制备弹性蛋白肽的方法、由其制备的弹性蛋白肽及其用途与流程

1.本发明涉及一种制备能够改善血管壁弹性的弹性蛋白肽的方法、由其制备的弹性蛋白肽及其用途。


背景技术：

2.心脑血管疾病以其高发病率、高致残率、高死亡率和高复发率，极大地危害着人类的健康。随着世界人口的老龄化，每年因心脑血管病死亡的人数占居首位。因此，对脑血管疾病的研究越来越受重视，而其中的主要环节之一就是研究心脑血管在生理或/和病理条件下的结构、功能特征及其增龄变化。研究发现，在心脑动脉瘤、心脑动脉粥样硬化等多种心脑血管疾病中都伴有弹性蛋白的变化，提示弹性蛋白在心脑血管疾病过程中可能具有重要作用。
3.弹性蛋白(elastin)是人体组织器官(如动脉、皮肤等)中重要的结构蛋白，是构成动脉壁的主要成分之一，以它为主(占90％)构成的弹性膜或弹性纤维，使动脉具有伸缩性，在正常压力下支撑血管壁拮抗管壁塌陷，抵制因平滑肌收缩所致的血管闭合倾向。弹性蛋白还可以缓冲血流对管壁的冲击力，在弹性动脉中将血流转化为常流；完整的内弹性膜是防止能导致动脉粥样硬化的大分子物质(如低密度脂蛋白)通过的屏障。此外弹性蛋白还具有调控平滑肌细胞增生和稳定动脉构筑的功能。随着年龄增长，人体中的弹性蛋白降解，造成血管壁弹性降低。另一方面，弹性蛋白是一种既耐酸又耐碱的细胞外高分子基质蛋白，富含甘氨酸(33％)和脯氨酸(1％～13％)，极难溶于水，不易为人体吸收利用。
4.文献“the role of elastin-derived peptides in human physiology and diseases,aur
é
lie le page等,matrix biology，2019年11月，第84卷，第81～96页”报道，由弹性蛋白降解制得的弹性蛋白肽能够引发与全长弹性蛋白大致相同的细胞应答；该制得的弹性蛋白肽在组成上并非完全相同，但是已确定大部分为x-gly-x-x-pro-gly生物活性序列。
5.相应地，为解决弹性蛋白难以吸收的问题，现有技术中已有制备成小分子弹性蛋白肽的教导。
6.例如，cn106381323a中公开了一种弹性蛋白肽及其制备方法、应用，所述方法以牛颈韧带预处理后，与水混合、调节ph值，然后与蛋白酶混合后酶解，灭酶、离心、过滤收集滤液；然后将收集的滤液浓缩、干燥而制得弹性蛋白肽。
7.cn109680031a公开了一种弹性蛋白肽的提取方法，所述方法以鱼软骨为原料，经95％乙醇溶液和蒸馏水预处理后在缓冲液中进行超声波处理，然后加入弹性蛋白酶进行酶解，灭酶后将酶解液抽滤，收集滤液进行几次超滤，将所得超滤液进行透析除盐、旋转蒸发和冷冻干燥而得弹性蛋白肽。
8.cn108586603a公开了一种制备含多种特有氨基酸的弹性蛋白肽的方法，所述方法以牛筋为原料利用碱性蛋白酶进行水解，然后通过高温灭酶、超滤浓缩、离子交换树脂吸附、超声波辅助亲和反胶束提纯，得到含多种特有氨基酸的弹性蛋白肽。
9.但是，现有技术中所制得的弹性蛋白肽均为用于改善皮肤弹性的目的，并不能起到改善血管壁弹性的作用。截至目前为止，尚未见改善血管壁弹性的弹性蛋白肽及其制备方法的相关报告。


技术实现要素：

10.本发明是为解决上述现有技术的问题而作出的。本发明的一个目的是提供一种制备能够改善血管壁弹性的弹性蛋白肽的方法、以及由其制备的弹性蛋白肽及其用途。根据本发明的方法制备的弹性蛋白肽能够有效改善血管壁弹性、且还能有效降低血脂水平。
11.本发明的一个实施方式提供一种制备所述能够改善血管壁弹性的弹性蛋白肽的方法。所述方法包括如下步骤：
12.1)取动物的韧带或动脉管为原料，在预处理后进行匀浆化得到总蛋白粗提物；
13.2)将步骤1)得到的总蛋白粗提物先后以木瓜蛋白酶和胶原酶进行酶解，经离心后取沉淀，得到弹性蛋白粗提物；
