一种分泌鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗的杂交瘤细胞、单抗及应用

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种分泌鸭新型呼肠孤病毒σb蛋白单抗的杂交瘤细胞、单抗及应用。

背景技术：

鸭呼肠孤病毒(duckreovirus，drv)分为两种基因型，即i型和ii型。基因i型为经典型鸭呼肠孤病毒(classicaldrv，cdrv)，即番鸭呼肠孤病毒(muscoveyduckreovirus，mdrv)，该病毒主要感染番鸭和半番鸭，引起鸭坏死性肝炎(俗称番鸭“白点病”或“花肝病”)，以肝脾等脏器出现大量粟粒状坏死灶为病理特征，该病自1997以来在我国南方广东、广西、福建、浙江和江西等广泛流行；基因ii型为鸭新型呼肠孤病毒(noveldrv，ndrv)，该病毒可引起番鸭、半番鸭、北京鸭和鹅等水禽发病，其特征性病变为肝脾出现严重的坏死和出血(俗称“出血性坏死性肝炎”或“脾出血坏死症”)，该病最早发生于2000年，此后开始在我国的江苏、浙江、福建、广东、河北、山东等省暴发与流行。目前，基因ii型(ndrv)已成为我国流行的优势基因型。

ndrv基因组由10个节段的双链rna构成，全长23419bp。病毒粒子由二十面体对称的双层衣壳组成，直径70nm、无囊膜。依据sds-page电泳结果均可将基因组分为3个群，分别是：l组群(l1，l2，l3)，m组群(m1，m2，m3)和s组群(s1，s2，s3，s4)。σb是ndrv主要的核衣壳组成成分和外衣壳蛋白，其功能与哺乳动物呼肠孤病毒(mammalianreovirus，mrv)的σ3蛋白和arv及cdrv的σb蛋白相似，诱导宿主机体产生群特异性中和抗体。arv与cdrv的σb蛋白之间存在保守的免疫原性区及群特异性抗原表位。ndrv与cdrv为drv不同的基因型，而drv与arv均属于禽正呼肠孤病毒种群成员；ndrvσb蛋白与arv及cdrv的σb蛋白氨基酸同源性分别约60％和70％。

目前，ndrv的主要检测方法有病毒分离、rt-pcr、病毒中和试验(vnt)和间接elisa([1]陈仕龙，陈少莺，程晓霞，江斌，林峰强，王劭，朱小丽，李兆龙，张世忠。3种禽类呼肠孤病毒血清学相关性及致细胞病变差异分析.畜牧兽医学报，2011，42(4)：533-537.[2]yunt，chenhp，yub，zhangc，chenl，niz，huajg，yewc.developmentandapplicationofanindirectelisaforthedetectionofantibodiestonovelduckreovirus.journalofvirologicalmethods，2015，220：55-59.)等。其中elisa方法对于抗原和抗体均可检测，且该方法操作简单、快速、易批量化、以及灵敏性高和特异性强等特点，已成为病原流行病学调查抗体检测的首选方法。现有研究表明，各品种的鸭及鹅均可被ndrv感染及致病，而目前又没有一种商品化的广谱抗不同品种鸭及鹅的通用型血清二抗，这给ndrv病的血清学诊断带来诸多不便。

技术实现要素：

目前ndrvσb蛋白的表位抗原性以及是否存在群特异性抗原表位还不清楚。因此，本申请利用原核表达的重组σb蛋白作为免疫原制备了针对ndrvσb蛋白的特异性单克隆抗体(mab)，可用于ndrv特异性检测。

本发明首先提供了一种分泌鸭新型呼肠孤病毒(novelduckreovirus)σb蛋白单抗的杂交瘤细胞，为小鼠(musmusculus(mouse))杂交瘤细胞(脾脏细胞×骨髓瘤细胞(sp20))，分类命名为杂交瘤细胞株ndrvyt2-c10，保藏号为cctccno：c202148，保藏日为2021年3月24日，保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

