一种NAD激酶突变体及其应用的制作方法

一种nad激酶突变体及其应用
技术领域：
1.本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种能够将nad转化为nadp的nad激酶突变体。


背景技术：

2.氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(简称：辅酶ⅱ，英文名：nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，nadp)，是一种极为重要的核苷酸类辅酶。氧化型辅酶ii在氧化还原反应中传递质子、电子及能量，并且参与到很多细胞代谢反应中。辅酶ii在生命科学、酶催化不对称合成、医疗保健领域具有广泛的应用。
3.辅酶ii在生物中广泛存在，但含量极低。目前合成nadp的方法主要分为化学法和生物法。其中，化学法以烟酰胺为原料，经多步反应合成出nadp，但化学法存在反应路线长、反应条件苛刻、选择性差、容易生成副产物、收率低等问题，而且生产成本较高，需要使用有机溶剂，会造成环境污染问题。
4.生物法又分为传统的发酵法和酶法，其中发酵法是采用发酵或其它微生物培养技术，通过对酵母或其它微生物的分离、提取，得到nadp，比如罗氏公司就是使用发酵法制备nadp。但是该路线的原料耗费、能源消耗都非常大，原子利用率低、产量有限，生产成本高，限制了nadp的广泛应用。而酶催化合成nadp是一种更为高效的反应，具有反应条件温和、立体选择性强、相比于发酵法转化率高等优点。
5.nadp在生物体内的合成，主要在nad激酶的作用下，利用atp或多聚磷酸(poly(p))衍生物作为磷酸供体，催化nad磷酸化而获得。在已测序基因组的生物体内，大部分都可以搜索到nad激酶的同源基因，nad激酶的催化反应是nadp生物合成途径的最后一步，过量表达nad激酶可以有效提高体内nadp的含量。
6.文献journal of biological chemistry 1950,182(7):805-813最早在1950年从酿酒酵母细胞中纯化发现nad激酶，之后研究人员在鸽子的内脏中也纯化得到nad激酶。文献journal of bioscience and bioengineering,2004,98(5):391-393报道了来自于mycobacterium tuberculosis h37rv的nad激酶晶体结构，为后期蛋白质工程的研究提供了有力的工具。2005年，oganesyan报道了来源于thermotoga maritima的嗜热nad激酶，为nad激酶的结构改造提供了信息参考。2019年，kimura报道了来源于myxococcus xanthus的nad激酶，为后期的研究提供了更多资源。专利cn103409442a对一种nad激酶进行改造，最终产物nadp只获得14.5g/l，也严重制约着产业化的应用。
7.目前，报道的nad激酶在制备nadp的转化中普遍存在转化率低的问题，而且由于nad和nadp结构类似，反应结束后存在显著的底物残留，需要后处理才能够去除未完全转化的nad，因此使得后处理工艺变复杂，工业化生产成本居高不下。
8.为了提升nad激酶的催化效率，降低nadp的生物催化合成成本、提高nad激酶的工业应用价值，本发明对氨基酸进行改造，获得高催化活性的nad激酶突变体。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的nad激酶突变体。
10.一方面，本发明提供的nad激酶突变体的氨基酸序列是以seq id no.1所示的nad激酶为参考序列发生突变的氨基酸序列，在94、113、143、198、283位点发生单点或者多点突变。其中，第94位的tyr突变为arg，第113位的ser突变为arg或thr，第143位的met突变为ile，第198位的ala突变为ser，第283位的val突变为ala或gly。
11.进一步，所述nad激酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3、5、7、9、11、13所示。
12.进一步，所述nad激酶突变体的基因核苷酸序列如seq id no.4、6、8、10、12、14所示。