14.3)将步骤2)得到的弹性蛋白粗提物以弹性蛋白酶进行酶解，灭酶后进行离心并取上清液，得到弹性蛋白肽粗酶解物；
15.4)将步骤3)得到的弹性蛋白肽粗酶解物进行过滤得到弹性蛋白肽，然后将该得到的弹性蛋白肽依次经离子交换树脂层析和凝胶柱层析进行纯化，得到能够改善血管壁弹性的弹性蛋白肽。
16.在一个优选实施方式中，在所述步骤1)中，所述动物的韧带或动脉管来自于牛肩韧带或牛主动脉管。
17.在一个优选实施方式中，在所述步骤1)中，所述预处理包括以0.1～1.0质量％、优选0.5质量％的氢氧化钠水溶液将所述动物的韧带或动脉管浸泡2～4小时。
18.在一个优选实施方式中，在所述步骤1)中，在以所述氢氧化钠水溶液进行浸泡结束之后，以去离子水进行清洗，然后加入适量软化水，并在研磨机中匀浆化至糊状。
19.在一个优选实施方式中，在所述步骤2)中，所述木瓜蛋白酶的加入量为所述总蛋白粗提物的2～3重量％，所用木瓜蛋白酶的酶活力为2
×
105～6
×
105u/g、优选为4
×
105u/g。
20.在一个优选实施方式中，在所述步骤2)中，所述木瓜蛋白酶的酶解在50℃和ph 6～8的条件下进行3～5小时。
21.在一个优选实施方式中，在所述步骤2)中，所述胶原酶的加入量为所述总蛋白粗提物的0.1～0.3重量％，所用胶原酶的酶活力为100～300cdu/mg、优选为150cdu/mg。
22.在一个优选实施方式中，在所述步骤2)中，所述胶原酶的酶解在35℃、ph 7～7.8的条件下进行2～4小时。
23.在一个优选实施方式中，在所述步骤3)中，所述弹性蛋白酶的加入量为所述弹性蛋白粗提物的0.1～0.3重量
‰
，所用弹性蛋白酶的酶活力为10～50u/mg、优选为30u/mg。
24.在一个优选实施方式中，在所述步骤3)中，所述弹性蛋白酶的酶解在35℃和ph 7～7.8的条件下进行5～8小时。
25.在一个优选实施方式中，在所述步骤3)中，所述灭酶是在90℃进行10分钟加热而进行的。
26.在一个优选实施方式中，在所述步骤4)中，所述过滤是如下进行的：先采用2kd超滤膜进行过滤，再通过纳滤去除无机盐和水溶性游离氨基酸，且在该过滤之后进行喷物干燥而得到弹性蛋白肽。
27.在一个优选实施方式中，在所述步骤4)中，所述离子交换树脂层析是如下进行的：将所述弹性蛋白肽溶于双蒸水中配成浓度为20～40mg/ml的溶液，以20～30m/小时的流速通过弱酸性阳离子交换树脂从而去除带负电荷的肽和离子，再以15-20m/小时的流速通过弱碱性阴离子交换树脂从而去除带正电荷的肽和离子。
28.在一个优选实施方式中，在所述步骤4)中，所述凝胶柱层析是如下进行的：将经过离子交换树脂层析后所得的溶液以0.4-1.0ml/分钟的流速通过凝胶柱层析进行分离，将洗出的溶液进行收集并于280nm检测，按峰合并试管内溶液，采用高效液相色谱-质谱(hplc-ms)检测所述(a)与(b)中至少一者的肽的含量，选择含量最高的溶液冻干或喷雾干燥，得到能够改善血管壁弹性的弹性蛋白肽。
29.本发明的另一个实施方式提供由上述方法制备的能够改善血管壁弹性的弹性蛋白肽。
30.本发明的另一个实施方式提供所述弹性蛋白肽在制备用于改善血管壁弹性的制剂中的用途。
31.在一个优选实施方式中，所述弹性蛋白肽通过降低血脂水平来改善血管壁弹性。
32.本发明的另一个实施方式提供所述弹性蛋白肽在制备用于降低血脂水平的制剂中的用途。
33.有益效果：本发明可以提供一种能够改善血管壁弹性的弹性蛋白肽的方法、由其制备的弹性蛋白肽及其用途。根据本发明的方法制备的弹性蛋白肽能够有效地改善血管壁弹性、有效降低血脂水平，并且安全无毒副作用、易于消化，因此可以作为药品、保健食品和食品的原料。
具体实施方式