本发明又提供了一种鸭新型呼肠孤病毒σb蛋白单抗，由保藏号为cctccno：c202148的杂交瘤细胞分泌。

本发明又提供了所述鸭新型呼肠孤病毒σb蛋白单抗在制备检测鸭新型呼肠孤病毒的试剂盒中的应用。

本发明又提供了一种用于鸭新型呼肠孤病毒抗体阻断elisa检测的试剂盒，包括：

(1)经标记物标记的所述鸭新型呼肠孤病毒σb蛋白单抗；

(2)鸭新型呼肠孤病毒σb蛋白。

常用于elisa的标记物有hrp(辣根过氧化物酶)和ap(碱性磷酸酶)，两者的催化底物和反应终止液根据各自酶种类进行选择。

所述的试剂盒，还包括：封闭液、tmd底物显色液、显色终止液。这些试剂可以使用现有技术中elisa检测时常用的成分。比如，封闭液可以使用一定浓度的bsa蛋白、脱脂奶粉或者明胶等。显色终止液可以使用一定浓度的硫酸溶液。

本发明又公开了所述试剂盒在禽类接种鸭新型呼肠孤病毒疫苗后的免疫状况评估中的应用。本发明试剂盒还可以用于鸭新型呼肠孤病毒疫病的血清学监测，或者爆发过鸭新型呼肠孤病毒疫病的环境经处理后进行检测以确认安全。

本发明还提供了一种非疾病诊断为目的、用于鸭新型呼肠孤病毒抗体阻断elisa检测的方法，包括以下步骤：

(1)使用鸭新型呼肠孤病毒σb蛋白包被elisa板，然后洗涤去除多余的鸭新型呼肠孤病毒σb蛋白；

(2)使用封闭液进行封闭，封闭后洗涤去除多余封闭液；

(3)加入待测血清样本孵育，孵育后洗涤去除待测血清样本中未结合的物质；

(4)加入经hrp标记的权利要求2所述鸭新型呼肠孤病毒σb蛋白单抗孵育，孵育后加入tmd底物显色液进行显色；

(5)显色后加入显色终止液终止显色，并用酶标仪读取elisa板中各孔的od450nm值；

(6)计算阻断率pi，

pi＝(1-被检血清od450nm/阴性血清od450nm)×100％，

根据阻断率值判断待测血清样本为鸭新型呼肠孤病毒阳性或阴性。

判断待测血清样本为鸭新型呼肠孤病毒阳性或阴性时使用的阻断率值标准可以根据具体情况进行简单的摸索确定。

本发明还提供了所述的方法在禽类接种鸭新型呼肠孤病毒疫苗后的免疫状况评估中的应用。本发明方法还可以用于鸭新型呼肠孤病毒疫病的血清学监测，或者爆发过鸭新型呼肠孤病毒疫病的环境经处理后进行检测以确认安全。

本发明制备获得了一种分泌鸭新型呼肠孤病毒(novelduckreovirus)σb蛋白单抗的杂交瘤细胞，制备获得了鸭新型呼肠孤病毒σb蛋白单抗，具有较高的效价，且具有较强的特异性。

使用制备的单抗建立了一种以纯化的重组ndrvσb蛋白作为包被抗原，hrp标记的抗σb蛋白单抗作为检测抗体的阻断elisa，该方法能特异性地识别ndrv阳性血清，而与其它鸭、鹅常见病抗体阳性血清无交叉反应；重复性试验表明，批间和批内的变异系数均小于10％；敏感性为90.5％，特异性为94.5％，且与病毒中和试验的符合率为93.8％。

附图说明

图1为重组σb蛋白sds-page检测结果图，其中，泳道m：蛋白分子marker；1：未诱导的重组菌体；2：诱导的pet-sumo-σb菌液；3：诱导后的全菌裂解上清；4：裂解后的菌体沉淀；5：纯化后的重组蛋白σb。

图2为mabs的westernblot分析结果图，其中，泳道m：预染蛋白marker；1：制备的mab与病毒株ndrvzj00m感染的df-1细胞系反应；2：制备的mab与未感染病毒株ndrvzj00m的df-1细胞系反应。

图3为制备的mab的ifa鉴定结果图，其中，a：制备的mab与病毒株ndrvzj00m感染的df-1细胞系反应；b：阳性血清对照；c：阴性血清对照。

图4为阻断elisa的特异性试验检测结果图。

具体实施方式

实施例1：鸭新型呼肠孤病毒σb蛋白单克隆抗体的制备

(1)细胞、病毒株及实验动物

骨髓瘤细胞(sp2/0)和df-1细胞由本实验室保存；大肠杆菌dh5α和bl21(de3)感受态细胞购自北京式金生物技术有限公司；6～8周龄balb/c小鼠购自购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

