一种吸附去除土壤中重金属元素的复合微生物菌剂及其制备方法与流程

1.本发明属于功能微生物技术领域，具体涉及一种吸附去除土壤中重金属元素的复合微生物菌剂及其制备方法。


背景技术：

2.土壤是生态系统的重要组成部分，其理化性状会影响植物的生长。生长在土壤重金属污染区域的植物会在繁殖代谢过程中积累重金属，并产生毒害效应，进而通过食物链循环危害动物、人类的生命健康。重金属污染源呈现多元化特征，如工业生产、污水浇灌、矿产开发、农药化肥的过量使用、大气沉降等。导致我国农田土壤重金属污染的种类主要有镉、铅、汞、铬、铜、锌及类金属砷等生物毒性显著的元素。针对重金属污染土壤的修复，主要包括物理修复，化学修复，生物修复，农艺调控等技术措施。生物修复因其安全、环保、低耗的优势，在实际重金属污染治理中，以生物修复技术为中心的多种联合修复将会是主要研究方向。因此，微生物菌剂资源的开发尤为重要。
3.中国专利cn 104525102a公开了一种伊利石吸附剂改性方法，通过将伊利石原矿粉与硫酸锌按比例混合，置于马弗炉内烘焙，研磨后用稀盐酸洗去硫酸根离子，得到制剂产品用于去除废水中重金属离子。但对于土壤中重金属元素的祛除效果，并没有有效的启示。中国专利cn 103894404a公开了一种丙烯酸改性壳聚糖修复剂，将重金属污染土置于修复剂水溶液中进行搅拌洗脱，或将修复剂水溶液中施于待耕水田，通过犁田耙田将重金属转移到洗脱液中，实现重金属(pb，cr，cu)污染土壤的修复。该专利应用于染污土壤的方法适用于小范围的土壤修复，对于大面积污染农田操作成本相对较高，且高分子有机化合物的应用，对于土壤环境也有一定程度的损害。
4.上述应用于土壤重金属污染的处理剂，其均存在功能单一，制备工艺复杂，成本高且去除不彻底的问题，导致市场化应用受到极大的限制。


技术实现要素：

5.本发明指在针对目前土壤重金属污染治理中出现的缺陷，提供一种既可以有效降低土壤中镉等重金属含量，同时可以优化土壤微环境提升土壤微生物水平的复合微生物菌剂。
6.为实现上述技术目的，本发明所采用的技术方案为：
7.一种吸附去除土壤中重金属元素的复合微生物菌剂，包括以下重量份的原料制备而成：生物吸附载体100-165份、枯草芽孢杆菌10-20份、巨大芽孢杆菌15-20份、绿色木霉菌5-10份、硝化细菌3-8份、圆褐固氮菌4-8份、贝莱斯芽孢杆菌1-5份、乙二胺四乙酸钠0.1-0.5份、壳聚糖0.1-0.5份。
8.所述生物吸附载体的制备方法为：
9.(1)将甘蔗秸秆用水冲洗干净，80℃烘干至恒重，采用粉碎机粉碎并过200目筛，得
甘蔗秸秆粉；将秸秆粉置于马弗炉中，通入氮气，于500℃下煅烧1h，后自然降温至室温，得秸秆生物质炭；
10.(2)取步骤(1)所得秸秆生物质炭和硅藻土按质量比1.5:1混合均匀，按照液固比3：1加入到质量浓度为65％的h2so4溶液中，浸泡12h；接着用蒸馏水进行反复洗涤并过滤；
11.(3)将步骤(2)所得粉体置于小球藻液中，于室温下混合浸泡24后过滤、干燥及冷却，最后研磨至180～220目，得到生物吸附载体。
12.步骤(1)中煅烧的升温速率不超过5℃/min。
13.步骤(3)所述小球藻液的制备方法为：小球藻干藻粉加水配制成细胞悬浮液，50℃保温30min，离心过滤得到清液和滤渣，滤液于4～10℃储存备用；滤渣加水混合均匀，加入纤维素酶和蛋白酶，50～60℃继续保温24h小时，离心得上清液；将滤液和上清液混合，经浓缩至体积恒定，得小球藻液。
14.一种吸附去除土壤中重金属元素的复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
15.(1)制备小球藻液；
16.(2)制备生物吸附载体；
17.(3)按重量份将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、绿色木霉菌、硝化细菌、圆褐固氮菌、贝莱斯芽孢杆菌、乙二胺四乙酸钠、壳聚糖与生物吸附载体混合均匀，加入到气流粉碎机中，细度控制300-400目，得复合微生物菌剂。
18.本发明枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、绿色木霉菌、硝化细菌、圆褐固氮菌均为市售，有效活菌数为10-100亿/克。本发明各原料均市售可得。