34.以下通过具体实施方式对本发明进行更详细的描述，但这些具体实施方式仅为例示目的，不应解释为是对本发明范围的限制。
35.在本技术说明书中，术语“约”在限定数值时，表示所规定数值的
±
5％。
36.在本技术说明书中，用于超滤膜的术语“kd”表示千道尔顿。
37.在本技术说明书中，如无特别说明，则标号“％”表示质量％。
38.在本技术说明书中，如无特别说明，则在任何一个由两个以上氨基酸组成的序列中，序列的左端为n端，序列的右端为c端。
39.本发明的第一实施方式提供一种制备所述能够改善血管壁弹性的弹性蛋白肽的方法。所述方法包括如下步骤：
40.1)取动物的韧带或动脉管为原料，在预处理后进行匀浆化得到总蛋白粗提物，
41.2)将步骤1)得到的总蛋白粗提物先后以木瓜蛋白酶和胶原酶进行酶解，经离心后取沉淀，得到弹性蛋白粗提物；
42.3)将步骤2)得到的弹性蛋白粗提物以弹性蛋白酶进行酶解，灭酶后进行离心并取上清液，得到弹性蛋白肽粗酶解物；
43.4)将步骤3)得到的弹性蛋白肽粗酶解物进行过滤得到弹性蛋白肽，然后将该得到的弹性蛋白肽依次经离子交换树脂层析和凝胶柱层析进行纯化，得到能够改善血管壁弹性的弹性蛋白肽。
44.在上述第一实施方式中，对获取原料的动物没有特别限定，例如可以为牛、猪、狗、羊、鸡、鸭、鹅、兔等普通家畜或家禽，只要能获取所述动物的韧带或动脉管即可。作为优选，所述动物可以为牛。更优选地，所述动物的韧带可以为牛的肩韧带。更优选地，所述动物的动脉管可以为牛的主动脉管。
45.在上述第一实施方式中，在所述步骤1)中，所述预处理包括以0.1～1.0质量％、更优选0.5质量％的氢氧化钠水溶液将作为原料的动物的韧带或动脉管浸泡2～4小时。在所述浸泡之后，可以以去离子水进行例如2～3次的清洗。清洗之后，可加入适量软化水，并在研磨机中匀浆化至糊状。
46.在上述第一实施方式中，在所述步骤2)中，所述木瓜蛋白酶的加入量和酶活力可以根据实际酶解的需要合理地确定。作为优选，所述木瓜蛋白酶的加入量可以为所述总蛋白粗提物的2～3重量％，所用木瓜蛋白酶的酶活力可以为2
×
105～6
×
105u/g，进一步优选为约4
×
105u/g。另外，所述木瓜蛋白酶的酶解可以在40℃～60℃、更优选为在约50℃进行酶解，因为此时酶解反应进行最顺利。所述木瓜蛋白酶的酶解时间可以为3～5小时。另外，木瓜蛋白酶在酸性、碱性、中性条件下均具有酶活力，因此对酶解时的ph条件可根据实际需要合理地确定，但优选在ph 6～8下进行木瓜蛋白酶的酶解，因为此时酶解反应进行最顺利。
47.在上述第一实施方式中，在所述步骤2)中，所述胶原酶的加入量和酶活力可以根据实际酶解的需要合理地确定。作为优选，所述胶原酶的加入量可以为所述总蛋白粗提物的0.1～0.3重量％，所用胶原酶的酶活力可以为100～300cdu/mg，进一步优选为约150cdu/mg。另外，所述胶原酶的酶解可以在30～40℃进行，更优选为34～36℃，最优选的酶解温度为约35℃，因为此时酶解反应进行最顺利。所述胶原酶的酶解时间没有特别限制，例如可以为2～4小时。关于利用胶原酶进行酶解时的ph条件，可根据实际需要合理地确定，但一般而言该胶原酶的酶解优选在ph 7～7.8之间进行，因为此时酶解反应进行最顺利。
48.通过上述步骤2)中木瓜蛋白酶和胶原酶的酶解处理，可以有效去除总蛋白粗提物中的胶原蛋白和其它一些杂蛋白。
49.在上述第一实施方式中，在所述步骤2)中，在胶原酶的酶解之后进行离心处理而得到沉淀，并可以将所述沉淀以去离子水清洗2～3次而得到所述弹性蛋白粗提物。所述离心处理可以利用普通的离心机来进行，离心速度可以根据实际需要合适地确定，优选为4000～8000r/分钟，更优选为约6000r/分钟。所述离心处理时的温度可以设置在0～10℃，优选为3～5℃。
