针对2019
‑
ncov的重组蛋白疫苗及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及流行病预防及疫苗生产领域,具体涉及一种针对 2019
‑
ncov的重组蛋白疫苗及其制备方法。
背景技术:2.新型冠状病毒2019
‑
ncov(who命名)是一种以前尚未在人类中 发现的新型冠状病毒。国际病毒分类委员会于2020年2月将新型冠状 病毒(2019
‑
ncov)的正式分类名确定为严重急性呼吸综合征冠状病 毒2,英文缩写sars
‑
cov
‑
2(severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)。who于2020年2月将由新型冠状病毒2019
‑
ncov引发 的疾病命名为2019冠状病毒病,英文缩写covid
‑
19(corona virusdisease 2019)。因为人群中缺少对新型冠状病毒2019
‑
ncov的免疫力, 并且经呼吸道飞沫传播,也可通过接触和粪
‑
口传播,所以人群普遍 易感,且目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。
3.冠状病毒属于套氏病毒目,冠状病毒科,冠状病毒属,是一类 具有囊膜、基因组为线性单股正链rna的病毒,是自然界中广泛存 在的一大类病毒,引起的疾病患者表现为从普通感冒到严重肺部感 染等不同的临床症状,例如中东呼吸综合征(mers)和严重急性呼 吸道综合症(sars)。2019
‑
ncov与sars
‑
cov同属于冠状病毒β 家族。现亟需开发能够有效预防引起新型冠状病毒2019
‑
ncov感染 的疫苗。
4.目前应用于人体的预防病毒感染的疫苗主要包括采用病毒经减 毒后制备的减毒活疫苗,如水痘减毒活疫苗、麻疹减毒活疫苗等;以 及灭活全病毒颗粒疫苗,如肠道病毒ev71型灭活疫苗、甲型肝炎疫 苗等。然而,减毒疫苗要费很长时间使病毒繁殖许多代,然后逐渐减 除病毒的大部分活性,难以满足急性传染病的预防需要。灭活疫苗则 在免疫病理方面存在许多难以解决的问题,例如有些灭活病毒进入人 体会在病毒入侵时加重病情。
5.重组蛋白疫苗是将病毒的目的抗原基因构建在表达载体上,再转 化到细菌、酵母、哺乳动物或昆虫细胞中,在一定的诱导条件下,表 达出大量的抗原蛋白,通过纯化后制备的疫苗。重组蛋白疫苗能够诱 导机体产生体液免疫和细胞免疫,并且可以快速制备,适用于新型冠 状病毒的预防。
技术实现要素:6.本发明的第一目的是提供一种融合蛋白,该融合蛋白包含(1) 2019
‑
ncov的s蛋白的受体结合结构域和(2)igg的fc片段。
7.2019
‑
ncov的蛋白包括rna聚合酶蛋白、纤突蛋白、包膜蛋白、 膜蛋白和核衣壳蛋白。其中,纤突蛋白(spike蛋白,本发明简称s蛋 白)为糖蛋白,是诱导保护性免疫应答的决定因素。本发明提供的融 合蛋白包含2019
‑
ncov的s蛋白的受体结合结构域(receptor bindingdomain,rbd)。该结构域与2003sars
‑
cov的ace2受体结合结构域 高度保守,是引起免疫反应的重要抗原决定簇,既可以预防2003 sars
‑
cov引起的疾病,也能够预防2019
‑
ncov引起的疾病,能够有效 诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,还能够与病毒竞争结合宿
主细胞 的受体(例如:血管紧张素转换酶2,ace2),从而起到疾病的治疗 作用。
8.本发明提供的融合蛋白还包含有免疫球蛋白g(本发明简称igg) 的fc片段,fc可以辅助诱导机体产生更加强烈的免疫反应,并且大大 提高了抗原在机体内的半衰期,减少了免疫程序;同时,fc使得疫苗 的纯化步骤大大缩小,增加了纯化效率。本发明所述ig的fc片段优选 为人源igg的fc片段。
9.作为本发明的一种优选方案,所述融合蛋白具有seq1所示的氨 基酸序列,或与其相似度为90%以上的氨基酸序列。
