一种EGFP与Fiber-2融合表达的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法

本发明涉及一种egfp与fiber-2融合表达的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法，属于基因工程技术领域。

背景技术：

禽腺病毒(fowladenovirus，fadv)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5个种(a-e)，12个血清型。虽然在世界各地均有报道，fadv感染一般引起亚临床状况，而急性感染主要引起包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等。自2013年，国内鸡群由fadv引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。到2015年，fadv感染在国内多个省份鸡群爆发。目前fadv爆发不仅发生在3-4周龄肉鸡，还发生于10-20周龄的蛋鸡，给国内养鸡业造成了严重经济损失。病毒分离鉴定发现，目前高致病性4型fadv在国内鸡群流行较广泛。然目前尚无fadv-4的疫苗。腺病毒作为开发多价苗的病毒载体在许多文献中也有报道，因此，本发明利用血清4型禽腺病毒作为载体插入外源基因egfp，成功获得了表达egfp的重组fadv4病毒，在体内及体外实验结果均显示，fadv4-egfp重组病毒毒力显著降低，由此可见，egfp的插入位置可以作为插入其他病原的保护性抗原插入位点，从而构建多价苗。本发明为构建fadv-4重组多价苗提供了坚实的理论基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述问题，提供一种egfp与fiber-2融合表达的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法，可供插入其他病原保护性抗原的位点。本发明的原理和最核心的关键技术是选择合适插入位点以及sgrna。插入rfp后进行病毒的纯化，获得可以稳定扩增的重组禽腺病毒。。

本发明的目的是这样实现的，一种egfp与fiber-2融合表达的重组血清4型禽腺病毒，其特征在于，其载体为野生型血清4型禽腺病毒sd株；重组血清4型禽腺病毒的外源基因为增强型绿色荧光蛋白egfp，在激发光的照射下可以发出绿色荧光，可以作为插入位点的荧光标签分子，其序列如seqidno.1所示；

seqidno.1为：

atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa；

所述重组血清4型禽腺病毒，其中egfp插入的位置落在fiber2基因的前面，最终使得egfp与f2蛋白融合表达，fiber2的序列如seqidno.2所示；

seqidno.2为：

atgctccgggcccctaaaagaagacattccgaaaacgggaagcccgagaccgaagcgggaccttccccggctccaatcaagcgcgccaaacgcatggtgagagcatcccagcttgacctggtttatcctttcgattacgtggccgaccccgtcggagggctcaacccgccttttttgggaggctcaggacccctagtggaccagggcggacagcttacgctcaacgtcaccgatcccatcatcatcaagaacagatcggtggacttggcccacgaccccagtctcgatgtcaacgcccaaggtcaactggcggtggccgttgaccccgaaggggccctggacatcacccccgatggactggacgtcaaggtcgacggagtgaccgtaatggtcaacgatgactgggaactggccgtaaaagtcgacccgtccggcggattggattccaccgcgggtggactgggggtcagcgtggacgacaccttgctcgtggatcagggagaactgggcgtacacctcaaccaacaaggacccatcactgccgatagcagtggtatcgacctcgagatcaatcctaacatgttcacggtcaacacctcgaccggaagcggagtgctggaactcaacctaaaagcgcagggaggcatccaagccgacagttcgggagtgggcgtttccgtggatgaaagcctacagattgtcaacaacactctggaagtgaaaccggatcccagcggaccgcttacggtctccgccaatggcctagggctgaagtacgacactaataccctagcggtgaccgcgggcgctttaaccgtggtcggaggggggagcgtctccacacccatcgctacttttgtctcgggaagtcccagcctcaacacctacaatgccacgaccgtcaattccagcgcgaacgccttctcttgcgcctactaccttcaacagtggaacatacaggggctccttgttacctccctctacttgaaattggacagcgccaccatggggaatcgccctggggacctcaactccgccaatgccaaatggttcaccttttgggtgtccgcctatctccagcaatgcaacccctccgggattcaagcgggaacggtcagcccctccaccgccaccctcacggactttgaacccatggccaataggagcgtgaccagcccatggacgtactcggccaatggatactatgaaccatccatcggggaattccaagtgttcagcccggtggtaacaggtgcctggaacccgggaaacatagggatccgcgtcctccccgtgccggtttcggcctccggagagcgatacacccttctatgctatagtctgcagtgcacgaacgcgagcatttttaatccaaacaacagcggaaccatgatcgtgggacccgtgctctacagctgtccagcggcctccctcccgtaa。