19.本发明贝莱斯芽孢杆菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为：cgmcc no.15324。
20.贝莱斯芽孢杆菌菌剂制备方法为：
21.将贝莱斯芽孢杆菌按照3％的接种量接种到液体培养基，在32℃条件下摇床转速160rpm培养25h，得贝莱斯芽孢杆菌发酵种子液；将贝莱斯芽孢杆菌发酵种子液以10％的接种量接入发酵培养基中，在32℃条件下摇床转速160rpm发酵培养55h，离心收集菌体；将菌体喷雾冷冻干燥，得贝莱斯芽孢杆菌剂。
22.液体培养基中胰蛋白胨含量为9～11g/l、酵母提取物含量为4～6g/l、氯化钠含量为9～11g/l，lb培养基的ph值为7.0～7.2；
23.发酵培养基组成如下：甘露醇11.2g，kh2po
4 0.3g，mgso4·
7h2o 0.2g，nacl 0.3g，caco35.0g，caso4·
2h2o 0.1g，调ph至7.0-7.2，加水1000ml混合均匀，120℃灭菌30min。
24.本发明微生物菌剂用量10-15kg/亩。
25.有益效果
26.本发明将生物碳和硅藻土复配改性，制备得到生物吸附载体，其可有效的吸附降解土壤中的镉等重金属元素。秸秆生物碳500℃条件下缺氧热裂解，所得生物炭可通过其多级孔的物理吸附及带电吸附降低土壤中镉离子的移动性。生物质炭和硅藻土按照1.5:1混合酸解后，其致密多孔的结构可以实现对重金属元素的充分吸附和固定，经过小球藻液浸泡的生物质吸附剂，小球藻酶解产生的大量阳离子基团的胞外聚合物多糖、糖蛋白等，并与重金属形成络合物，进一步实现重金属元素的固定和降解。乙二胺四乙酸钠、壳聚糖作为促进剂可以辅助吸附载体固定和络合重金属元素。同时配合枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、绿
色木霉菌、硝化细菌、圆褐固氮菌、贝莱斯芽孢杆菌，菌剂吸附于吸附剂的空隙中，一方面起到了保护微生物菌剂的作用，另一方面也使微生物菌剂在土壤中充分发挥功效，改善土壤微生态，调节土壤结构。本发明各原料缺一不可，原料的选择和用量是实现本发明技术效果关键，缺一则效弱。本发明的制造方法简单易行，运行成本低，具有广阔的市场应用前景。
具体实施方式
27.下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不限于此。
28.实施例1
29.一种吸附去除土壤中重金属元素的复合微生物菌剂，包括以下重量份的原料制备而成：生物吸附载体165份、枯草芽孢杆菌20份、巨大芽孢杆菌20份、绿色木霉菌10份、硝化细菌8份、圆褐固氮菌8份、贝莱斯芽孢杆菌5份、乙二胺四乙酸钠0.5份、壳聚糖0.5份。
30.所述生物吸附载体的制备方法为：
31.(1)将甘蔗秸秆用水冲洗干净，80℃烘干至恒重，采用粉碎机粉碎并过200目筛，得甘蔗秸秆粉；将秸秆粉置于马弗炉中，通入氮气，于500℃下煅烧1h，后自然降温至室温，得秸秆生物质炭；
32.(2)取步骤(1)所得秸秆生物质炭和硅藻土按质量比1.5:1混合均匀，按照液固比3：1加入到质量浓度为65％的h2so4溶液中，浸泡12h；接着用蒸馏水进行反复洗涤并过滤；
33.(3)将步骤(2)所得粉体置于小球藻液中，于室温下混合浸泡24后过滤、干燥及冷却，最后研磨至180～220目，得到生物吸附载体。
34.步骤(1)中煅烧的升温速率不超过5℃/min。
35.步骤(3)所述小球藻液的制备方法为：小球藻干藻粉加水配制成细胞悬浮液，50℃保温30min，离心过滤得到清液和滤渣，滤液于4℃储存备用；滤渣加水混合均匀，加入纤维素酶和蛋白酶，50℃继续保温24h小时，离心得上清液；将滤液和上清液混合，经浓缩至体积恒定，得小球藻液。
36.一种吸附去除土壤中重金属元素的复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
37.(1)制备小球藻液；
38.(2)制备生物吸附载体；
39.(3)按重量份将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、绿色木霉菌、硝化细菌、圆褐固氮菌、贝莱斯芽孢杆菌、乙二胺四乙酸钠、壳聚糖与生物吸附载体混合均匀，加入到气流粉碎机中，细度控制300-400目，得复合微生物菌剂。
