供良好的对象。

附图说明

图1为实施例2制得的培养基中二氧化钛纳米粒子的透射电镜检测结果图。

图2a-2f为实施例2和对比例1制备的培养基在0h、24h、48h的水合半径分布图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供一种二氧化钛纳米粒子培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)称取商业化的二氧化钛纳米粒子与吐温20加入容器中混合后，将该容器立即置于冰浴中，再利用超声细胞裂解仪超声处理1分钟。

其中，二氧化钛纳米粒子的质量与吐温体积的比例小于50mg:1ml，即每1ml吐温种添加的二氧化钛纳米粒子的质量不大于50mg，否则二氧化钛纳米粒子密度过大容易导致其无法在吐温20中保持悬浮。进一步的，其中二氧化钛纳米粒子的粒径小于20nm。

其中，冰浴中需保证整个容器在超声过程中的完全浸没，可保证超声过程中的散热，从而使加热过程不会过热，而导致二氧化钛纳米粒子被破坏。

在优选的实施例中，超声细胞裂解仪超声处理的具体参数为：在频率40khz、功率900w下，超声处理1s，间隔1s，循环30次。在此参数下超声分散处理可将二氧化钛纳米粒子与吐温充分混合20，并使吐温20覆盖二氧化钛纳米粒子表面，从而使二氧化钛纳米粒子不会被水分子接触而导致聚团沉淀。

2)将步骤1)得到的二氧化钛-吐温20混合液加入血清的质量分数为1％-10％的细胞培养基中。

其中，加入到细胞培养基中的二氧化钛-吐温20混合液的质量不超过细胞培养基质量的0.5％，以保证二氧化钛-吐温20混合液不对细胞产生不良影响。

其中，所述细胞培养基为dmem培养基、dmem/f12培养基、rpmi1640培养基或william'se培养基，来源可为gibco、thermofisher等公司。

其中，血清可购买于杭州四季青、thermofisher等公司，血清浓度控制为1-10％，以提高二氧化钛纳米粒子在培养基中的稳定性，否则二氧化钛-吐温20体系仍会在无血清培养基中逐渐被破坏。

3)将步骤2)得到的混合溶液置于容器中，然后将该容器置于超声清洗仪中，超声处理1-2h，得到二氧化钛纳米粒子培养基，该二氧化钛纳米粒子培养基可稳定保持2-3天。

其中，超声清洗仪超声处理的具体参数为：频率10khz，功率100w。该频率和功率设置能保证超声过程中不会过热导致培养基成分损失，同时又能使培养基中的二氧化钛-吐温20复合物充分分散，能防止二氧化钛纳米粒子-吐温20复合物在培养基中浓度过高时，相互碰撞导致二氧化钛纳米粒子-吐温20复合物体系破裂。

以上为本发明的总体构思，以下再提供详细的实施例，以对本发明做进一步说明。

实施例1

一种二氧化钛纳米粒子培养基的制备方法，包括以下步骤：

1、称取商业化的二氧化钛纳米粒子(阿拉丁试剂(上海)有限公司，99.8％纯度，5-10nm，锐钛，亲水型，货号t104949)50mg，向其中加入吐温20(生工生物工程(上海)有限公司)，分析纯，货号a100777)1ml，所得混合液立即置于冰浴中，并使用超声细胞破碎仪进行处理1分钟，超声仪设置为：频率40khz，功率900w，超声时间1s，间隔1s，进行30次。

2、取20微升步骤1制得的二氧化钛-吐温20混合液加入到10ml含10％胎牛血清的dmem培养基中；其中，胎牛血清来自杭州四季青生物工程材料有限公司，dmem培养基来自gibco公司。

3、将步骤3所获得的混合液置于超声清洗仪中超声分散处理1.5h，制得二氧化钛纳米粒子培养基，超声清洗仪设置为：频率10khz，功率100w。

采用透射电镜检测所获得的二氧化钛纳米粒子培养基中的二氧化钛纳米粒子分布情况，发现其呈一定的聚集，大约为70-80nm。

实施例2

一种二氧化钛纳米粒子培养基的制备方法，包括以下步骤：

1、称取商业化的二氧化钛纳米粒子(阿拉丁试剂(上海)有限公司，99.8％纯度，10-20nm，锐钛，亲水型，货号t104949)50mg，向其中加入吐温20(生工生物工程(上海)有限公司)，分析纯，货号a100777)1ml，所得混合液立即置于冰浴中，并使用超声细胞破碎仪进行处理，超声仪设置为：频率40khz，功率900w，超声时间1s，间隔1s，进行30次。

2、取20微升步骤1制得的二氧化钛-吐温20混合液加入到10ml含10％胎牛血清的dmem培养基中；其中，胎牛血清来自杭州四季青生物工程材料有限公司，dmem培养基来自gibco公司。

3、将步骤3所获得的混合液置于超声清洗仪中超声分散处理1h，制得二氧化钛纳米粒子培养基，超声清洗仪设置为：频率10khz，功率100w。

采用透射电镜检测所获得的二氧化钛纳米粒子培养基中的二氧化钛纳米粒子分布情况，发现其呈一定的聚集，大约为70-80nm，参照图1为实施例2制得的培养基中二氧化钛纳米粒子的透射电镜(leicatcssp5ii,leicamicrosystems,wetzlar,germany)检测结果图。

对比例1

按照传统方法，将与实施例2相同来源的二氧化钛纳米粒子直接溶解于dmem培养基(与实施例2来源相同)(无血清)中，得到传统的含有二氧化钛纳米粒子的培养基。

将实施例2和对比例1获得的培养基均置于37摄氏度培养箱中保存，分别于0h(初配好)、24h、48h进行水合直径检测，由zeta电位仪(malvernzeta-sizernanozs90，worcestershire,uk)检测获得，测试培养基中的纳米粒子的稳定性，测试结果如图2a-2f所示，图2a、2c、2e分别为实施例2制备的培养基在0h、24h、48h的水合半径分布图(水合半径为水合直径的一半)，图2b、2d、2f分别为实施例2制备的培养基在0h、24h、48h的水合半径分布图。

水合直径的统计结果如下表1所示。

表1

从上述结果可以看出，实施例2获得的培养基中的纳米粒子的水合直径更小，且至少能在48h内保持很好的稳定，其性能显著优于对比例1。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。