具有抑制细丽外担菌活性作用的贝莱斯芽孢杆菌JXJb01及其应用的制作方法

具有抑制细丽外担菌活性作用的贝莱斯芽孢杆菌jxj b01及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种分离自油茶种子的贝莱斯芽孢杆菌jxj b01及其应用。


背景技术：

2.油茶泛指山茶属中具有生产价值的油用物种，在世界上分布不广，我国是其自然分布的中心地区，油茶产量占世界95%以上。茶油有“东方橄榄油”之美誉。近年来，随着生活水平的提高，茶油越来越受到人们的青睐，我国油茶林面积也因此迅速增加，2019年已达6700多万亩，2025年将达到9000万亩。
3.据调查，油茶病害有50多种，其中油茶叶肿病分布广、发生普遍、危害严重，其病因是细丽外担菌（exobasidium gracile）感染油茶幼果嫩叶，导致感染组织肿大、变形、肉质化，产生茶苞茶耳，病株率高达40%
‑
96%，严重影响油茶生长，使油茶果减产20%
‑
41.9%，严重病株果实损失可超过90%。
4.目前油茶叶肿病主要靠人工清除病叶防治，效率低，劳动强度大；另外，波尔多液和敌克松液等农药也是其常用防治剂，但长期使用波尔多液等农药会导致重金属铜和农药等污染土壤，并影响茶油品质。因此，随着我国油茶产业的迅猛发展，研制高效、环保新型油茶叶肿病防治剂具有重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明为解决上述中的技术问题，提供一种能够高效抑制细丽外担菌的贝莱斯芽孢杆菌，从而有效防治油茶叶肿病、茶饼病等的发生，提高油茶产量和品质，降低油茶生产成本。
6.本发明的是通过以下技术方案实现的：具有抑制细丽外担菌活性作用的贝莱斯芽孢杆菌jxj b01，分离自油茶种子，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号cgmcc no.21562，保藏日期为2020年12月28日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，电话：86
‑
10
‑
64807355。
7.本发明涉及的细菌jxj b01，经16s rrna基因序列（1539 bp）分析和同源性比较，确定其为芽孢杆菌属的微生物，命名为贝莱斯芽孢杆菌jxj b01，其16s rrna基因在genbank中的登录号是mw259979。菌株jxj b05细胞大小为0.5
‑
1.0
ꢀ×ꢀ
1.0
‑
1.5 μm，芽孢中生，在各种微生物培养基上均生长良好。
8.本发明提供对昆明小鼠无毒的贝莱斯芽孢杆菌jxj b01，将菌株采用细菌培养基培养48 h后，将培养液离心，分别收集上清液和菌体或芽孢沉淀，并以上清液和菌体或芽孢沉淀分别饲喂小鼠2周，小鼠生长正常，且小鼠粪便中检测到该菌芽孢，说明该菌及其代谢产物对小鼠等动物没有致病性或毒性。
9.本发明还提供贝莱斯芽孢杆菌jxj b01生物防治剂的2种制备方法。
10.方法一：配制微生物培养基，或采用食品加工厂等废水，补充适量的碳氮源后，调ph值至7.0
‑
7.5，121℃高压蒸汽灭菌30 min，冷却至30
‑
45℃后接入该菌，进行通气搅拌培养2
‑
6 d，即得到细菌细胞或芽孢密度为108~10
9 cfu/ml的液体制剂，该液体制剂可以直接用水稀释并喷于油茶林，该菌即可以在油茶林的土壤中生长，也可在油茶植株上定殖，从而有效抑制油茶叶肿病的发生。
11.方法二：将各种农业废弃物（或废弃食用菌菌糠等）和禽畜粪便等，混合均匀后将其含水量调至55%左右，接入菌株jxj b01的液体菌种，混匀后堆积成底宽1.2~1.5米、上宽1
