一种产n
‑
乙酰神经氨酸的重组微生物及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物发酵技术领域，具体地说，涉及一种产n
‑
乙酰神经氨酸的重组微生物及其应用。
背景技术：
2.n
‑
乙酰神经氨酸是一种九碳醣衍生物，在动物体内构成细胞黏附的糖蛋白、寡糖基和大脑神经节苷脂糖链的重要组成。n
‑
乙酰神经氨酸主要天然来源是母乳、牛奶、鸡蛋、奶酪和燕窝，其中又以燕窝中的神经氨酸含量较高，达7～12％，因此又被称“燕窝酸”。n
‑
乙酰神经氨酸在一般食品中含量甚低，且水解后的神经氨酸单体到达人体器官的利用率相当低。因此，为满足功能代谢的需求，对于人体、特别是婴儿有必要进行外源性补充。目前n
‑
乙酰神经氨酸已经广泛应用于婴儿配方食品，保健食品，化妆品等领域。
3.n
‑
乙酰神经氨酸的生产方法主要包括天然产物抽提法、化学合成法、生物酶法和微生物发酵法。天然产物中n
‑
乙酰神经氨酸含量低，产率低；化学合成反应条件严苛，易造成环境污染；全细胞生物酶以丙酮酸和乙酰氨基葡萄糖为原料，价格昂贵，且神经氨酸醛缩酶催化会可逆分解，反应结束后残留大量的丙酮酸致使产物分离遇到困难，使得转化率低，生产成本高。
4.利用葡萄糖作为廉价低碳原料直接发酵生产n
‑
乙酰神经氨酸，反应条件温和，环境友好，对降低n
‑
乙酰神经氨酸的生产成本以及拓展下游产品的应用范围和国际竞争力具有重要意义。
技术实现要素：
5.本发明的目的是提供一种重组微生物，其在发酵过程中能够利用葡萄糖作为廉价低碳原料直接发酵生产大量n
‑
乙酰神经氨酸。
6.本发明在对微生物的n
‑
乙酰神经氨酸代谢相关途径及其代谢流量进行预测分析的基础上，发现n
‑
乙酰神经氨酸的前体磷酸烯醇式丙酮酸反应物浓度为影响n
‑
乙酰神经氨酸产量的关键因素之一。而细菌独有的pts转运系统，在摄取葡萄糖需同时消耗磷酸烯醇式丙酮酸，因此在代谢过程中，n
‑
乙酰神经氨酸的前体磷酸烯醇式丙酮酸反应物浓度下降。结合实验发现基因敲除糖酵解最后一步的丙酮酸激酶基因，降低前体磷酸烯醇式丙酮酸的消耗，能有效地提高n
‑
乙酰神经氨酸的产量。
7.进而提出本发明的技术方案如下：
8.一种重组微生物，所述重组微生物与出发菌株相比，具有降低的丙酮酸激酶的表达和/或酶活性；所述丙酮酸激酶为丙酮酸激酶i和/或丙酮酸激酶ii；
9.所述出发菌株为能够合成n
‑
乙酰神经氨酸的微生物。
10.所述丙酮酸激酶为两种构型的丙酮酸激酶i(pykf)和丙酮酸激酶ii(pyka)，pykf基因和pyka基因为重组微生物自身基因组中所有。
11.本发明所指能够合成n
‑
乙酰神经氨酸的微生物可为能够合成n
‑
乙酰神经氨酸的
野生型菌株(或其衍生菌株)，或者对本身不能合成n
‑
乙酰神经氨酸的野生型菌株(或其衍生菌株)进行诱变或基因工程改造获得的菌株。
12.本发明的出发菌株对于其n
‑
乙酰神经氨酸的产量高低没有特别限制，为获得高产n
‑
乙酰神经氨酸的生产菌株，优选以具有相对较高n
‑
乙酰神经氨酸产量的菌株作为出发菌。
13.优选地，所述重组微生物中丙酮酸激酶的两种构型编码基因同时失活，即可获得高产n
‑
乙酰神经氨酸的重组微生物。来源于上述各种微生物的氨基酸序列以及编码基因序列均可通过ncbi等数据库获得。其中，来源于大肠杆菌的pykf和pyka编码基因序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
14.本发明中，所述表达和/或酶活性的降低通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式实现：
15.(1)对目标酶的编码基因进行一个或多个碱基的插入、缺失或替换以使得目标酶失活或活性降低；
16.(2)将目标酶的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更低的调控元件。
17.作为一个优选方案，本发明重组微生物的出发菌株与其野生型菌株相比，具有提高的udp
‑
n
‑
乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和n
‑
乙酰神经氨酸合成酶的表达和/或酶活性，并具有6
‑
磷酸葡萄糖胺合成酶突变体；所述6
‑
磷酸葡萄糖胺合成酶突变体(glms*)相比于野生型6
‑
磷酸葡萄糖胺合成酶包含e15k，d387v，s450p和e525g的突变。
18.本发明中，所述udp
‑
n
‑
乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和n
‑