50.在上述第一实施方式中，在所述步骤3)中，所述弹性蛋白酶的加入量和酶活力可以根据实际酶解的需要合理地确定。作为优选，所述弹性蛋白酶的加入量可以为所述弹性蛋白粗提物的0.1～0.3重量
‰
，所用弹性蛋白酶的酶活力可以为10～50u/mg，进一步优选为约30u/mg。另外，所述弹性蛋白酶在酶解时的温度没有特别限制，例如可以为30～40℃，更优选为34～36℃，最优选的温度为约35℃。所述弹性蛋白酶的酶解时的ph可以根据实际需要而合理地调整确定，例如优选在ph 7～7.8之间进行。另外，所述弹性蛋白酶的酶解时
间可以根据实际需要而合适地确定，例如可以进行5～8小时。
51.在上述第一实施方式中，在所述步骤3)中，所述灭酶可以通过在90℃进行10分钟加热来进行。在该灭酶之后，通过进行离心得到上清液作为所述粗弹性蛋白肽。此处，所述离心处理可以利用普通的离心机来进行，离心速度可以根据实际需要合适地确定，优选为7000～13000r/分钟，更优选为约10000r/分钟。所述离心处理时的温度可以设置在0～10℃，优选为3～5℃。
52.在上述第一实施方式中，在所述步骤4)中，所述过滤可以通过如下进行：先采用2kd超滤膜进行过滤，再通过纳滤去除无机盐和水溶性游离氨基酸。关于所述过滤中所使用的超滤膜和纳滤膜，没有特别限制，可以采用普通市售产品。进一步优选地，在所述步骤4)中，在该过滤之后可进行喷物干燥处理来得到弹性蛋白肽。
53.在上述第一实施方式中，在所述步骤4)中，所述离子交换树脂层析可按如下方式进行：
54.将所得弹性蛋白肽溶于双蒸水中配成浓度为20～40mg/ml的溶液，以20～30m/小时的流速通过弱酸性阳离子交换树脂从而去除带负电荷的肽和离子，再以15～20m/小时的流速通过弱碱性阴离子交换树脂从而去除带正电荷的肽和离子。关于所述弱酸性阳离子交换树脂，没有特别限制，例如可以采用普通市售的d113弱酸性阳离子交换树脂。关于所述弱碱性阴离子交换树脂，没有特别限制，例如可以采用普通市售的d301弱碱性阴离子交换树脂。所述离子交换树脂层析的温度没有限制，可在室温下进行。
55.在上述第一实施方式中，在所述步骤4)中，所述凝胶柱层析可以按如下方式进行：将经过离子交换树脂层析后所得的溶液以0.4～1.0ml/分钟的流速通过凝胶柱层析进行分离，将洗出的溶液进行收集并于280nm检测，按峰合并试管内溶液，采用高效液相色谱-质谱(hplc-ms)检测所述(a)与(b)中至少一者的肽的含量，选择含量最高的溶液冻干或喷雾干燥，得到能够改善血管壁弹性的弹性蛋白肽。此时，关于所述凝胶柱没有特别限制，例如可以为由ge lifescience市售的sephadex g-15凝胶柱。此时，对所述洗出的溶液的收集频率没有特别限制，例如可以每3分钟收集一管。所述凝胶柱层析的温度没有限制，可在室温下进行。
56.关于所述步骤4)中的hplc-ms检测，没有特别限制。例如，所述hplc-ms检测可以按如下条件进行(检测中所用的hplc-ms设备采用普通市售设备即可，分析中所使用的试剂采用分析纯以上的纯度级别即可)：
57.zorbax sb-c
18
色谱柱(2.1mm
×
150mm，5μm)；
58.流动相a-水(0.1％tfa)，b-乙腈(0.1％tfa)；
59.梯度洗脱，0～7分钟，5％～20％b；7～50分钟，20％～32％b；50～90分钟，32％～72％b；
60.进样量50μl；
61.流速0.2ml
·
分钟-1
；
62.喷雾电压4.5k v；
63.毛细管温度300℃；
64.鞘气(n2)253kpa；
65.正离子模式，一级质谱扫描范围m/z 300～1500，精确质量数扫描(zoomscan)和二
级质谱(ms/ms)扫描均为数据依赖型扫描(data dependent scan)；