13.进一步，所述nad激酶突变体来源于myxococcus xanthus，野生型模板ncbi的登录号为aak82999.1。
14.进一步，所述nad激酶突变体表达于大肠杆菌e.coli bl(21)de3。
15.进一步，所述nad激酶突变体的表达载体为pet-24a。
16.另一方面，本发明提供了nad激酶突变体的应用，所述nad激酶突变体可应用在制备nadp的工艺中，催化nad转化为nadp。
17.进一步，所述底物nad浓度为10～42g/l。
18.进一步，所述nad激酶突变体为nad激酶酶粉或含有该nad激酶的全细胞或细胞破碎液，优选nad激酶细胞。
19.进一步，所述nad激酶酶粉浓度为1～10g/l。
20.进一步，所述nad激酶细胞浓度为5～50g/l。
21.进一步，该反应在缓冲溶液中进行，其中缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)缓冲液，优选磷酸盐缓冲液，缓冲液的浓度为50～100mmol/l。
22.进一步，该反应磷供体是由多聚磷酸或atp提供，浓度大于或等于20g/l。
23.进一步，该反应在ph＝6.0～8.0、温度为30～60℃下进行。
24.进一步，该反应所需反应时间在7～24h。
25.本发明的有益效果在于，本发明公开的nad激酶突变体能够将nad转化为nadp，提高了催化活性，实现了底物最高42g/l的催化，且催化时间由24h减少到7h，减少了副产物的生成，降低了生产成本，具有重大的工业化应用价值。
附图说明
26.图1实施例1中nad激酶的基因电泳图
27.图2实施例1中nad激酶的的表达电泳图
28.图3实施例2中nad激酶突变体的基因扩增电泳图
29.图4实施例10中nad激酶突变体转化产物图谱
具体实施方式
30.下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。
31.实施例1野生型nad激酶的诱导表达
32.将nad激酶的基因nad直接设计在pet-24a上，构建出重组质粒pet-24a-nad。在nad基因的两端分别引入ndei和ecori限制性内切酶位点，直接合成。将合成好的重组质粒转入bl21(de3)感受态，获得重组菌株。利用通用引物t7/t7-ter为结合载体上的上下游片段，扩增出目的基因，鉴定基因的大小，结果见图1，所有单克隆都有正常大小的基因，可以进一步进行下游的蛋白表达。
33.将转化平板上的单克隆转入有kan
+
抗性的lb试管中，37℃下培养过夜。将种子液按照1.5％的接种量转接到含有kan
+
抗性的2yt培养基中，在37℃下培养细菌，待生物量od
600
值达到0.6左右，进行iptg诱导，温度降低到25℃，表达16h后收集菌体，并破碎细胞进行电泳分析，结果见图2，蛋白的大小和预期的一致，且有很好的可溶性表达。
34.实施例2 nad激酶突变体的构建
35.借助生物信息学和结构生物学的知识，分析出nad激酶中能够提升催化活性的热点氨基酸y94、s113、m143、a198和v283，通过模拟对接设计出一系列突变体：y94r/s113r/m143i/a198s，y94r/s113t/m143i/a198s，y94r/s113r/m143i/a198s/v283a，y94r/s113t/m143i/a198s/v283a，y94r/s113r/m143i/a198s/v283g和y94r/s113t/m143i/a198s/v283g。根据理性设计的突变体，利用软件构建出突变的引物，具体信息见表1，表中下划线部分为突变后的氨基酸。
36.表1定点突变引物的核酸序列
[0037][0038]
利用pcr的常规技术，在高保真聚合酶primer star max dna的作用下，利用不同温度退化并延伸，实现全长质粒的扩增。对扩增的结果进行电泳检测(见图3)，每对引物都能完好的扩增出全质粒片段。
[0039]
将pcr扩增产物在fd dpni限制性内切酶的消化下，除去野生型的模板dna序列，转
入到bl21(de3)感受态细胞中，涂布于含有100ug/ml的kan
+
抗性lb平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆进行测序鉴定位点是否突变。后期依次叠加突变获得最初设计的突变体。