‑
1.2米、高1
‑
1.5米的梯形，梯形长度根据场地，堆中间可插入或放入四周有小孔的小管，并进行通气发酵，4天后翻堆，并补充液体菌种，重新建堆，进行第二次发酵，4天后再次翻堆，补充液体菌种，重新建堆发酵3天即可结束，发酵物料可直接作为微生物有机肥，或先干燥至含水量低于30%后再包装。该固体发酵物含有丰富的植物生长所需要的各种营养成分，同时又含有大量贝莱斯芽孢杆菌jxj b01，既可以满足油茶等植物生长对各种营养的需求，又可以有效抑制油茶叶肿、茶饼病病等植物真菌性病害的发生。
12.本发明的贝莱斯芽孢杆菌jxj b01对油茶叶肿病和茶饼病的病原菌细丽外担菌具有很好的抑制作用，在农作物真菌性病害中具有良好的应用前景，可用于各种农作物真菌性病害的生物防治。
13.说明书附图图1 贝莱斯芽孢杆菌jxj b01和其它几株细菌对细丽外担菌的抑制作用。其中，1和3是贝莱斯芽孢杆菌jxj b01，菌株2、4、5、6是其它没有抑制活性的细菌。
14.图2 贝莱斯芽孢杆菌jxj b01与亲缘关系近的相关种系统进化树。> 50%的步长值（以重复1000次的百分率表示）在节点处标注。标尺，0.05%的序列分歧度。
15.图3 贝莱斯芽孢杆菌jxj b01产生的部分代谢产物对细丽外担菌的抑制活性。组分1为60%的甲醇洗脱的组分；组分2、3、4分别为80%的甲醇依次洗脱的3个组分；组分5位100%的甲醇洗脱的组分。
具体实施方案
16.实施例1 拮抗细丽外担菌的菌株分离与抗菌活性检测将采自江西省德安县油茶林的油茶种子，用75%的酒精先进行表面擦拭消毒后，再将种子浸泡于75%的酒精溶液5 min，无菌水洗涤除去酒精，再将种子浸泡于0.1%
‑
0.2%的hgcl2溶液10 min，无菌水洗涤除去hgcl2，无菌操作剥去外种皮，将种胚用无菌刀片切除薄片，贴于固体平板培养基上（配方：葡萄糖4 g，麦芽浸膏粉5 g，酵母浸膏粉4 g，水1000 ml，ph7.0），于28℃下培养1
‑
7 d后，发现部分种胚片上长出细菌，将其划线转接于新平板上，所得菌落形态和颜色一致，初步确定为同一种细菌，编号为jxj b01。将细丽外担菌涂布接种于上述固体平板培养基上，采用点接种的方法，将所分离的细菌、其它参照细菌接种于同一个平板上，置于22
‑
28℃下培养1
‑
5 d后，观察抑菌圈的产生。结果发现，从油茶种子中分离的细菌jxj b01在培养基中生长良好，其周围的细丽外担菌生长受到抑制，产生较大的抑菌圈（附图1）；而其它参照菌株对细丽外担菌均无抑制作用，甚至被细丽外担菌抑制，在培养基中生长极差（附图1）。
17.实施例2 菌株jxj b01的鉴定根据培养特征、形态特征、16s rrna基因序列等方法，对细菌jxj b01的分类学地位进行鉴定。细胞大小为0.5
‑
1.0
ꢀ×ꢀ
1.0
‑
3.5 μm，芽孢中生，培养2
‑
5 d后形成，在各种微生物培养基上均生长良好。经与genbank数据库中的16s rrna基因序列比较分析发现，该菌的16s rrna基因序列（1539 bp）与有效发表种bacillus velezensis cr
‑
502
t
（贝莱斯芽孢杆菌cr
‑
502
t
）cr
‑
502
t