一种egfp与fiber-2融合表达的重组血清4型禽腺病毒的制备方法，制备方法包括如下步骤：

(1)利用sgrna在线设计网站设计针对fiber2基因上下游位置的sgrna，选择分数较高排名靠前的sgrna，其序列如表1所示；

(2)通过overlap-pcr构建带有标签分子egfp的fiber2供体质粒，overlap-pcr使用的引物序列如表2所示；

(3)在转染的前一天铺lmh细胞，次日转染两条sgrna和供体质粒各2ug，转染6h后换成10％生长液；

(4)转染48h后感染fadv4，2h后换成1％维持液；

(5)感染fadv4后每天观察荧光，挑取荧光斑，利用空斑实验和有限稀释法，通过筛选绿色荧光的方法进行纯化，获得表达egfp的fadv4重组病毒。

所述lmh细胞系为鸡肝癌细胞。

通过本发明，本发明所述的一种egfp与fiber-2融合表达的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法，利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体插入外源基因egfp，成功获得了表达egfp的重组fadv4病毒，在体内及体外实验结果均显示，fadv4-egfp重组病毒毒力显著降低，由此可见，egfp的插入位置可以作为插入其他病原的保护性抗原插入位点，为构建fadv-4重组多价苗提供了坚实的理论依据。

附图说明

图1为本发明的构建流程图。

图2为pcr扩增egfp基因和同源臂的电泳图；

泳道m：superdnamarker；泳道1：右同源臂和f2；泳道2：左同源臂；泳道3：egfp基因。

图3为overlappcr构建供体质粒的电泳图。

图4为拯救重组病毒p0代荧光图。

图5为纯化后的重组fadv4-egfp病毒感染lmh细胞的荧光图。

图6为pcr鉴定纯化前后的重组fadv4-egfp病毒；

泳道m：superdnamarker；泳道1：未纯化的重组fadv4-egfp病毒；泳道2：纯化后重组fadv4-egfp病毒；泳道3：野生型fadv-4病毒基因组。

图7为fadv4-egfp重组病毒生长曲线图。

图8为spf鸡群感染fadv4-egfp重组病毒和fadv-4病毒后的生存曲线图。

图9为spf鸡群感染病毒后的排毒情况。

图10为存活的鸡群攻毒fadv-4后的生存曲线图。

具体实施方式

实施例：

1,禽腺病毒分离:取疑似禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后用按1:5的比例加入pbs制成悬液；5000r/min离心15min，取上清；加入青霉素和链霉素各1000iu/ml，37℃反应30min；经0.45um微孔滤器过滤后，以0.2ml/胚的剂量，经尿囊腔接种8日龄spf鸡胚，接种后96-120小时后收取尿囊液；尿囊液经鉴定为禽腺病毒后，－20℃保存。

2，禽腺病毒基因组的制备：取禽腺病毒分离毒株病毒上清400ul于1.5ml指形管内，加入400ul细胞裂解液(50mmol/ltris-hclph8.0，20mmol/ledtaph8.0，2％sds和蛋白酶k)，充分混匀后放置56℃水浴锅作用4小时；加入400ultris平衡酚，充分混匀后10000r/min离心10分钟，取上清于另一1.5ml指形管；加入400ul酚：氯仿：异戊醇，充分混匀后10000r/min离心5分钟，取上清于另一1.5ml指形管；加入800ul无水乙醇，颠倒混匀后放入-20℃孵育30分钟，12000r/min离心15分钟，弃尽上清；室温自然干燥后向沉淀加入30ul灭菌超纯水和2ulrna酶，充分溶解后，即得血清4型禽腺病毒基因组，置-20℃备用。

3，根据fiber2的基因，利用sgrna在线设计网站(http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp和http://crispr.mit.edu)进行sgrna序列设计。将设计好的sgrna分别克隆到lenticrisprv2质粒，并通过测序验证构建成功：具体sgrna序列见表1，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

表1.针对fiber2基因上下游位置的sgrna序列

4,egfp-fiber2供体质粒的构建：以pcdna3.1-egfp质粒为模板扩增egfp基因(如图1)；以禽腺病毒基因组为模板扩增左端同源臂hr1，fiber2和右端同源臂hr2(如图1)，同源臂的长度为1kb。电泳后进行胶回收，通过overlap-pcr按照hr1-egfp-f2-hr2的顺序进行组装，最终获得重组病毒的供体质粒(如图2)。构建供体质粒所用的引物序列见表2。