(2)主要试剂及材料

pet-28a(+)-sumo载体(商业化可购买)由本实验保存；hrp标记的山羊抗鼠igg抗体(hrp-igg)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、peg4000、hat、ht均购自sigma公司；mab亚型检测试剂盒购自赛默飞公司；二氨基联苯胺(dab)显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；dab底物显色液购自天根生化科技(北京)有限公司；ni-ntakit购自novagen(madison，usa)公司。

(3)重组质粒pet-28a-sumo-σb的构建、蛋白表达及纯化

根据ndrvzj00m株的s3基因序列(genbank登录号：kf154118.1)，利用oligo6.0软件，以s3基因的orf为目标区设计了一对引物，引物由invitrogen公司合成。其序列如下sigb-f：5’-cgcggatccatggaggtgcgtgtgccaaac-3’(bamhi)，sigb-r：5’-gcactcgagttaccacctacactccaggaag-3’(xhoi)。经rt-pcr扩增获得σb目的片段，用bamhi/xho1分别双酶切目的片段σb和载体pet-28a(+)-sumo，以t4dna连接酶进行连接，构建重组质粒pet-sumo-σb。重组质粒pet-sumo-σb经bamhi和xhoi双酶切鉴定得到两个片段，与预期大小5335bp和1428bp一致，经测序验证序列正确。

将重组质粒pet-sumo-σb转入宿主菌bl21(de3)中，经37℃iptg诱导5h，超声裂解细菌收集上清及沉淀后分别进行sds-page检测。结果表明，表达的σb-his主要以包涵体的形式存在于细胞沉淀中，大小约为55ku，大小与预期相符(图1)。而利用ni-nta试剂盒纯化后的σb-his纯度高，电泳显示条带单一(图1)。

(4)动物免疫

将纯化的重组σb蛋白对6～8周龄的balb/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(100μg/只)。间隔两周免疫一次。首免以等体积的弗氏完全佐剂乳化，二免和三免以等体积弗氏不完全佐剂乳化。三免7d后尾部采血，将血清倍比稀释，利用纯化的重组σb蛋白包被的elisa板检测血清抗体效价，选择血清效价最高的小鼠于融合前3d再用σb蛋白(100μg/只)(不加佐剂)进行加强免疫，3d时取小鼠脾脏细胞与sp2/0细胞进行细胞融合。

(5)细胞融合及mab的制备

按常规方法进行融合(heddyzola.单克隆抗体技术手册[m].周宗安等.南京：南京大学出版社，1991.)，以纯化的重组σb-sumo蛋白为包被抗原，建立间接elisa方法。取细胞培养上清液进行检测，以抗ndrv阳性血清为阳性对照，未免疫小鼠的血清为阴性对照。采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行3次克隆纯化，直至筛选结果100％为阳性。对筛选出能够稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞按常规方法进行制备腹水，腹水效价通过间接elisa方法检测。

细胞融合后，经间接elisa方法对杂交瘤细胞进行筛选，将阳性的杂交瘤细胞经过3次克隆纯化获得稳定分泌抗ndrvσb蛋白mab的阳性杂交瘤细胞株，为小鼠(musmusculus(mouse))杂交瘤细胞(脾脏细胞×骨髓瘤细胞(sp20))，分类命名为杂交瘤细胞株ndrvyt2-c10(简称2-c10)，保藏号为cctccno：c202148，保藏日为2021年3月24日，保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。抗体亚类鉴定结果显示，单抗亚型为igg1/κ。间接elisa检测杂交瘤细胞上清液抗体效价为1∶1280，腹水经纯化后效价为1∶240000。

(6)mab的westernblot分析

将感染ndrv的df-1细胞沉淀处理后进行sds-page电泳后，转印至硝酸纤维素(nc)膜，5％脱脂乳封闭。以制备的mab为一抗，羊抗鼠igg-hrp为二抗，同时以未感染的df-1细胞沉淀作为阴性对照，dab试剂盒显色，进行westernblot分析。

以ndrv全病毒为抗原，westernblot检测结果显示，获得的杂交瘤细胞株2-c10分泌的mab能够与ndrv全病毒发生反应，在约41ku处出现特异性条带(图2)，而与未接ndrv的df-1细胞呈阴性反应。结果表明制备的mab能够特异识别天然ndrv的σb蛋白。