40.本发明枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、绿色木霉菌、硝化细菌、圆褐固氮菌均为市售，有效活菌数为10-100亿/克。
41.实施例2
42.一种吸附去除土壤中重金属元素的复合微生物菌剂，包括以下重量份的原料制备而成：生物吸附载体130份、枯草芽孢杆菌15份、巨大芽孢杆菌18份、绿色木霉菌6份、硝化细菌5份、圆褐固氮菌6份、贝莱斯芽孢杆菌3份、乙二胺四乙酸钠0.3份、壳聚糖0.3份。
43.所述生物吸附载体的制备方法为：
44.(1)将甘蔗秸秆用水冲洗干净，80℃烘干至恒重，采用粉碎机粉碎并过200目筛，得甘蔗秸秆粉；将秸秆粉置于马弗炉中，通入氮气，于500℃下煅烧1h，后自然降温至室温，得
秸秆生物质炭；
45.(2)取步骤(1)所得秸秆生物质炭和硅藻土按质量比1.5:1混合均匀，按照液固比3：1加入到质量浓度为65％的h2so4溶液中，浸泡12h；接着用蒸馏水进行反复洗涤并过滤；
46.(3)将步骤(2)所得粉体置于小球藻液中，于室温下混合浸泡24后过滤、干燥及冷却，最后研磨至180～220目，得到生物吸附载体。
47.步骤(1)中煅烧的升温速率不超过5℃/min。
48.步骤(3)所述小球藻液的制备方法为：小球藻干藻粉加水配制成细胞悬浮液，50℃保温30min，离心过滤得到清液和滤渣，滤液于6℃储存备用；滤渣加水混合均匀，加入纤维素酶和蛋白酶，55℃继续保温24h小时，离心得上清液；将滤液和上清液混合，经浓缩至体积恒定，得小球藻液。
49.一种吸附去除土壤中重金属元素的复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
50.(1)制备小球藻液；
51.(2)制备生物吸附载体；
52.(3)按重量份将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、绿色木霉菌、硝化细菌、圆褐固氮菌、贝莱斯芽孢杆菌、乙二胺四乙酸钠、壳聚糖与生物吸附载体混合均匀，加入到气流粉碎机中，细度控制300-400目，得复合微生物菌剂。
53.本发明枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、绿色木霉菌、硝化细菌、圆褐固氮菌均为市售，有效活菌数为10-100亿/克。
54.实施例3
55.一种吸附去除土壤中重金属元素的复合微生物菌剂，包括以下重量份的原料制备而成：生物吸附载体165份、枯草芽孢杆菌20份、巨大芽孢杆菌20份、绿色木霉菌10份、硝化细菌8份、圆褐固氮菌8份、贝莱斯芽孢杆菌5份、乙二胺四乙酸钠0.5份、壳聚糖0.5份。
56.所述生物吸附载体的制备方法为：
57.(1)将甘蔗秸秆用水冲洗干净，80℃烘干至恒重，采用粉碎机粉碎并过200目筛，得甘蔗秸秆粉；将秸秆粉置于马弗炉中，通入氮气，于500℃下煅烧1h，后自然降温至室温，得秸秆生物质炭；
58.(2)取步骤(1)所得秸秆生物质炭和硅藻土按质量比1.5:1混合均匀，按照液固比3：1加入到质量浓度为65％的h2so4溶液中，浸泡12h；接着用蒸馏水进行反复洗涤并过滤；
59.(3)将步骤(2)所得粉体置于小球藻液中，于室温下混合浸泡24后过滤、干燥及冷却，最后研磨至180～220目，得到生物吸附载体。
60.步骤(1)中煅烧的升温速率不超过5℃/min。
61.步骤(3)所述小球藻液的制备方法为：小球藻干藻粉加水配制成细胞悬浮液，50℃保温30min，离心过滤得到清液和滤渣，滤液于10℃储存备用；滤渣加水混合均匀，加入纤维素酶和蛋白酶，60℃继续保温24h小时，离心得上清液；将滤液和上清液混合，经浓缩至体积恒定，得小球藻液。
62.一种吸附去除土壤中重金属元素的复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
63.(1)制备小球藻液；
64.(2)制备生物吸附载体；
65.(3)按重量份将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、绿色木霉菌、硝化细菌、圆褐固氮
菌、贝莱斯芽孢杆菌、乙二胺四乙酸钠、壳聚糖与生物吸附载体混合均匀，加入到气流粉碎机中，细度控制300-400目，得复合微生物菌剂。