乙酰神经氨酸合成酶来源于空肠弯曲菌(campylobacter jejuni)；和/或，所述野生型6
‑
磷酸葡萄糖胺合成酶来源于大肠杆菌。
19.来源于空肠弯曲菌的neub(编码n
‑
乙酰神经氨酸合成酶的基因)的氨基酸序列如seq id no.3所示，neuc(编码udp
‑
n
‑
乙酰氨基葡萄糖差向异构酶的基因)的氨基酸序列如seq id no.4所示，neubc基因簇的序列如seq id no.5所示。来源于大肠杆菌的glms*的氨基酸序列如seq id no.6所示，编码基因序列如seq id no.7所示。
20.本发明中，所述表达和/或酶活性的提高和6
‑
磷酸葡萄糖胺合成酶突变体的具备，通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式实现：
21.(1)增加目标酶的编码基因的拷贝数；
22.(2)将目标酶的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更高的调控元件；
23.优选，所述增加目标酶的编码基因的拷贝数通过导入携带所述编码基因的质粒和/或在基因组上整合所述编码基因实现；
24.所述转录或翻译调控元件选自启动子、核糖体结合位点、增强子中的一种或多种。
25.本发明中，udp
‑
n
‑
乙酰氨基葡萄糖差向异构酶、n
‑
乙酰神经氨酸合成酶和6
‑
磷酸葡萄糖胺合成酶突变体简称为目标酶。
26.对于导入携带目标酶的编码基因的质粒的方式，这些目标酶可存在于同一质粒上，或者分别存在于不同的质粒上。
27.对于质粒，没有特别的限制，只要能够在出发菌株中克隆、表达目标酶的质粒均可使用。对于质粒的拷贝数，本发明没有特别的限制，可为高拷贝质粒、中拷贝质粒或低拷贝质粒。为获得高产n
‑
乙酰神经氨酸的生产菌株，优选的质粒为拷贝数为5～100的质粒。
28.以出发菌株为大肠杆菌为例，所述质粒可为pxmj19、ptrc99a、pet28a、puc18等中的任一种。
29.优选地，将udp
‑
n
‑
乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和n
‑
乙酰神经氨酸合成酶的编码基因与6
‑
磷酸葡萄糖胺合成酶突变体的编码基因共同置于一个质粒上进行过表达。具体地，从距离ptrc99a多克隆位点区启动子由近至远的方向，依次为n
‑
乙酰神经氨酸合成酶的编码基因、udp
‑
n
‑
乙酰氨基葡萄糖差向异构酶编码基因、6
‑
磷酸葡萄糖胺合成酶突变体编码基因。
30.对于在基因组上整合目标酶的编码基因的方式，整合编码基因的拷贝数至少为1个，对于整合拷贝数的具体数量，本发明没有特别的限制，为获得高产n
‑
乙酰神经氨酸的生产菌株，优选的整合拷贝数为1～10个。
31.对于将转录或翻译调控元件替换为活性更高的调控元件的方式，可采用将目标酶的编码基因的启动子替换为活性更强的启动子，例如：trc、tac、j23110、t7、t5等。
32.本发明所述的酶活性的提高可利用目前已报道的以上目标酶的突变体，或者利用本领域常规技术手段对以上目标酶进行突变，获得酶活性提高的突变体。
33.进一步优选地，本发明重组微生物的出发菌株与其野生型菌株相比，具有降低的n
‑
乙酰神经氨酸醛缩酶、n
‑
乙酰神经氨酸转运蛋白、n
‑
乙酰
‑6‑
磷酸甘露糖胺异构酶和n
‑
乙酰甘露糖胺激酶的表达和/或酶活性；
34.优选，所述表达和/或酶活性的降低的实现方式如上所述。
35.大肠杆菌中，nana(编码n
‑
乙酰神经氨酸醛缩酶的基因)、nant(编码n
‑
乙酰神经氨酸转运蛋白的基因)、nane(编码n
‑
乙酰
‑6‑
磷酸甘露糖胺异构酶的基因)和nank(编码n
‑
乙酰甘露糖胺激酶的基因)以基因簇形式存在，其序列如seq id no.8所示。
36.作为本发明的优选实施方式，所述出发菌株中n
‑
乙酰神经氨酸醛缩酶、n
‑
乙酰神经氨酸转运蛋白、n
‑
乙酰
‑6‑
磷酸甘露糖胺异构酶和n
‑
乙酰甘露糖胺激酶的编码基因同时失活。
37.本发明发现，在失活nana、nant、nane、nank，并过表达neubc、glms*的出发菌株基础上，简单地失活pykf、pyka，即可获得高产n
‑
乙酰神经氨酸的重组微生物。
38.作为本发明的一种具体实施方式，本发明提供一种重组微生物，其为敲除了pykf、pyka和nana、nant、nane和nank的大肠杆菌，并含有过表达质粒ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*，形成大肠杆菌bl21
△
nanatek
‑
pykfa/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*。