(7)间接免疫荧光(ifa)鉴定

将ndrv接种df-1细胞，以未接种的细胞为阴性对照，培养48h后固定细胞，以制备的mab作为一抗，羊抗鼠igg-fitc为二抗，进行ifa鉴定。

ifa检测结果显示，制备的mab及阳性血清均与ndrv呈阳性反应，产生绿色荧光；而阴性对照组无荧光(图3)，表明制备的mab具有较强的特异性。

实施例2：鸭新型呼肠孤病毒抗体阻断elisa的建立

(1)细胞、质粒、血清及主要试剂

质粒pet-sumo-sigb(实施例1中构建)、宿主菌bl21(de3)、分泌抗ndrvsigb蛋白单克隆抗体(2-c10)的杂交瘤细胞株(实施例1中制备)。ndrv抗体标准阴、阳性血清、cdrv抗体阳性血清、番鸭细小病毒(mpv)抗体阳性血清、小鹅瘟病毒(gpv)抗体阳性血清、鸭瘟病毒(dpv)抗体阳性血清、a型鸭甲肝病毒(dhav-a)抗体阳性血清、禽流感病毒(aiv)抗体阳性血清及鸭疫里墨氏杆菌(riemerellaanatipestifer，ra)和多杀性巴氏杆菌(pasteurellamultocida，pm)阳性鸭血清，均由本实验制备和保存。制备方法如下：将各菌、毒株先用甲醛灭活，再分别与油佐剂(1∶1)进行乳化，然后接种非免成年种番鸭，共免疫3次，间隔2周。首免采用弗氏完全佐剂，2-3免采用弗氏不完全佐剂。被免疫的各番鸭，于3免后2周进行采血，分离血清。-20℃以下保存与备用。

(2)阻断elisa方法的建立

用ph为9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释已纯化的ndrvsigb蛋白(实施例1制备)，每孔100μl加入96孔elisa板，4℃过夜包被；然后用含有0.05％吐温20的0.05mol/l的pbs(pbst，ph＝7.2)洗涤3次，非特异性结合位点用200ul含1％bsa的pbst封闭缓冲液，37℃封闭1h，洗涤方法同上；加入pbst稀释的待检血清，每孔100μl，37℃孵育1h，洗涤方法同上；加入pbst稀释的酶标单抗，每孔100μl，37℃孵育1h；加入tmb底物显色液，每孔100μl，37℃显色10min；每孔加入2mol/l的硫酸50μl终止反应，用酶标仪读取各孔的od450nm值。按以下公式计算阻断率(percentageinhibition，pi)，pi＝(1-被检血清od450nm/阴性血清od450nm)×100％。

(3)阻断elisa反应条件的优化

采用方阵法确定抗原包被的浓度和hrp标记的单克隆抗体2-c10的最佳稀释度，且每个稀释度重复一次，取其平均值，计算各阴、阳性血清的阻断率，选择阴性血清od450接近1，且阳性血清阻断率最高的反应条件作为最佳反应条件。将ndrv抗体阳性血清和阴性血清以1∶1、1∶2、1∶5和1∶10进行稀释，再分别以5％脱脂乳、1％bsa和5％鱼皮明胶作为封闭剂，根据阻断率选择合适的血清稀释度及封闭液。再将ndrv抗体阳性血清和阴性血清按最佳稀释度在37℃分别作用0.5、1、1.5和2h，根据阻断率选择合适的血清孵育时间。最后将已确定稀释倍数的hrp标记的2-c10单抗(hrp-2-c10)作用时间分别按0.5、1和1.5h进行，最终根据阻断率选择合适的酶标单抗作用时间。

通过对各步骤反应条件进行筛选，当ndrvsigb蛋白包被浓度为0.3125μg·ml^-1且hrp-2-c10的稀释度为0.625μg·ml^-1时阴性血清od450nm达到1.0左右、阳性血清的阻断率达到最高。由其他条件的优化结果可知，以1％bsa作为封闭液、以1∶4稀释待检血清样品在37℃孵育1h、酶标单抗在37℃孵育1h时，对应的每组阻断率均最高，因此选择以上条件作为建立检测ndrv抗体阻断elisa的条件。

(4)临界值的确定

利用优化的阻断elisa方法对521份不含ndrv抗体的番鸭、樱桃谷鸭和鹅阴性血清进行检测，测得各血清样品od450nm，并计算阻断率。然后计算出521份阴性血清的平均阻断率和标准偏差(sd)，以确定结果判定的临界值。

