一种梨蛋白片段PyEDR1-307及其编码序列与应用

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种梨蛋白片段pyedr1-307及其编码序列与应用。

背景技术：

植物病害是植物受生物或非生物胁迫，生理和生化上发生系列病理反应，导致正常生长发育受阻，经济效益受损的现象。生物胁迫病害按病原物分为真菌性、细菌性、病毒性和线虫病害等。为了适应胁迫环境，植物自身形成了一系列的调控机制，当植物受到病原物侵染时，在被侵染部位以局部组织迅速坏死的方式来阻止病害扩散，即发生过敏性反应(hypersensitiveresponse，hr)，并对病原物产生抗性，即为系统获得性抗性。不同植物之间对病害的适应性机制存在相似性，因此，我们可以通过病害应答基因的应用来提高植物的抗病性。例如，arf1(adp-ribosylationfactor1)被鉴定为高尔基体分泌通运输路中囊泡形成的关键分子开关(kahnetal.，thejournalofbiologicalchemistry.1992，267:13039-13046；becketal.，thejournalofcellbiology.2010，194:765–777)，在所有真核生物中，arf1在其功能和序列特征上都是保守的(cevher-keskin，int.j.mol.sci.2013，14:18181-18199)。当植物受到病原物侵染时，arf1表达会显著升高，宿主的arf1会被病原物捕获，并在侵染中发挥作用(wangetal.，cellmicrobiol.2019，21:e13047；donaldsonetal.，naturereviews.molecularcellbiology，2011，12:533–533；d′souza-schoreyetal.，naturereviews.molecularcellbiology，2006，7:347–358.)，但arf1表达升高也会触发植物的抗病反应，在非寄主抗性和r基因介导的系统免疫应答中发挥作用(coemansetal.，molplantpathol.2008，9:25-36；leeetal.，physiol.plant.2003，119，573–581)。所以，这时可以通过与arf1互作，从而赋予或增强植物抗病能力，以达到作物抗病育种目的。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种梨蛋白片段pyedr1-307，并提供上述蛋白片段的编码序列以及上述基因片段在培育抗病品种中的应用。

为了实现本发明的第一目的，本发明提供如下技术方案：

一种梨蛋白片段pyedr1-307，它是具有序列表中seqidno：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或者是将seqidno：2的氨基酸残基序列经过一个或一个以上氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与seqidno：2的氨基酸残基序列相同活性的由seqidno：2衍生的蛋白质。

作为优选，所述的梨蛋白片段pyedr1-307具有序列表中seqidno：2所示的氨基酸序列。

为了实现本发明的第二目的，本发明提供如下技术方案：

一种梨蛋白片段pyedr1-307的编码序列，它是下列核苷酸之一：

(1)序列表中seqidno：1所示的核苷酸序列；

(2)编码序列表中seqidno：2所示的氨基酸序列的多核苷酸；

(3)在高严谨条件下可与序列表中seqidno：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

作为优选，梨蛋白片段pyedr1-307的编码序列是序列表中seqidno：1所示的核苷酸序列；梨蛋白片段pyedr1-307的编码序列含有924bp的核苷酸。

含有上述梨蛋白片段pyedr1-307的表达载体和转基因细胞系也在本发明的保护范围之内，利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体和转基因细胞系。

为了实现本发明的第三目的，本发明提供如下技术方案：

该梨蛋白片段pyedr1-307的编码序列在培育抗病品种中的应用，梨蛋白片段pyedr1-307的编码序列可提高植物的抗病性。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中超量表达的载体，将本发明所提供的梨蛋白片段pyedr1-307编码序列pyedr1-924导入植物细胞，可获得改变植物抗病性的转基因细胞系及转基因植株。使用载体时，其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物或转基因细胞进行筛选，可以对载体进行加工，如加入抗生素标记基因(如潮霉素、卡那霉素或庆大霉素等)，加入抗生素标记基因之后的载体用于转化，可以在转化后的植物培养基中加入抗生素，抑制非转基因细胞系和植株的生长，有助于快速和有效地获得转基因材料。为了便于观察外源基因的表达，可以在载体中启动子和外源基因之间或是外源基因与终止子之间加入报告基因(gus基因、gfp或萤火虫荧光素报告基因)，构建外源基因和报告基因融合表达的载体，该载体用于遗传转化，可以通过观察报告基因的表达与否和表达量高低，推测外源基因在植物体内的表达情况。为了转基因植物释放的安全性，也可以在构建载体时不携带任何筛选标记基因或非抗生素筛选标记基因，直接通过pcr鉴定或表型筛选鉴定。含有本发明的pyedr1-924片段的表达载体可通过使用基因枪、农杆菌介导、发粉管通道、电击、显微注射、ti质粒、ri质粒或植物病毒等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化后的植物细胞培育成完整的植株。被转化的植株既可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物，如：水稻、棉花、小麦、大豆、油菜、烟草、拟南芥、大麦、高粱、玉米、黄瓜、番茄、白菜、萝卜、杨树、草坪草、苜蓿、药材和花卉等。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