的相似性达99.93%，在系统进化树上该菌与贝莱斯芽孢杆菌聚在一支（附图2），因此，结合上述形态学特征，将该菌鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，命名为贝莱斯芽孢杆菌jxj b01，该菌株的16s rrna基因序列在genbank数据库中的登录号为mw259979。该菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号cgmcc no.21562，保藏日期为2020年12月28日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，电话：86
‑
10
‑
64807355。
18.实施例3 菌株jxj b01的芽孢耐热性将细菌jxj b01培养足够时间，使其菌体均形成创伤芽孢，采用干热法和湿热法研究其芽孢的耐热性。（1）干热法：取200 μl培养液于无菌培养皿，置于温度为160℃的电热干燥箱中，每30 min取样一次，采用菌落平板计数法检测存活芽孢的数量；（2）湿热法：取200 μl培养液于无菌带塞试管中，置于高压蒸汽灭菌锅内，分别设置101、106、111、116和121℃的处理温度，当灭菌锅温度达到设定温度即开始计时，15 min后立即停止加热，采用平板菌落计数法检测存活芽孢的数量。两者均以等体积不加热的菌液芽孢数为对照组。试验结果显示，160℃干热处理30 min，存活芽孢数与未加热的对照组基本一样，均为5
×
10
8 cfu/ml；随着处理时间的延长，存活芽孢数量迅速降低，处理时间为60 min，存活芽孢为对照组的10%左右；但即使处理温度延长至150 min，存活芽孢仍然有1
×
10
3 cfu/ml左右。101℃湿热处理15 min，存活芽孢数与未加热的对照组基本一样，均为5
×
10
8 cfu/ml；随着处理温度的增加，存活芽孢数量迅速降低，106℃处理15 min时，存活芽孢为对照组的10%左右；但121℃处理15 min，存活芽孢仍然有1.5
×
10
3 cfu/ml左右。芽孢是普通环境中最耐热的生命形式，耐热性强的芽孢要121℃湿热灭菌12 min才能彻底杀灭。而本发明中的芽孢杆菌160℃干热处理150 min，或者121℃湿热灭菌15 min仍然有大量芽孢存活，因此，该菌对干热和湿热处理均有很好的抗性，耐热性强，适合微生物制剂生产过程中的加热干燥处理流程。
19.实施例4 菌株jxj b01抑制细丽外担菌活性成分的分析将菌株jxj b01接种于液体培养基，28℃下摇床振荡培养或发酵罐通气搅拌培养3 d，4500 r/min离心10 min，取上清，减压蒸馏浓缩，再用中压液相色谱反相硅胶柱对浓缩物进行初步分离，洗脱溶剂系统为去离子水/甲醇（1:0
→
···
→
0:1），定量收集洗脱液，减压蒸馏除去各洗脱组分的溶剂，采用平板琼脂扩散法检测各组分对细丽外担菌的拮抗活性，无活性的组分弃去，有活性的组分合并，采用中压液相色谱反相硅胶柱进一步细分，洗脱溶剂系统为去离子水/甲醇（1:0
→
8:2
→
···
→
2:8
→
0:1），分别收集各组分，减压蒸馏除去溶剂后，再将各样品配成浓度相同的溶液，采用平板法检测各组分的活性。结果显示，≤40%的甲醇溶液洗脱的组分没有活性，而60%的甲醇溶液洗脱的组分有活性，但80%的甲醇溶液洗脱的第1个组分没有活性，洗脱的第2、3个组分均有活性，100%的甲醇洗脱的组分也有活性，且抑菌圈的边缘似乎比前面三者均要清晰（附图3），因此，根据试验结果，可以确
定，该菌至少产生2
‑
3种抑制细丽外担菌的活性成分。
20.实施例5 高温处理对活性组分抑菌活性的影响将实施例4中第一次分离后合并的活性组分配成一定的浓度，采用无菌操作取5 μl样品溶液于无菌滤纸片（直径6 mm，滤纸片置于无菌培养皿中）上，然后置于电热干燥箱中加热处理60 min，处理温度为100