利用阻断elisa对521份ndrv抗体阴性番鸭血清检测数据计算可得阻断率平均值x为-0.64％，标准差s为12.55％。根据公式x+2s＝24.46％，x+3s＝37.01％，确定本方法的判定标准：pi≥37.01％判为阳性；pi≤24.46％时判为阴性；24.46％＜pi＜37.01％时判为可疑，需再次复检一次，若仍为pi＜24.46％判为阴性，否则判为阳性。

(5)重复性试验

同一批次包被封闭的elisa板中，随机取出1块，检测5份不同阻断率的阳性血清样品和3份阴性血清样品，每个血清样本设置3个重复，在同一条件下进行检测，计算各血清样本的批内变异系数；3个不同批次的阻断elisa板中，各随机取出1块，在同一条件下对6份血清样本进行检测，计算各血清的批间变异系数。

选取8份番鸭血清样品进行阻断elisa检测方法的重复性试验，结果可知(表1)，8份番鸭血清在批内重复性试验的变异系数为0.6％～4.2％，批间重复性试验的变异系数为1.1％～5.9％，均小于10％，表明建立的阻断elisa检测方法具有良好的重复性。

表1阻断elisa方法批内和批间重复性试验

(6)特异性试验

用已经建立的阻断elisa方法，对mpv、gpv、dpv、dhav-a、aiv、ra、pm和ndrv抗体阳性鸭血清进行检测，根据抑制率(pi)临界值判断该方法的特异性。

以ndrv抗体阴、阳性血清为对照，用建立的阻断elisa方法对cdrv、mpv、gpv、dpv、dhav-a、aiv、ra和pm常见番鸭病毒病和细菌病抗体阳性血清进行检测。检测结果显示，除ndrv抗体阳性血清为阳性反应外，其他几种番鸭疫病阳性血清均为阴性反应，从而证明该阻断elisa方法可特异性检测ndrv抗体，并与其他几种番鸭病毒病阳性血清无交叉反应(图4)。表明该方法具有较强的特异性。

(7)符合性试验

取112份临床番鸭血清，分别用病毒中和试验和本研究建立的阻断elisa方法进行检测对比，依据检测结果计算本方法与病毒中和试验的检测符合率。

用病毒中和试验与本研究建立的阻断elisa同时对112份临床番鸭血清样品进行检测，结果显示，病毒中和试验检测为阳性的血清样品为24份，阴性的血清样品数为88份；用本研究建立的阻断elisa检测，21份血清样品为阳性，86份血清样品为阴性。经计算，本研究建立的阻断elisa检测方法的敏感性为90.5％(19/21)，特异性为96.6％(86/91)，阻断elisa与病毒中和试验检测结果符合率为93.8％(86/91)，kappa值为0.81。

表2阻断elisa与病毒中和试验检测结果的比较

(8)阻断elisa的应用

(8.1)用于疫苗免疫监测

浙江金华某种番鸭养殖场实施了ndrv灭活疫苗免疫，二次免疫后4个月内，共采集540份种番鸭血清，138份卵黄抗体，采用本研究建立的阻断elisa方法进行检测，以评估疫苗免疫后种番鸭后抗体产生情况。

结果显示阳性血清抗体536份，抗体阳性率99.26％(536/540)；阳性卵黄抗体136份，抗体阳性率98.6％(136/138)。表明疫苗免疫后诱导种番鸭及其种蛋产生良好的抗体。

(8.2)用于临床血清样品的检测

收集浙江省不同地区血清共762份，其中番鸭血清606份、樱桃谷鸭60份、鹅血清96份。采用本研究建立的阻断elisa方法进行检测，以调查浙江省ndrv血清阳性率的情况。

表3阻断elisa番鸭、樱桃谷鸭和鹅临床血清样品ndrv抗体检测结果

结果如表3所示，606份番鸭血清中，106份商品番鸭血清ndrv抗体阳性检出率为8.5％，500份种番鸭血清ndrv抗体阳性率为22.6％，总检出率为18.6％。60份樱桃谷鸭血清样品中ndrv抗体阳性率为6.7％。96份鹅血清样品中ndrv抗体阳性率为8.3％。表明临床番鸭、樱桃谷鸭和鹅血清中均存在不同水平的ndrv抗体，其中种番鸭血清样品的抗体阳性率最高。

序列表

<110>浙江省农业科学院

<120>一种分泌鸭新型呼肠孤病毒σb蛋白单抗的杂交瘤细胞、单抗及应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cgcggatccatggaggtgcgtgtgccaaac30

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