通过基因工程的方法将本发明提供的梨蛋白片段pyedr1-307转入植物中，可以提高植物的抗病性。由于该基因是果树作物梨本身存在的内源基因，因此，该基因的超量表达不会影响植物的食品安全性，可广泛应用于各种植物的育种应用和抗病性改良。

附图说明

图1为接种20天后转基因株系与对照‘中花11’病斑长度症状图。

图2为接种20天时转基因株系与野生型对照‘中花11’病斑长度统计柱形图，其中**代表极显著差异(p<0.01)。

图3pyedr1-307与pyarf1共转化烟草叶片72小时试验结果图；

其中a中白色箭头：pyedr1-307与pyarf1共转化烟草叶片72小时引起的坏死斑；黑色箭头：pyedr1-307单独接种烟草叶片72小时，无坏死斑；

b中黑色箭头：pyarf1单独接种烟草叶片72小时，无坏死斑。

图4pyedr1-307与pyarf1共转化烟草叶片24小时与72的亚细胞定位与细胞膜崩溃试验结果图。

图5pyedr1与pyarf1酵母蛋白互作分析；

a,pbt3-n-pyedr1/ppr3-n；b,pbt3-n-pyedr1/ppr3-n-post-nubal；

c,pbt3-n-pyedr1/ppr3-n-pyarf1；g,ptsu2-app/pnubg-fe65(阳性对照)；h,pbt3-suc/ppr3-n(阴性对照)。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：梨蛋白片段pyedr1-307编码序列的获得。

以砂梨(pyruspyrifolia)品种翠冠(cuiguan)为材料，在开花后80天取700mg果皮，参照梨公布的基因组序列，用macvector软件设计引物p1，

p1引物如下：f-5’-atgtgtccaacaaagcaaaagc’(seqidno:3)；

r-5’-tcaatcgtcgtcgtcgtcgtcg-3’(seqidno:4)。

用英俊公司的planttrizol试剂盒提取以砂梨(pyruspyrifolia)品种翠冠(cuiguan)开花后80天果皮为材料的总rna，用甲醛变性胶电泳鉴定总rna质量，然后在分光光度计上测定rna含量。采用promega的反转录试剂盒进行反转录，合成单链cdna为模板，用引物p1扩增目标片段。pcr反应体系为25μl，包含5ng模板，f和r引物各5pmol、2.5μl10xpcrbuffer、37.3nmolmgcl2、5nmoldntp、0.5u的rtaq聚合酶。扩增程序为：94℃预变性3min，94℃20s，60℃30s，72℃延伸60s，30个循环后，72℃反应5min。通过pcr扩增，获得912bp的核苷酸序列，将pcr产物克隆至pmd18-t载体，测序获得的核苷酸序列如seqidno:6所示。该核苷酸序列编码307个氨基酸，该氨基酸序列如seqidno:2所示。

实施例2：梨蛋白片段pyedr1-307的获得。

将梨蛋白片段pyedr1-307的编码序列pyedr1-924克隆到表达载体pet-32a的ecori和bamhi酶切位点中，转化e.coli。挑取单菌落于1ml的lb(amp100μg/ml)中摇菌过夜，转至200ml新鲜的lb培养基中摇至菌液浓度a600≈0.6；加入iptg至终浓度为1.0mm，37℃培养诱导表达3小时。菌液12,000g离心5min，沉淀悬浮于提取缓冲液中(3mnacl、1mmpmsf、50mmph8.0磷酸缓冲液)超声破碎细胞，12,000g离心20min，收集上清。用10mm咪唑、50mmph8.0磷酸缓冲液平衡ni-sepharose凝胶；加入细胞裂解液室温结合20min、用5倍凝胶体积的平衡缓冲液洗涤3次；然后用含300mm咪唑、50mmph8.0磷酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液即为纯化后的trx-pyedr1-307蛋白。纯化后的表达蛋白经透析除盐后按每毫克蛋白样品加入0.1mg肠激酶，于40mm的琥珀酸缓冲液(ph＝5.6)中25℃温育2小时切去组氨酸标签，透析过夜即得到纯化的梨蛋白pyedr1的蛋白质片段pyedr1-307。

实施例3：梨蛋白片段pyedr1-307的编码序列的应用。

以翠冠果皮的总cdna为模板，用引物p2进行pcr扩增。

p2引物对如下：f-5’-cagctctagaatgtgtccaacaaagcaaaagc-3’(seqidno:5)；r-5’-gaagggatcctcaatcgtcgtcgtcgtcgtcg-3’(seqidno:6)。