66.动态排除次数1；
67.动态排除时间0.5分钟；
68.二级质谱碰撞能量35％。
69.本发明的第二实施方式提供由根据上述第一实施方式的方法制备的能够改善血管壁弹性的弹性蛋白肽。
70.本发明人在将上述制备的能够改善血管壁弹性的弹性蛋白肽进行深入检测分析之后确定，根据本发明的方法制备的弹性蛋白肽富含由特定序列组成的肽、并且还具有特定范围的道尔顿分子量。并且通过进一步试验验证了，该弹性蛋白肽能够有效地改善血管壁弹性。
71.具体地，在上述第二实施方式中，所述弹性蛋白肽包含根据如下(a)与(b)中至少一者的肽：
72.(a)由x
1-gly-x
2-x
3-pro-gly序列组成的肽；
73.(b)在(a)中的x
1-gly-x
2-x
3-pro-gly序列中经过添加一个或几个氨基酸且具有能够改善血管壁弹性的活性的由(a)衍生的肽；且
74.所述弹性蛋白肽的分子量范围在500～2000道尔顿之间，优选在600-1500道尔顿之间，更优选在600-1300道尔顿之间，更优选在600-1250道尔顿之间。其中x1、x2和x3各自为任何氨基酸，且x1、x2和x3之间可相同也可不同。
75.在上述第二实施方式中，对所述弹性蛋白肽中所述(a)与(b)中至少一者的肽的含量没有特别限定，只要所述含量能够有效起到改善血管壁弹性的作用即可。例如，所述弹性蛋白肽可以包含大于50质量％、优选包含60质量％以上、更优选包含65质量％以上、还更优选包含70质量％以上、还更优选包含75质量％以上、还更优选包含80质量％以上、还更优选包含85质量％以上、还更优选包含90质量％以上、还更优选包含95质量％以上、还更优选包含98质量％以上的根据如上(a)与(b)中至少一者的肽。最优选地，所述弹性蛋白肽包含100质量％的根据如上(a)与(b)中至少一者的肽。
76.在上述第二实施方式中，所述x1优选为ala、val、asp、ile、tyr、ser、thr、arg、glu、lys、cys、leu中的任一者。
77.在上述第二实施方式中，所述x2优选为cys、ser、ala、asp、glu、val、asn、met、tyr、leu中的任一者。
78.在上述第二实施方式中，所述x3优选为ile、thr、glu、ala、leu、asn、cys、ser、val、phe、asp中的任一者。
79.在上述第二实施方式中，所述添加一个或几个氨基酸可以是添加1～5个、优选为添加1～4个氨基酸。例如，所述添加一个或几个氨基酸可以是添加5个、4个、3个、2个或1个氨基酸。例如，所述添加一个或几个氨基酸可以是在n端添加1个、2个或3个氨基酸，和/或在c端添加1个或2个氨基酸。如下文实施例中所证实，在本发明的由x
1-gly-x
2-x
3-pro-gly序列组成的肽中通过添加一个或几个氨基酸，所得的衍生肽同样能够改善血管壁弹性。
80.在上述第二实施方式中，所述添加的一个或几个氨基酸例如可以位于所述序列的n端，且为选自cys、tyr、phe、leu-val-ala、val-ile、met-lys中的任一者。
81.在上述第二实施方式中，所述添加的一个或几个氨基酸例如可以位于所述序列的
c端，且为选自cys、glu-met、leu、asn-glu、asp、ile、asn-his中的任一者。
82.在上述第二实施方式中，所述序列的n端和c端均有添加的氨基酸，其中在所述序列的n端添加的氨基酸可以为选自phe、tyr、val-ile、met-lys中的任一者，在所述序列的c端添加的氨基酸可以为选自leu、asp、ile、asn-his中的任一者。
83.在上述第二实施方式中，所述(a)由x
1-gly-x
2-x
3-pro-gly序列组成的肽例如可以为如下中的至少一者：