10.seq1所示的氨基酸序列参见本发明的序列表,具体如下所示:
[0011][0012]
本发明的第二目的是提供编码所述融合蛋白的基因序列。
[0013]
作为本发明的一种优选方案,所述基因序列是经过密码子优化 后的dna序列。
[0014]
本发明的第三目的是提供一种包含编码所述融合蛋白的基因序 列的真核细胞表达载体。其是将所述基因序列插入到真核细胞表达 载体中构建而成。
[0015]
本发明采用真核表达载体在哺乳动物细胞中进行表达。
[0016]
所述真核细胞表达载体优选为可以用于人的表达载体。
[0017]
作为本发明的一种优选方案,所述真核细胞表达载体为 pcho1.0载体。所述pcho1.0载体的示意图如图1所示。
[0018]
作为本发明的另一种优选方案,所属的真核细胞载体为 pcaggs载体。所述pcaggs载体的示意图如图2所示。
[0019]
本发明的第四目的是提供表达所述融合蛋白的细胞,所述细胞 中外源转入了包含所述基因序列的真核细胞表达载体。
[0020]
作为本发明的一种优选方案,所述细胞为cho细胞。cho细 胞(chinese hamster ovary cell)是1957年从中国地鼠卵巢细胞得到。 该细胞是上皮样细胞,通常贴壁生长,也可悬浮生长,被广泛地用 于表达重组蛋白。
[0021]
在选用cho细胞进行抗原表达的情况下,本发明优选将所述目 的基因序列经过cho细胞密码子优化后克隆到所述真核细胞表达 载体中,再转入cho细胞中。
[0022]
本发明的另一种优选方案,所述的细胞为293f细胞。293f细 胞是从hek293细胞中分离出的一种适应于悬浮生长的细胞,被广 泛地用于表达重组蛋白。
[0023]
在选用293f细胞进行抗原表达的情况下,本发明优选将所述目 的基因序列经过293f细胞密码子优化后克隆到所述真核细胞表达 载体中,再转入293f细胞中。
[0024]
本发明的第五目的是提供针对2019
‑
ncov的重组蛋白疫苗,其 包含所述融合蛋白。所述融合蛋白作为疫苗的抗原。
[0025]
作为本发明的一种优选方案,所述重组蛋白疫苗中抗原有效成 分的含量为10~100μg/剂。具体而言,所述重组蛋白疫苗中抗原有 效成分的含量可以为12.5μg/剂,25μg/
剂,50μg/剂或100μg/剂。在 本发明的一些具体实施方式中,所述抗原有效成分的含量是指疫苗 产品中疫苗原液的含量。
[0026]
本发明提供的疫苗中还可以含有免疫佐剂。所述免疫佐剂可以 选用无机佐剂,如氢氧化铝佐剂等。所述免疫佐剂还可以选用有机 佐剂,如脂多糖、细胞因子等。
[0027]
本发明提供的疫苗优选为液体疫苗,可以采用多种剂型形式。 具体而言,所述重组蛋白疫苗可以是肌肉内液体注射剂、静脉内液 体注射剂、鼻腔内液体注射剂、皮内液体注射剂或皮下液体注射剂。 在实际应用时,可以根据转染效率、局部免疫监视等临床需要进行 调整和选择,如选择单一的剂型进行注射免疫,或者选择多种混合 剂型进行注射免疫。
[0028]
本发明的第六目的是提供所述重组蛋白疫苗的制备方法,包括 如下步骤:将包含所述基因序列的真核细胞表达载体转入细胞中表 达,取上清液纯化,得疫苗原液。
[0029]
作为本发明的一种优选方案,所述细胞为cho细胞。在选用 cho细胞进行抗原表达的情况下,本发明优选将所述目的基因序列 经过cho细胞密码子优化后克隆到所述真核细胞表达载体中,再转 入cho细胞中。
[0030]
作为本发明的一种优选方案,所述细胞为293f细胞。在选用 293f细胞进行抗原表达的情况下,本发明优选将所述目的基因序列 经过293f细胞密码子优化后克隆到所述真核细胞表达载体中,再转 入293f细胞中。
[0031]
所述纯化可采用本领域常规的疫苗原液纯化方法。
[0032]
作为本发明的一种优选方案,所述纯化包括:将所述上清液进 行超滤浓缩后,进行分子筛和阴离子交换两步层析,所得层析液经 滤膜过滤之后,即为疫苗原液。所述滤膜优选为0.22μm滤膜。
[0033]