66.本发明枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、绿色木霉菌、硝化细菌、圆褐固氮菌均为市售，有效活菌数为10-100亿/克。
67.对比例1
68.本对比例原料和制备方法基本同实施例3，唯一不同的是秸秆生物质炭和硅藻土的质量比为1:1。
69.对比例2
70.本对比例原料和制备方法基本同实施例3，唯一不同的是秸秆生物质炭和硅藻土的质量比为2:1。
71.对比例3
72.本对比例原料和制备方法基本同实施例3，唯一不同的是不添加有乙二胺四乙酸钠。
73.对比例4
74.本对比例原料和制备方法基本同实施例3，唯一不同的是不添加有壳聚糖。
75.大田实验
76.选取临沂市河东区某电镀厂附近有污染的土壤进行试验，种植品种番茄。品种为金鹏11号，株距35cm，行距50cm，种植方式为一膜一带两行。于5月中旬进行移栽，全生育期110d。
77.设实施例3、对比例1-4、空白对照6个试验处理。每个小区面积为25m 2
(5m
×
5m)，每个处理3次重复，共18个小区。
78.各试验组于2019年4月一次性均匀施于土壤表面，施用量10kg/亩。用旋耕机均匀翻入耕层0～20cm。2020年不再施加任何微生物菌剂，继续进行田间定位试验。底肥的施用量为：磷酸二胺(p2o5质量分数为39％)375kg/hm2，复合肥(n、p2o5、k2o比例为30％、5％、5％)75kg/hm2，生育期内追施尿素(n质量分数46.67％)225kg/hm2，通过文丘里施肥器进行膜下滴灌随水施肥，各小区其余田间管理保持一致。
79.种植前测定土壤指标，收获后统计产量和品质，并再次测定土壤指标。
80.测试方法：
81.根际土壤微生物釆用稀释平板分离法测定。根际土壤脲酶活性采用靛酚比色法测定。根际土壤转化酶采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定。过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定。根际土壤酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定。
82.土样，经自然风干、过筛后，土水比1:5浸提法，用酸度计和电导仪直接读出土壤的ph值和ec；采用碱解扩散法测定土壤水解氮含量，采用联合浸提-比色法测定速效磷和速效钾含量，采用重铬酸钾容量法测定有机质含量。采用抖土法采集根际土壤，经hcl-hno
3-hclo4消解后，用原子吸收分光光度计(perkinelmer simma 6000，norwalk，usa)测定根际土壤cd含量。采用国家标准与技术研究所提供的土壤标准物质(gbw#08303)对测定结果进行质量监控。所有土壤样品的cd回收率均高于95％，相对标准偏差(rsd)的精度在10％以内。
83.番茄果实cd含量测定：采用hno
3-hclo4(体积比4∶1)法消煮，原子吸收分光光度计
(perkin elmersimma 6000，norwalk，usa)测定。cd的检测限为0.005mg
·
kg-1
。采用国家标准与技术研究所提供的植株标准物质(gbw#08513)对测定结果进行质量监控。所有样品的cd回收率均高于95％，相对标准偏差(rsd)的精度在10％以内。
84.种植前土壤理化性质如下：
85.土壤容重为1.49g/cm3，ph值为7.21，电导率(ec)为3.11ms/cm，土壤有机质质量比14.01g/kg，速效磷质量比8.11mg/kg，速效钾质量比218.21mg/kg，碱解氮质量比50.01mg/kg、土壤cd含量为4.932mg
·
kg-1
。
86.表1实验结果
[0087][0088][0089]
从表中数据可以看出，施加本发实施例所得微生物菌剂后，土壤理化性质和生物活性明显提升，镉含量显著降。而改变了工艺参数的对比例1-4，功效均有所降低。本发明生物质炭和硅藻土的比例、促进剂乙二胺四乙酸钠、壳聚糖作等原料的选择和使用，是实现本发明微生物菌剂功效的关键所在，也是创新所在。
[0090]
需要说明的是，上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例，而非全
部实施例。显然，基于本发明的上述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例，都应当属于本发明保护的范围。