表2.构建供体质粒所用的pcr序列

5，重组fadv4-egfp病毒的拯救：转染前一天在6孔板中铺lmh细胞，每孔120-150w细胞；次日细胞密度生长至80％左右准备转染，2条sgrna和供体质粒各2ug，利用2ul转染试剂mirus与1ug质粒2：1的比例进行室温孵育45min，孵育结束后将转染试剂和质粒混合物滴加到预先用opti-mem覆盖的细胞中转染，转染6h后换成10％生长液。转染48h后，弃去生长液，用0.1moi的fadv-4感染lmh细胞，感染2h后弃去病毒，换成1％维持液。感染病毒后，每天用荧光显微镜观察细胞中是否出现荧光斑(如图4)。

6，重组fadv4-egfp病毒的纯化及鉴定：将拯救的重组fadv4-egfp病毒进行挑取荧光斑，利用空斑纯化技术和有限稀释法进行纯化，最终获得纯化的重组fadv4-egfp病毒(如图5)，通过针对插入位点上下游附近的引物进行pcr鉴定(如图6)，pcr所用的引物见表3。

表3.pcr扩增鉴定重组病毒的引物

7,重组fadv4-egfp病毒体外生长曲线的绘制：在铺有lmh细胞的6孔板中分别接种拯救的重组fadv4-egfp和野生型fadv-4，接种量为0.1moi，接种后分别在24h、48h、72h、96h和120h时间点收取病毒上清，之后进行tcid50测定上清中的病毒滴度(如图7)。结果显示重组病毒fadv4-egfp与fadv-4相比，两个病毒的复制曲线相似，但是重组病毒复制速度较慢，且最高滴度明显比fadv-4低。

8，重组fadv4-egfp病毒体内致病性的评估：将120只2周龄的spf鸡随机分为3组，即fadv4-egfp组、fadv-4组和对照组，之后分别用10⁶tcid50剂量的重组病毒fadv4-egfp和fadv-4接种鸡群，对照组注射相同体积的1％细胞维持液。感染病毒后，每天观察鸡群的生长状况，并记录发病及死亡情况。14d后绘制成存活曲线(如图8)，每天的观察中发现，感染野生型fadv-4病毒的鸡群，在感染后第一天便出现嗜睡、精神沉郁、翅膀下垂等症状；感染后的第二天便观察到有少量spf鸡死亡，鸡群发病死亡主要集中在感染后的第三天，并且在感染后的第四天全部死亡。相比之下，fadv4-egfp病毒感染的鸡群和对照鸡群则全部存活。在感染病毒后的第二、三、四天，分别剖杀每组鸡群格3只，解剖发现，感染野生型fadv-4的鸡群出现典型的肝炎-心包积液综合症；而感染fadv4-egfp的鸡群和对照组鸡群则完全没有症状。对解剖的鸡群进行病理学观察，发现感染fadv-4的鸡群肝脏出现典型的核内包涵体；而感染fadv4-egfp的鸡群和对照组鸡群肝脏则完全正常。对3组鸡群进行扛拭子检测(如图9)，发现感染fadv-4病毒的鸡群大量排毒，而感染fadv4-egfp病毒的鸡群只有在感染后的第二天检测到少量的排毒，其他时间点全部没有检测到排毒。以上结果说明，本发明中构建的重组病毒fadv4-egfp毒力相比于野生型fadv-4被明显致弱。

9，fadv4-egfp重组病毒攻毒保护试验：感染fadv4-egfp重组病毒的鸡群和对照组鸡群在21天后仍然全部存活，随即对存活的鸡群进行攻毒保护实验，两组鸡群均攻毒10⁶tcid50剂量的fadv-4。攻毒后，每天观察鸡群的生长状况，并记录发病及死亡情况。14d后绘制成存活曲线(如图10)，结果显示，对照组鸡群在攻毒fadv-4后，6d内死亡率达到80％；相比之下，感染fadv4-egfp重组病毒的鸡群在攻毒后死亡率为0。说明本发明构建的fadv4-egfp重组病毒可以为鸡群提供完全保护，提示插入egfp的位置可以作为外源基因的插入位点。

