一种改进的纯化可溶性果蝇trp离子通道蛋白的方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学领域，具体涉及从果蝇头部对trp离子通道蛋白进行体外纯化的方法。
背景技术：
2.瞬时受体电位（transient receptor potential，trp）离子通道超家族是一类在动物体内广泛表达的阳离子通道，参与了细胞内多种信号转导通路，并在生物体感知外部环境的过程中发挥重要作用。由于trp离子通道广泛参与机体生理功能的维持以及疾病病理的进程，因此，对其功能及调控机理的研究具有重要的科学意义和广阔的应用转化前景。
技术实现要素：
3.本发明的目的在于提供一种改进的从果蝇头部纯化可溶性果蝇trp离子通道蛋白的方法。
4.本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：通过培养w[1118]品系的野生型果蝇，借由分离得到的果蝇头部，在含有十二烷基-β-d-麦芽糖苷 （n-dodecyl-β-d-maltoside, ddm）去垢剂的缓冲液中以petm3c载体表达的6xhis-norpa 863-1095蛋白为诱饵，对inad复合物进行亲和纯化，然后用pgex-4t-1载体表达的gst-trp-ct 1260-1275蛋白进行竞争性洗脱，得到可溶性的trp离子通道蛋白，最后使用凝胶层析得到纯的果蝇trp离子通道蛋白。
[0005]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明将使得果蝇trp蛋白可以通过野生型果蝇直接表达，大大降低了使用昆虫细胞纯化蛋白的培养基生产成本和生产难度。
附图说明
[0006]
图1 petm3c载体表达的6xhis-norpa 863-1095蛋白的分子筛层析纯化（a，petm3c norpa 863-1095蛋白分子筛色谱图 b， petm3c norpa 863-1095蛋白sds-page图）；图2 pgex-4t-1载体表达的gst-trp-ct 1260-1275蛋白的分子筛层析纯化（a，gst-trp-ct 1260-1275蛋白分子筛色谱图 b， gst-trp-ct 1260-1275蛋白sds-page图）；图3 果蝇trp离子通道蛋白的亲和层析纯化sds-page图；图4 果蝇trp离子通道蛋白的凝胶层析纯化（a，果蝇trp通道蛋白分子筛色谱图 b， 果蝇trp通道蛋白sds-page图）。
具体实施方式
[0007]
果蝇头部组织裂解1.1组织裂解液(lysis buffer)配方：50mm tris-hcl ph8.0、150mm nacl、1mm dtt、6mm ddm、1
×
cocktail protease inhibitor(roche)；
1.2 取出保存在-80℃的装有果蝇的50ml离心管，液氮速冻10min，剧烈摇晃1min使果蝇头部和身体分离，依次经过20/30/40目的筛网筛选得到果蝇头部，-80℃保存备用；1.3 将0.5g果蝇头放入提前预冷的研钵中，分次倒入液氮，用研杵将果蝇头研磨成粉末状，收集粉末加入10倍体积组织裂解液；1.4 4℃，14000g，离心20min；1.5 收集上清，100000g离心机，4℃，离心60min，收集上清4℃储存备用。
[0008]
2 果蝇trp离子通道蛋白亲和层析2.1 将1ml ni-sephrose excel 树脂加入层析柱中，树脂自然沉降；2.2 10倍体积的ddh20（10ml）冲洗树脂2次，再用10倍体积的binding buffer（10ml）冲洗树脂2次；2.3 将浓度为600
µ
m 6xhis-norpa 863-1095蛋白500
µ
l加入层析柱中，均匀搅拌，每隔10min搅拌一次，结合30min后，打开层析柱底部的出料口，留样（norpa-flow）；2.4 10倍体积的lysis buffer（10ml）冲洗树脂，让lysis buffer自然流穿，此时留样（norpa-wash1），上述步骤重复1次，同时留样（norpa-wash2）；2.5 将100000g离心后去除不溶性细胞碎片的果蝇头部裂解液上清液加入到上述处理过的层析柱中，均匀搅拌，每隔10min搅拌一次，结合30min后将层析柱底部的出料口打开，此时留样（trp head lysis-flow）；2.6 10倍体积的lysis buffer（10ml）冲洗树脂，让lysis buffer自然流穿，此时留样（trp head lysis-wash1），上述步骤重复1次，同时留样（trp head lysis-wash2）；2.7 将浓度为600
µ
m gst-trp-ct 1260-1275蛋白500
µ
l加入层析柱中，均匀搅拌，每隔10min搅拌一次，竞争性结合norpa-inad-plc-trp复合物20min后，打开层析柱底部的出料口，留样（trp head lysis-elution1），此时会有trp（drosophila）离子通道蛋白被竞争性洗脱下来。上述步骤重复一次，同时留样（trp head lysis-elution2），两次洗脱液须经0.22
µ
m滤膜过滤，4℃，14000g，离心10min；2.8 10倍体积的binding buffer（10ml）冲洗树脂，让binding buffer自然流穿，此时留样（trp lysis after elu-wash1），上述步骤重复1次，同时留样（trp lysis after elu-wash2）；2.9 将500
µ
l elution buffer加入层析柱中，充分搅拌，每隔10min搅拌一次，20min后打开层析柱底部的出料口，留样（norpa complex-elution1）。上述步骤重复一次，同时留样（norpa complex-elution2），两次洗脱液为norpa/inad/pkc复合物，两次洗脱液须经0.22
µ
m滤膜过滤，4℃，14000g，离心10min。
[0009]
3 果蝇trp离子通道蛋白凝胶层析过滤3.1 使用superose 6 increase 10/200 gl凝胶层析，开启akta purifier，通过unicorn软件进入操作界面；
3.2 凝胶层析缓冲液配方：50mm tris-hcl ph8.0、150mm nacl、2mm dtt、0.75mm ddm，充分混匀后经0.22
µ
m滤膜过滤；3.3 将a1泵放入凝胶层析缓冲液中，开启程序，平衡1个柱体积，电导和uv变化平稳说明柱子已完成平衡，此时可通过上样环注射上样，上样前用相应体积的凝胶层析缓冲液清洗上样环，注射器上样时注意不要产生气泡；3.4 点击run，选择预先设定好的程序完成果蝇trp离子通道蛋白的分离和收集；3.5 根据蛋白的出峰位置和相应管数，制备蛋白样品，按照比例加入sds loading， 100℃加热10min，14000rpm，离心10min，然后可通过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳判断是否分离纯化出果蝇trp离子通道蛋白。