39.本发明还提供一种上述重组微生物的构建方法，其包括从出发菌株敲除pykf、pyka、nana、nant、nane和nank基因的步骤和将包含udp
‑
n
‑
乙酰氨基葡萄糖差向异构酶、n
‑
乙酰神经氨酸合成酶及6
‑
磷酸葡萄糖胺合成酶突变体的编码基因的质粒导入出发菌株的步骤。
40.具体地，作为优选示例，针对大肠杆菌bl21
△
nanatek
‑
pykfa/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*，其构建方法包括如下步骤：
41.(1)敲除大肠杆菌bl21的nana、nant、nane和nank；
42.(2)敲除大肠杆菌bl21的pykf、pyka；
43.(3)在ptrc99a的多克隆位点区依次连入neubc和glms突变体glms*，得到过表达质粒ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*；
44.(4)将步骤(3)得到的过表达质粒导入步骤(2)的敲除菌株中。
45.本发明另提供一种上述重组微生物的如下任一种应用：
46.(1)在发酵生产n
‑
乙酰神经氨酸或唾液酸化化合物中的应用；
47.(2)在用于生产n
‑
乙酰神经氨酸或唾液酸化化合物的微生物遗传育种中的应用。
48.所述唾液酸化化合物包括但不限于唾液酸化寡糖(唾液酸化乳糖等)、唾液酸化酯、唾液酸化糖酯、唾液酸化蛋白质或唾液酸化苷元。
49.本发明还提供一种发酵生产n
‑
乙酰神经氨酸或唾液酸化化合物的方法，其包括培养上述重组微生物的步骤。
50.具体地，所述发酵生产n
‑
乙酰神经氨酸或唾液酸化化合物的方法包括如下步骤：
51.(1)在包含至少一种可同化的碳源的培养基中培养上述重组微生物，获得包含n
‑
乙酰神经氨酸的发酵液；
52.(2)从步骤(1)中获得的发酵液中回收n
‑
乙酰神经氨酸。
53.其中，可同化的碳源可选自葡萄糖、甘油、蔗糖、麦芽糖中的一种或多种，优选为葡萄糖。
54.本发明的有益效果至少在于：
55.本发明通过对重组微生物进行系统的改造和创新，获得了能够特别适宜以葡萄糖这一廉价碳源为原料进行发酵生产n
‑
乙酰神经氨酸的重组微生物，该重组微生物的n
‑
乙酰神经氨酸产量可达60g/l以上，远高于目前唾液酸的发酵生产水平，实现了从葡萄糖这一廉价碳源到唾液酸的高效转化，显著降低唾液酸的生产成本，具有重要的工业应用价值和十分广阔的应用前景。
具体实施方式
56.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
57.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
58.实施例1出发菌株的构建
59.本实施例以大肠杆菌bl21为例，构建能够合成n
‑
乙酰神经氨酸的出发菌株，具体为：在大肠杆菌bl21中敲除nanatek基因簇，同时导入过表达质粒ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*，获得能够产n
‑
乙酰神经氨酸的出发菌株bl21
△
nanatek/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*。
60.1.nanatek的敲除方法
61.利用red重组方法敲除nanatek(基因簇序列如seq id no.8所示)，具体方法如下：以nan
‑
f(ggtataacaggtataaaggtatatcgtttatcagacaagcatcacttcagaggtatttgtgtaggctggagctgcttc，seq id no.9)和nan
‑
r(tcataatttttctccctgggccaacagcgcagccccaagtaaacctgcatcatggcggtaatgcgccgccctgtcaaacatgagaattaa，seq id no.10)为引物，以质粒pkd13(购自addgene)为模板扩增获得1.3kb的pcr片段，将该片段通过电转转入到包含质粒psij8(购自addgene)的大肠杆菌bl21中，在包含50mg/l的卡那霉素的lb平板上筛选获得抗性的菌株。挑取单克隆菌株在包含1％鼠李唐的lb培养基中过夜培养(42℃)，获得抗性消失的菌
株，命名为bl21
△
nanatek。
62.2.过表达质粒ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*的构建方法