将扩增得到的pcr产物用限制性内切酶xbai和bamhi进行酶切后，与经过同样限制性内切酶进行酶切的双元表达载体pbi121进行连接，获得由camv35s启动子启动的pyedr1基因片段pyedr1-924超量表达载体。用冻融法将获得的表达载体转入农杆菌菌株lba4404，通过含有50μg/ml的卡那霉素和50μg/ml利福平的lb培养基进行筛选，获得阳性克隆。原生质体的制备与转化参照wang等(bio-protocol，2013，3(22):e979)，将携带有pyedr1基因片段pyedr1-924超量表达载体通过农杆菌转化到‘中花11’粳稻品种，我们首先提取基因组dna，用与扩增pyedr1-924基因片段相同的引物和pcr程序进行pcr鉴定。对于pcr阳性的转基因植株，提取总rna，经过dnasei处理后，进行反转录合成cdna第一链，以cdna第一链为模板，用与检测dna相同的pcr引物和程序进行转录水平的鉴定。自交繁殖后，将t3代转基因材料和非转基因对照材料种子播种在装有营养土的生长箱中，于正常生长季节自然条件生长，结合日常病虫害防治和肥水管理。

水稻白叶枯病菌培养及接种操作参照郑凯丽等(《作物学报》2020，46(9):1332-1339)，采用浙江省优势菌株zhe160对在水稻成株期用剪刀蘸取菌液进行剪叶接种，在接种20天量取病斑长度，每个株系测量10株，每株选择3片叶进行测量，选取平均值，并进行方差分析和多重比较。同时接种中花11野生型做对照。接种20d后再次测量病斑长度，野生型ir24的平均病斑长度延伸到18cm左右，生长受到抑制；转基因株系的病斑长度在1.5～3.2cm(如图1和图2所示)。

鉴定结果表明，在白叶枯病发生前期和后期，转基因植株与野生型中花11相比病斑长度均明显缩短，方差分析达到了极显著，pyedr1转基因水稻白叶枯病的抗性明显提高。

实施例4：蛋白片段pyedr1-307的编码序列与蛋白片段pyarf1的编码序列共转化分析。

本实施例中，将上述实施例蛋白片段pyedr1-307的编码序列构建瞬时表达载体，将蛋白片段pyarf1的编码核苷酸序列构建瞬时表达载体，对烟草叶子共转化农杆菌浸染试验，同时做独立转化对照。实验中的pyarf1序列信息(loc10396396)来自公共数据库，共用共知，pyarf1序列以梨发育80天果皮总cdna为模板，通过pcr扩增获得；

图3为实施例4涉及的pyedr1-307编码序列与pyarf1编码序列瞬时表达载体共转化烟草叶片72小时试验结果图；

a中白色箭头：pyedr1-307与pyarf1共转化烟草叶片72小时引起的坏死斑；黑色箭头：pyedr1-307单独接种烟草叶片72小时，无坏死斑；

b中黑色箭头：pyarf1单独接种烟草叶片72小时，无坏死斑。

图4为实施例4涉及的pyedr1-307与pyarf1在烟草叶片细胞中的共定位试验结果图；实验中pyedr1-307、pyarf1分别与绿色荧光蛋白gfp和红色荧光蛋白mcherry融合。

如图3所示，经过浸染试验，相对独立转化对照来说，浸染后，pyedr1-307与pyarf1共转化造成了烟草叶片坏死。

如图4所示，pyedr1-307与pyarf1共表达的烟草叶片细胞视野中，pyedr1-307与pyarf1表现出共定位特征，主要存在于细胞膜上，在侵染72小时处，定位于细胞膜的pyedr1-307-gfp融合蛋白与pyarf1-mcherry融合蛋白伴随细胞膜破裂而弥散分解(图2中，24h处gfp荧光位置/mcherry荧光位置即为细胞膜位置，gfp荧光信号即pyedr1-307的定位信息，mcherry荧光信号即为pyarf1的定位信息；bright，白光下的细胞图像；a与c叠加后的重叠吻合情况即可说明pyedr1-307-gfp定位于细胞膜，b与c叠加后的重叠吻合情况即可说明pyarf1-mcherry定位于细胞膜，且伴随细胞膜破裂而弥散分解)，说明pyedr1-307与pyarf1共表达可启动细胞死亡。

实施例5：蛋白片段pyedr1-307与pyarf1互作分析。

图5为实施例5涉及的pyedr1-307与pyarf1的酵母双杂交蛋白互作验证，a,pbt3-n-pyedr1/ppr3-n；b,pbt3-n-pyedr1/ppr3-n-post-nubal；

c,pbt3-n-pyedr1/ppr3-n-pyarf1；g,ptsu2-app/pnubg-fe65(阳性对照)；h,pbt3-suc/ppr3-n(阴性对照)。