作为本发明的一种优选方案,所述方法还包括:将所述疫苗原 液配制成疫苗。所述疫苗原液的用量优选为10~100μg/剂。具体而 言,所述重组蛋白疫苗中疫苗原液的含量可以为12.5μg/剂,25μg/ 剂,50μg/剂或100μg/剂。
[0034]
本发明的第七目的是提供所述融合蛋白、所述基因序列、所述真 核细胞表达载体、所述细胞、所述重组蛋白疫苗或所述方法制备而成 的重组蛋白疫苗在制备用于预防新型冠状病毒2019
‑
ncov感染引起 的疾病的药物中的应用。所述疾病即为世界卫生组织命名的2019冠状 病毒病,英文缩写covid
‑
19。
[0035]
优选地,所述疾病为新型冠状病毒2019
‑
ncov感染引起的肺炎, 严重急性呼吸道感染,肠道疾病,心脏衰竭,肾衰竭或严重急性呼 吸道综合征。
[0036]
本发明提供的融合蛋白包含有2019
‑
ncov spike蛋白的受体结合 结构域,与2003sars
‑
cov高度保守,且能够与ace2结合,是引起免 疫反应的重要抗原决定簇。本发明提供的含有该融合蛋白的疫苗既可 以预防2003sars
‑
cov引起的疾病,也能够预防2019
‑
ncov引起的疾 病,能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,且可以快速制备, 适用于新型冠状病毒2019
‑
ncov的预防。本发明提供的融合蛋白还包 含有igg的fc片段,该片段可以辅助诱导机体产生更加强烈的免疫反 应,并且大大提高了抗原在机体内的半衰期,减少了免疫程序;同时, fc片段使得疫苗的纯化步骤大大缩小,增加了纯化效率。
附图说明
[0037]
图1为pcho1.0载体的示意图。
[0038]
图2为pcaggs载体的示意图。
具体实施方式
[0039]
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
[0040]
实施例1
[0041]
本实施例提供了2019
‑
ncov重组蛋白疫苗原液的制备方法,具体 为:
[0042]
(1)将编码seq1的基因序列进行cho细胞密码子优化后,插入 到pcho1.0载体上,同源重组到cho细胞,进行蛋白的重组表达。
[0043]
(2)取细胞培养的上清液,进行超滤浓缩后,进行分子筛和阴 离子交换两步层析,所得层析液经0.22μm滤膜过滤,得疫苗原液。
[0044]
实施例2
[0045]
(1)将编码seq1的基因序列进行293细胞密码子优化后,插入 到pcaggs载体上,同源重组到293f细胞,进行蛋白的重组表达。
[0046]
(2)取细胞培养的上清液,进行超滤浓缩后,进行分子筛和阴 离子交换两步层析,所得层析液经0.22μm滤膜过滤,得疫苗原液。
[0047]
实施例3
[0048]
本实施例提供了一种2019
‑
ncov重组蛋白疫苗,该疫苗为液体疫 苗,其中含有实施例1提供的疫苗原液12.5μg/剂以及氢氧化铝佐剂 50μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200201。
[0049]
实施例4
[0050]
本实施例提供了一种2019
‑
ncov重组蛋白疫苗,该疫苗为液体疫 苗,其中含有实施例1提供的疫苗原液25μg/剂以及氢氧化铝佐剂50μg/ 剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200202。
[0051]
实施例5
[0052]
本实施例提供了一种2019
‑
ncov重组蛋白疫苗,该疫苗为液体疫 苗,其中含有实施例1提供的疫苗原液50μg/剂以及氢氧化铝佐剂50μg/ 剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200203。
[0053]
实施例6
[0054]
本实施例提供了一种2019
‑
ncov重组蛋白疫苗,该疫苗为液体疫 苗,其中含有实施例1提供的疫苗原液100μg/剂以及氢氧化铝佐剂 50μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200204。