63.人工合成neubc和glms*基因，其基因序列如seq id no.5和seq id no.7所示。利用gibson组装的方法将neubc和glms*基因插入到质粒ptrc99a(购自addgene)的bamhii/xbai酶切位点处，获得质粒ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*。
64.3.出发菌株bl21
△
nanatek/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*的构建
65.将过表达质粒ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*电转入大肠杆菌bl21
△
nanatek，在含有25mg/l氯霉素的lb平板上获得抗性菌株，经鉴定ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*成功转入bl21
△
nanatek中，将转入ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*的菌株命名为bl21
△
nanatek/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*。
66.实施例2失活丙酮酸激酶的基因敲除重组菌的构建
67.在实施例1构建的bl21
△
nanatek的基础上，进一步敲除编码基因丙酮酸激酶pykfa，同时导入过表达质粒ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*，获得能够产n
‑
乙酰神经氨酸的基因工程菌株bl21
△
nanatek
‑
pykfa/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*。
68.1.pykfa的敲除方法
69.利用red重组方法敲除pykf(编码基因序列如seq id no.1所示)，具体方法如下：以pykf
‑
f(gactcttgaatggtttcagcactttggactgtagaactcaacgactcaaagtgtaggctggagctgcttcgaa，seq id no.11)和pykf
‑
r(atccccggaattaattctcatgtttgacagtattgcttttgtgaattaatttgtatatcgaagcgccctgatgggcgctt，seq id no.12)为引物，以质粒pkd13(购自addgene)为模板扩增获得1.3kb的pcr片段，将该片段通过电转转入到包含质粒psij8(购自addgene)的大肠杆菌bl21
△
nanatek中，在包含50mg/l的卡那霉素的lb平板上筛选获得抗性的菌株。挑取单克隆菌株在包含1％鼠李唐的lb培养基中过夜培养(42℃)，获得抗性消失的菌株，命名为bl21
△
nanatek
‑
pykf。
70.进一步地，再次利用red重组方法敲除pyka(编码基因序列如seq id no.2所示)，具体方法如下：以pyka
‑
f(atcgcggcgttatttcattcggatttcatgttcaagcaacacctggttgtgtgtaggctggagctgcttcga，seq id no.13)和pyka
‑
r(atccccggaattaattctcatgtttgacagtccggcctacagttcaatgatagttcaacagatttcgaatattctgaagc，seq id no.14)为引物，以质粒pkd13(购自addgene)为模板扩增获得1.3kb的pcr片段，将该片段通过电转转入到包含质粒psij8(购自addgene)的大肠杆菌bl21
△
nanatek
‑
pykf中，在包含50mg/l的卡那霉素的lb平板上筛选获得抗性的菌株。挑取单克隆菌株在包含1％鼠李唐的lb培养基中过夜培养(42℃)，获得抗性消失的菌株，命名为bl21
△
nanatek
‑
pykfa。
71.2.基因工程菌株bl21
△
nanatek/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*的构建
72.将实施例1构建的过表达质粒ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*电转入大肠杆菌bl21
△
nanatek
‑
pykfa，在含有25mg/l氯霉素的lb平板上获得抗性菌株，经鉴定ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*成功转入bl21
△
nanatek
‑