构建pyedr1-307诱饵质粒、pyafr1猎物重组质粒，对构建的诱饵质粒和猎物质粒大量抽提并进行琼脂糖凝胶电泳检测。将获得的诱饵质粒进行毒性检测及自激活检测，将诱饵质粒和猎物空载共转化nmy51感受态，涂布ddo平板能生长说明重组诱饵质粒成功转入宿主菌且对宿主菌无毒性，涂布qdo不能生长，说明诱饵蛋白不能激活报告基因表达。将诱饵质粒和质粒post-nubai共转化nmy51感受态，涂布平板ddo能生长，共转化成功，涂布qdo菌落生长，说明激活了报告基因his，ade2，说明bait构建的读码框正确，ubiquitin实验系统可行驶功能。将猎物质粒与诱饵质粒共转化酵母细胞，对照和功能验证结果符合预期，说明该系统可用于双杂交验证；猎物质粒与诱饵质粒转化的宿主菌，涂布ddo、qdo均能生长，说明涂布sd-tlha能生长，说明二者之间存在相互作用(如图5所示)。

本实施例说明，具有氨基酸序列seqidno：2的蛋白片段可能会通过与pyarf1之间存在着的互作，启动植物体抗病免疫应答，启动细胞死亡。

sequencelisting

<110>浙江省农业科学院

<120>一种梨蛋白片段pyedr1-307及其编码序列与应用

<130>2021.03.26

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>924

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgtgtccaacaaagcaaaagcaccggagctccgtcgccgaccacgccggaaaatgctcc60

aaatcggaggattctacaacctccaccgccgactggatctccgagtccgtccacggcgga120

tccttgcgccacgtggacctcaccaccggaaccaacggctgggcgtcccctcccggcgac180

ctattctccctccgcaccaagaaatacttgtcgaataaacaaaaaggccccgccggcgac240

tacctactccagccgtgcggcaccgactggctcagatccagcacgaaactcgataacgta300

ctcgcccgccccgataatcgcgtggccaacgcgctgcggaaggctcagtcccaagggaag360

tcgatgaagagcttcatttttgccgtgaatctccagattcccggcaaggaccagcacagc420

gcggttttctacttcgcggcggaggatccaatccccgccgggtctctcctttaccggttc480

atccacggcgacgacgcgttccggaatcagcggttcaagattgtgaaccggatcgtgaag540

gggccgtggatcgtcgtgaagacggtggggaattacagtgcgtgtttgctggggaaggcg600

ctgacgtgtaattaccacagaggacccaactacctggagattgacgtcgatatcgcgagc660

tcggggatcgcgaaggccattttgcgactcgcattgaggtacgtgacgagcgtgacgata720

gacatggggttcgttgtggaggcgcaggcggaggatgagctccctgagaagttagtcggc780

gcggttagggtatgccagatggagatgtcgtcggcgacggtcgtggacgcgctgcagacg840

acgatcgtagcgcgtggattgagttttgcgtcgaaggtgaatcatcataagtccggcgac900

gacgacgacgacgacgacgattga924

<210>2

<211>307

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

metcysprothrlysglnlyshisargserservalalaasphisala

151015

glylyscysserlyssergluaspserthrthrserthralaasptrp

202530

ilesergluservalhisglyglyserleuarghisvalaspleuthr

354045

thrglythrasnglytrpalaserproproglyaspleupheserleu

505560

argthrlyslystyrleuserasnlysglnlysglyproalaglyasp

65707580

tyrleuleuglnprocysglythrasptrpleuargserserthrlys

859095

leuaspasnvalleualaargproaspasnargvalalaasnalaleu

100105110

arglysalaglnserglnglylyssermetlysserpheilepheala

115120125

valasnleuglnileproglylysaspglnhisseralavalphetyr

130135140

phealaalagluaspproileproalaglyserleuleutyrargphe

145150155160

ilehisglyaspaspalapheargasnglnargphelysilevalasn

165170175

argilevallysglyprotrpilevalvallysthrvalglyasntyr

180185190

seralacysleuleuglylysalaleuthrcysasntyrhisarggly

195200205

proasntyrleugluileaspvalaspilealaserserglyileala

210215220

lysalaileleuargleualaleuargtyrvalthrservalthrile

225230235240

aspmetglyphevalvalglualaglnalagluaspgluleuproglu

245250255

lysleuvalglyalavalargvalcysglnmetglumetserserala

260265270

thrvalvalaspalaleuglnthrthrilevalalaargglyleuser

275280285

phealaserlysvalasnhishislysserglyaspaspaspaspasp

290295300

aspaspasp

305

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<213>人工序列

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