[0055]
实施例7
[0056]
本实施例提供了一种2019
‑
ncov重组蛋白疫苗,该疫苗为液体疫 苗,其中含有实施例1提供的疫苗原液12.5μg/剂以及氢氧化铝佐剂 200μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200205。
[0057]
实施例8
[0058]
本实施例提供了一种2019
‑
ncov重组蛋白疫苗,该疫苗为液体疫 苗,其中含有实
施例1提供的疫苗原液25μg/剂以及氢氧化铝佐剂 200μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200206。
[0059]
实施例9
[0060]
本实施例提供了一种2019
‑
ncov重组蛋白疫苗,该疫苗为液体疫 苗,其中含有实施例1提供的疫苗原液50μg/剂以及氢氧化铝佐剂 200μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200207。
[0061]
实施例10
[0062]
本实施例提供了一种2019
‑
ncov重组蛋白疫苗,该疫苗为液体疫 苗,其中含有实施例1提供的疫苗原液100μg/剂以及氢氧化铝佐剂 200μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200208。
[0063]
实施例11:疫苗免疫小鼠效果
[0064]
将实施例3~10提供的8组疫苗分别做1:4、1:16、1:64稀释, 接种balb/c小鼠,每组10只,按照0,7天免疫,每只腹腔注射 一个剂量,第1次免疫后4周采血,检测中和抗体。中和抗体效价 gmt大于8的视为阳性,视为有保护效果。结果如表1所示。
[0065]
表1:2019
‑
ncov疫苗免疫balb/c小鼠的中和效价
[0066][0067]
结果显示,上述不同有效成分和佐剂含量的2019
‑
ncov疫苗免 疫balb/c小鼠,均能产生足够高的中和抗体效价。佐剂含量高的 疫苗免疫原性相对高于含量低的同样有效成份的疫苗。本发明提供 疫苗均能诱导balb/c小鼠产生有保护能力的中和抗体。
[0068]
实施例12:疫苗免豚鼠效果
[0069]
将实施例2、5、6、9提供的4组疫苗分别接种豚鼠,每组4只, 每只肌肉注射1.0ml(2个剂量),按照0,7天免疫,28天采血的免 疫程序,检测血清中和抗体效价。结果如表2所示。
[0070]
表2:2019
‑
ncov疫苗免疫豚鼠的中和效价
[0071]
疫苗编号中和抗体效价(gmt)20200201256
2020020451220200205384202002081024
[0072]
结果显示,不同批次2019
‑
ncov疫苗免疫豚鼠,能够产生不同 水平的中和抗体效价。本发明提供的疫苗均能诱导豚鼠产生良好的 中和抗体。
[0073]
实施例13:细胞因子检测
[0074]
将编号为20200201、20200202、20200203和20200204的疫苗 按照0、7天免疫,28天采血的程序分别免疫balb/c小鼠,采集细 胞上清进行细胞免疫检测。采用细胞内细胞因子染色法和流式细胞 法检测血清中特异性表达s蛋白细胞因子的cd4+t细胞。
[0075]
结果显示,20200201、20200202、20200203和20200204均能诱 导机体产生细胞免疫。虽然有效成份含量高的疫苗能产生更高水平 的细胞免疫,但是在本发明提供的抗原含量范围内的疫苗均能引起 良好的细胞免疫。
[0076]
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发 明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进, 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。