pykfa中，将转入ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*的菌株命名为bl21
△
nanatek
‑
pykfa/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*。
73.实施例3基因工程菌株的发酵验证
74.对实施例1构建的出发菌株以及实施例2构建的基因工程菌株进行摇瓶发酵实验，以验证其产生n
‑
乙酰神精氨酸的能力。
75.发酵使用的培养基配方如下：
76.m9y
‑
葡萄糖培养基：葡萄糖30g/l，磷酸氢二钾16g/l，磷酸二氢钾14g/l，二水合柠檬酸钠1g/l，硫酸铵7.5g/l，七水合硫酸镁0.25g/l，氯化钙15mg/l，酵母粉5g/l，氯霉素25mg/l。
77.1.摇瓶发酵
78.将大肠杆菌bl21
△
nanatek
‑
pykfa/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*和出发菌株bl21
△
nanatek/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*，在500ml的摇瓶进行培养，培养基为m9y
‑
葡萄糖，培养温度为37℃，转速200rpm，在菌体长到od
600
达到0.6时，加入1mm的iptg进行诱导。发酵72h时取样，利用高效液相色谱检测二株菌生产n
‑
乙酰神经氨酸的情况。
79.结果显示，在m9y
‑
葡萄糖培养基中，大肠杆菌bl21
△
nanatek
‑
pykfa/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*的n
‑
乙酰神经氨酸(唾液酸)产量达到4.89g/l，而出发菌株bl21
△
nanatek/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*的唾液酸的产量为2.92g/l。
80.以上结果表明：
81.失活丙酮酸激酶的基因工程菌可显著提高n
‑
乙酰神经氨酸的产量，在相同的发酵条件下，n
‑
乙酰神经氨酸的产量与出发菌株相比提高了1.97g/l。
82.2.发酵罐发酵
83.进一步在发酵罐中测试大肠杆菌bl21
△
nanatek
‑
pykfa/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*，出发菌株bl21
△
nanatek/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*，bl21
△
pykfa、bl21/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*，bl21
△
pykfa/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*(制备方式与实施例2相同，区别仅在于电转入对象进行相应变化),以及按中国专利申请cn112175893中实施例4制备的菌株bl21
△
nanatek/pxmj
‑
neubc
‑
glms*
‑
glpx
‑
glna，生产n
‑
乙酰神经氨酸的能力。
84.发酵培养基为m9y
‑
葡萄糖培养基，发酵温度为37℃，通过控制发酵罐的转速和通气量使得发酵过程的溶氧保持在10％以上，用25％的氨水控制ph在7.0。当发酵过程的od
600
达到20～30时加入1mm的iptg进行诱导。当发酵液中的葡萄糖浓度低于5g/l，流加600g/l的葡萄糖控制葡萄糖浓度在5g/l以下。
85.结果显示，发酵72h，bl21
△
nanatek
‑
pykfa/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*的唾液酸产量达到62g/l，而出发菌株bl21
△
nanatek/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*的唾液酸产量仅为48g/l，bl21
△
pykfa不产生唾液酸、bl21/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*，bl21
△
pykfa/ptrc99a
‑
neubc
‑
glms*以及bl21
△
nanatek/pxmj
‑
neubc
‑
glms*
‑
glpx
‑
glna的唾液酸的产量分别为14g/l,28g/l和54g/l。
86.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。