84.ala-gly-cys-ile-pro-gly，
85.val-gly-ser-thr-pro-gly，
86.asp-gly-ala-glu-pro-gly，
87.ile-gly-asp-ala-pro-gly，
88.tyr-gly-cys-leu-pro-gly，
89.ser-gly-glu-asn-pro-gly，
90.thr-gly-val-ala-pro-gly，
91.arg-gly-asn-cys-pro-gly，
92.tyr-gly-ala-ser-pro-gly，和
93.glu-gly-ala-val-pro-gly。
94.在上述第二实施方式中，所述在(a)中的x
1-gly-x
2-x
3-pro-gly序列中经过添加一个或几个氨基酸且具有能够改善血管壁弹性的活性的由(a)衍生的肽例如可以为如下中的至少一者：
95.lys-gly-ser-glu-pro-gly-cys，
96.cys-ala-gly-ser-thr-pro-gly，
97.tyr-cys-gly-met-ile-pro-gly，
98.leu-gly-ala-cys-pro-gly-glu-met，
99.phe-leu-gly-asp-asn-pro-gly-leu，
100.arg-gly-cys-phe-pro-gly-asn-glu，
101.tyr-ala-gly-tyr-cys-pro-gly-asp，
102.leu-val-ala-lys-gly-leu-ser-pro-gly，
103.val-ile-ser-gly-ala-asp-pro-gly-ile，和
104.met-lys-glu-gly-val-asp-pro-gly-asn-his。
105.本发明的第三实施方式提供所述弹性蛋白肽在制备用于改善血管壁弹性的制剂中的用途。
106.在上述第三实施方式中，所述弹性蛋白肽可优选地通过降低血脂水平来改善血管壁弹性。
107.本发明的第四实施方式提供所述弹性蛋白肽在制备用于降低血脂水平的制剂中的用途。
108.此处，对所述第三、第四实施方式中的制剂的形式没有特别限制，例如所述制剂可以是经胃肠道给药的剂型如常用的散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、乳剂、混悬剂等，或者所述制剂可以是非经胃肠道给药的剂型如注射剂、贴剂等。
109.另外，所述第三、第四实施方式中的制剂优选以中至高剂量施用，例如以15～
120mg/kg体重/天、更优选以20～100mg/kg体重/天、进一步优选以30～80mg/kg体重/天的剂量施用。
110.根据本发明制备的弹性蛋白肽能够有效改善血管壁弹性、有效降低血脂水平，并且安全无毒副作用，易于消化，因而可以进一步用于制备药品、保健食品和食品。
111.实施例
112.以下通过实施例来进一步详细说明本发明。但以下实施例仅为例示的目的，不应解释为是对本发明范围的限制。如无特别说明，则以下实施例中所用的试剂为分析纯的级别。
113.实施例1：能够改善血管壁弹性的弹性蛋白肽的制备
114.称取牛心动脉管100g切成小块，加入2000mll 0.5质量％的氢氧化钠溶液浸泡4小时，以去离子水清洗3次。然后加入适量软化水，在研磨机中匀浆化至糊状。向该糊中加入酶活力为4
×