[0040]
实施例3 nad激酶突变体的催化活性测试
[0041]
将测序正确的突变体进行诱导表达，分别获得各自的重组细胞。在-40℃的低温冰箱中进行冷冻破碎。在1ml的反应体系中，分别称量各突变体细胞30mg，利用100mm的磷酸缓冲液ph 7.0溶解底物，浓度从10g/l提升到42g/l，mgcl2控制在0.1mm，atp加入8mg。在40℃的震荡器中反应，在反应7h和24h时间段分别取样分析转化效果。数据见表2，突变体的催化效率逐渐提升，最终获得y94r/s113t/m143i/a198s/v283g突变体可以在7h催化42g/l的底物，催化活性发生显著提高。
[0042]
表2不同突变体的催化活性
[0043][0044]
实施例4野生型nad激酶的转化
[0045]
在100ml的反应体系中，称取底物nad 1g，野生型nad激酶细胞3g，无水mgcl
2 9.5g，聚磷酸钠2g，用100mm的磷酸盐缓冲液溶解上述原料，在40℃的水浴下控制反应温度，利用0.1m的naoh控制反应过程中的ph稳定在7.0。反应7h后转化率为60％，进过低温旋蒸后，获得白色粉末固体产物0.64g，收率达到95.5％。
[0046]
实施例5 nad激酶突变体的转化
[0047]
在100ml的反应体系中，称取底物nad 2g，突变体(seq id no.3)细胞3g，无水mgcl
2 9.5g，聚磷酸钠2g，用100mm的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液溶解上述原料，在40℃的水浴下控制反应温度，利用0.1m的naoh控制反应过程中的ph稳定在7.0。反应7h后主要为产物nadp，经过低温旋蒸后，获得白色粉末固体产物1.56g，收率达到95.3％。
[0048]
实施例6 nad激酶突变体的转化
[0049]
在100ml的反应体系中，称取底物nad 2g，突变体(seq id no.5)细胞3g，无水mgcl
2 9.5g，聚磷酸钠2g，用100mm的磷酸盐缓冲液溶解上述原料，在40℃的水浴下控制反应温度，利用0.1m的naoh控制反应过程中的ph稳定在7.0。反应7h后主要为产物nadp，经过低温旋蒸后，获得白色粉末固体产物1.84g，收率达到95.6％。
[0050]
实施例7 nad激酶突变体的转化
[0051]
在100ml的反应体系中，称取底物nad 3g，突变体(seq id no.7)细胞3g，无水mgcl
2 9.5g，聚磷酸钠2g，用100mm的磷酸盐缓冲液溶解上述原料，在40℃的水浴下控制反
应温度，利用0.1m的naoh控制反应过程中的ph稳定在7.0。反应7h后主要为产物nadp，经过低温旋蒸后，获得白色粉末固体产物2.53g，收率达到95.4％。
[0052]
实施例8 nad激酶突变体的转化
[0053]
在100ml的反应体系中，称取底物nad 3g，突变体(seq id no.9)细胞3g，无水mgcl
2 9.5g，聚磷酸钠2g，用100mm的磷酸盐缓冲液溶解上述原料，在40℃的水浴下控制反应温度，利用0.1m的naoh控制反应过程中的ph稳定在7.0。反应7h后主要为产物nadp，经过低温旋蒸后，获得白色粉末固体产物2.6g，收率达到95％。
[0054]
实施例9 nad激酶突变体的转化
[0055]
在100ml的反应体系中，称取底物nad 4.2g，突变体(seq id no.11)细胞3g，无水mgcl
2 9.5g，聚磷酸钠2g，用100mm的磷酸盐缓冲液溶解上述原料，在40℃的水浴下控制反应温度，利用0.1m的naoh控制反应过程中的ph稳定在7.0。反应7h后主要为产物nadp，经过低温旋蒸后，获得白色粉末固体产物3.7g，收率达到95.3％。
[0056]
实施例10 nad激酶突变体的转化
[0057]
在100ml的反应体系中，称取底物nad 4.2g，突变体(seq id no.13)细胞3g，无水mgcl
2 9.5g，聚磷酸钠2g，用100mm的磷酸盐缓冲液溶解上述原料，在40℃的水浴下控制反应温度，利用0.1m的naoh控制反应过程中的ph稳定在7.0。反应7h后主要为产物nadp，转化率100％，经过低温旋蒸后，获得白色粉末固体产物4.5g，收率达到95.7％。