‑
120℃（对照组不加热处理），然后将滤纸片置于接有细丽外担菌的平板培养基上，25
‑
28℃下培养3
‑
7 d后，观察并测量抑菌圈的大小。结果显示，即使120℃干热处理60 min，样品活性仍然达到未处理组的97%以上。因此，该菌产生的活性组分是非蛋白质性质的小分子物质，耐热性好。
21.实施例6 菌株jxj b01对昆明小鼠的毒性试验将菌株接种于液体培养基中培养2
‑
4 d离心，分别收集上清液和菌体沉淀，菌体沉淀用等体积的无菌水重悬，配成菌悬液。分别用上清液和菌体重悬液作为小鼠饮用水源，对照组采用无菌水作为小鼠饮用水源（上清、菌体重悬液和无菌水各30只小鼠），连续饲喂小鼠1周，观察小鼠生长和死亡情况，并于第7天采集小鼠新鲜粪便于无菌三角瓶中，粪便采集后110℃干热处理60 min，再加入无菌水，用无菌玻璃棒压碎，并在摇床上振荡，使其充分松散，然后采用平板菌落计数检测其内的芽孢数。结果显示，饲喂该菌发酵上清液和沉淀重悬液试验组的小鼠生长没有明显异常情况，说明该菌发酵液和菌体对小鼠生长没有明显不利影响；小鼠粪便检测结果显示，上清液试验组和沉淀重悬液试验组的小鼠粪便中均含有该菌，且后者数量是前者数量的4000倍左右，这说明该菌能够在小鼠肠道中存活，但未对小鼠生长发育造成不良影响。因此，该菌对动物无毒或毒性极低。
22.实施例7 菌株jxj b01菌肥的生产方法一：配制微生物培养基，或采用食品加工厂等废水，补充适量的碳氮源后，调ph值至7.0
‑
7.5，121℃高压蒸汽灭菌30 min，冷却至30
‑
45℃后接入该菌，进行通气搅拌培养2
‑
6 d，即得到细胞或芽孢密度为108~10
9 cfu/ml的液体菌种制剂，该制剂可作为固体发酵接种剂，也可直接用水稀释100
‑
500倍后喷洒油茶林，或用无菌容器密封常温长期保存，使用时再打开。
23.方法二：将各种农业废弃物（或废弃食用菌菌棒等）和禽畜粪便等，混合均匀后将其含水量调至55%左右，接入菌株jxj b01的液体菌种，混匀后堆积成底宽1.2~1.5米、上宽1
‑
1.2米、高1
‑
1.5米的梯形，梯形长度根据场地，堆中间可插入或放入四周有小孔的小管，建好堆后可覆盖塑料薄膜保温保湿；然后进行通气发酵，3
‑
4天后翻堆，并补充液体菌种，重新建堆，进行第二次发酵，3
‑
4天后再次翻堆，补充液体菌种，重新建堆发酵3天即可结束，发酵物料可直接作为微生物有机肥，或先干燥至含水量低于30%后再包装。该固体发酵物含有丰富的植物生长所需要的各种营养成分，同时又含有大量贝莱斯芽孢杆菌jxj b01，既可以满足油茶等植物生长对各种营养的需求，又可以有效抑制油茶叶肿病等植物真菌性病害的发生。
24.实施例8 菌株jxj b01对油茶叶肿病的防治作用制备菌株jxj b01发酵液，用池塘水将其稀释200倍，使用喷雾器将其喷于油茶树上（实验地点为江西省德安县紫金袁村，人工油茶林），试验油茶树一共90棵（约1亩地），喷洒时间为3月中下旬；对照组用未接菌的无菌发酵培养基，以池塘水稀释相同倍数，采用相同的喷洒剂量，喷洒90棵油茶树，试验组和对照组之间间隔20米宽的缓冲带。在油茶叶肿病
发病期间，检测喷洒该菌制剂和未喷洒该菌制剂的油茶林叶肿病发病情况。结果（表1）显示，喷洒该菌制剂的油茶林未见叶肿病发生，而未喷洒该菌制剂的对照组有18棵油茶树出现不同程度的叶肿病，发病率为20%。因此，该菌对油茶叶肿病具有良好的防治效果。
25.表1 芽孢杆菌jxj b01对油茶叶肿病防治效果组 别油茶林面积（亩）油茶树数量（棵）发病树数量（棵）发病率（%）试验组19000对照组1901820