105u/g的2g木瓜蛋白酶，于50℃、ph 6.5的条件下酶解4小时，再加入酶活力为150cdu/mg的0.2g胶原蛋白酶，于35℃ph 7.2的条件下酶解4小时，由此去除胶原蛋白和其他杂蛋白，然后在4℃于6000r/分钟离心10分钟，并将得到的沉淀清洗2次。向清洗后的沉淀中加入1000ml蒸馏水，再加入酶活力为30u/mg的30mg弹性蛋白肽，于35℃、ph 7.5的条件下酶解8小时。通过在90℃加热10分钟来进行灭酶，然后在4℃、10000r/分钟的条件下离心15分钟，得到上清液为粗弹性蛋白肽。将上述酶解液(即作为上清液的粗弹性蛋白肽)采用2kd超滤膜进行超滤，然后进行纳滤去除无机盐和水溶性游离氨基酸。然后进行喷雾干燥，得到弹性蛋白肽2.6g。将该所得的弹性蛋白肽溶于双蒸水中，配成浓度为25mg/ml的溶液，以25m/小时的流速通过d113弱酸性阳离子交换树脂从而去除带负电荷的肽和离子，再以15m/小时的流速通过d301弱碱性阴离子交换树脂从而去除带正电荷的肽和离子。然后，将所得的溶液以0.6ml/分钟的流速通过sephadex g-15柱进行层析分离，洗出溶液每3分钟收集一管，并于280nm检测，按峰合并试管内溶液，采用hplc-ms检测其中x-gly-x-x-pro-gly含量，hplc-ms检测的条件为：
115.zorbax sb-c
18
色谱柱(2.1mm
×
150mm，5μm)；流动相a-水(0.1％tfa)，b-乙腈(0.1％tfa)；梯度洗脱，0～7min，5％～20％b；7～50min，20％～32％b；50～90min，32％～72％b；进样量50μl；流速0.2ml
·
min-1
。喷雾电压4.5k v；毛细管温度300℃；鞘气(n2)253kpa；正离子模式，一级质谱扫描范围m/z 300～1500，精确质量数扫描(zoomscan)和二级质谱(ms/ms)扫描均为数据依赖型扫描(data dependent scan)；动态排除次数1；动态排除时间0.5min；二级质谱碰撞能量35％。
116.选择含量最高的溶液冻干或喷雾干燥，得到能够改善血管壁弹性的弹性蛋白肽。经hplc-ms检测，该产品平均分子量为766.21，其中肽序列和分子量分布如下表1、2所示。
117.表1 hplc-ms检测的产品中的肽序列
[0118][0119]
表2 hplc-ms检测的产品中的分子量分布
[0120][0121]
实验例1：弹性蛋白肽改善血管壁弹性的实验
[0122]
健康spf(specific pathogen free，即“无特定病源体”)级成年雄性sd(sprague-dawley)大鼠84只，适应期结束时，体重(200
±
20)g，由北京大学医学部实验动物中心提供。分笼饲养，每笼3只，自由饮食、饮水。动物饲养实验室符合国标清洁级，温度范围为(25
±
1)℃，相对湿度为50％～60％，昼夜明暗交替时间为12小时。
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对照组饲料：维持饲料，购自北京科澳协力饲料有限公司。
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模型组饲料：在维持饲料中添加20.0％蔗糖、15.0％猪油、1.2％胆固醇、0.2％胆酸钠，适量的酪蛋白、磷酸氢钙、石粉等。
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雄性sd大鼠84只，共分为7个实验组，每组12只。实验设立3个剂量组(高剂量组80mg/kg、中剂量组30mg/kg、低剂量组7.5mg/kg))、1个空白对照组、1个乳清蛋白组(0.2500g/kg)、1个市购弹性蛋白肽组(30mg/kg，由安徽盛美诺生物技术有限公司提供，其制备方法为以牛颈韧带粉碎后，加入6倍水、调节ph值8，加入南宁庞博生物工程有限公司提供的碱性蛋白酶酶解，灭酶、离心、过滤收集滤液；然后将收集的滤液浓缩、干燥而制得弹性蛋白肽，其制备方法中没有使用胶原蛋白酶、弹性蛋白酶和离子层析等工艺和1个模型对照组。受试样品给予时间为30天。
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建模成功并分组后，3个剂量组每天灌胃给予实施例1制备的弹性蛋白肽溶液，空白对照组和模型对照组每日灌胃给予同体积的蒸馏水，乳清蛋白组给予同体积乳清蛋白溶液，市购弹性蛋白肽组给与同体积市购弹性蛋白肽溶液。实验结束时，采用aloka prosoundα-10彩色多普勒超声诊断仪(产自日本日立阿洛卡公司)，配置血管回声跟踪技术(et)软件，进行二维超声及et检查。然后，将大鼠处死、股动脉采血，以3 000r/分钟离心10分钟，检测tc、tg、hdl-c、ldl-c，(检测试剂盒购自英科新创(厦门)科技有限公司)。
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表3实验组与对照组et检测指标对比
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注：ep:血管的压力-应变弹性系数；β：硬化系数；ac：血管顺应性；ai：增大指数；
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pwvβ：单点脉搏传导速度；et：血管回声跟踪技术
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空白组对照差异显著，
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与模型组对照差异显著。
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从实验结果可以看出，模型组中的ep、β、ai和pwvβ值明显高于空白组，ac值明显低于空白组，这些结果表明造模成功。
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另一方面，与模型组相比，实施例1弹性蛋白肽中、高剂量组能明显降低ep、β、ai和pwvβ值，并且提高ac值；而乳清蛋白组无此效果，市购弹性蛋白肽组能降低ep值，有改善β、ai、pwvβ、ac值的趋势，但统计学上没有显著差异。这些事实清楚说明，服用实施例1制备的弹性蛋白肽可以明显改善高脂大鼠血管壁弹性情况。
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表4大鼠血脂指标含量
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注：tc：总胆固醇；tg：甘油三酯；hdl-c：高密度脂蛋白；ldl-c：低密度脂蛋白。
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空白组对照差异显著，
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与模型组对照差异显著。
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从实验结果可以看出，模型组中的tg、tc和ldl-c含量明显高于空白组，该结果说明造模成功。
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另一方面，与模型组相比，实施例1弹性蛋白肽中、高剂量组能明显降低tg和tc含量；而乳清蛋白组则无此效果，市购弹性蛋白肽组可以降低tg含量，并有改善tc含量的趋势，但无统计学差异。这些事实清楚地说明，服用实施例1制备的弹性蛋白肽能够明显降低高脂大鼠的血脂水平，从而能够改善高脂大鼠的血脂情况。