seqidno.1

增强型绿色荧光蛋白(egfp)基因序列：

atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa

seqidno.2

血清4型禽腺病毒fiber2基因序列：

atgctccgggcccctaaaagaagacattccgaaaacgggaagcccgagaccgaagcgggaccttccccggctccaatcaagcgcgccaaacgcatggtgagagcatcccagcttgacctggtttatcctttcgattacgtggccgaccccgtcggagggctcaacccgccttttttgggaggctcaggacccctagtggaccagggcggacagcttacgctcaacgtcaccgatcccatcatcatcaagaacagatcggtggacttggcccacgaccccagtctcgatgtcaacgcccaaggtcaactggcggtggccgttgaccccgaaggggccctggacatcacccccgatggactggacgtcaaggtcgacggagtgaccgtaatggtcaacgatgactgggaactggccgtaaaagtcgacccgtccggcggattggattccaccgcgggtggactgggggtcagcgtggacgacaccttgctcgtggatcagggagaactgggcgtacacctcaaccaacaaggacccatcactgccgatagcagtggtatcgacctcgagatcaatcctaacatgttcacggtcaacacctcgaccggaagcggagtgctggaactcaacctaaaagcgcagggaggcatccaagccgacagttcgggagtgggcgtttccgtggatgaaagcctacagattgtcaacaacactctggaagtgaaaccggatcccagcggaccgcttacggtctccgccaatggcctagggctgaagtacgacactaataccctagcggtgaccgcgggcgctttaaccgtggtcggaggggggagcgtctccacacccatcgctacttttgtctcgggaagtcccagcctcaacacctacaatgccacgaccgtcaattccagcgcgaacgccttctcttgcgcctactaccttcaacagtggaacatacaggggctccttgttacctccctctacttgaaattggacagcgccaccatggggaatcgccctggggacctcaactccgccaatgccaaatggttcaccttttgggtgtccgcctatctccagcaatgcaacccctccgggattcaagcgggaacggtcagcccctccaccgccaccctcacggactttgaacccatggccaataggagcgtgaccagcccatggacgtactcggccaatggatactatgaaccatccatcggggaattccaagtgttcagcccggtggtaacaggtgcctggaacccgggaaacatagggatccgcgtcctccccgtgccggtttcggcctccggagagcgatacacccttctatgctatagtctgcagtgcacgaacgcgagcatttttaatccaaacaacagcggaaccatgatcgtgggacccgtgctctacagctgtccagcggcctccctcccgtaa

序列表

<110>扬州大学

<120>一种egfp与fiber-2融合表达的的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法

<160>18

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>720

<212>dna

<213>维多利亚水母(aequoreavictoria)

<400>1

atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggac60

ggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctac120

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gtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcac420

aagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaac480

ggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgcc540

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<210>2

<211>1440

<212>dna

<213>鸡(chicken)

<400>2

atgctccgggcccctaaaagaagacattccgaaaacgggaagcccgagaccgaagcggga60

ccttccccggctccaatcaagcgcgccaaacgcatggtgagagcatcccagcttgacctg120

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gtcgacccgtccggcggattggattccaccgcgggtggactgggggtcagcgtggacgac480

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actaataccctagcggtgaccgcgggcgctttaaccgtggtcggaggggggagcgtctcc840

acacccatcgctacttttgtctcgggaagtcccagcctcaacacctacaatgccacgacc900

gtcaattccagcgcgaacgccttctcttgcgcctactaccttcaacagtggaacatacag960

gggctccttgttacctccctctacttgaaattggacagcgccaccatggggaatcgccct1020

ggggacctcaactccgccaatgccaaatggttcaccttttgggtgtccgcctatctccag1080

caatgcaacccctccgggattcaagcgggaacggtcagcccctccaccgccaccctcacg1140

gactttgaacccatggccaataggagcgtgaccagcccatggacgtactcggccaatgga1200

tactatgaaccatccatcggggaattccaagtgttcagcccggtggtaacaggtgcctgg1260

aacccgggaaacatagggatccgcgtcctccccgtgccggtttcggcctccggagagcga1320

tacacccttctatgctatagtctgcagtgcacgaacgcgagcatttttaatccaaacaac1380

agcggaaccatgatcgtgggacccgtgctctacagctgtccagcggcctccctcccgtaa1440

<210>3

<211>25

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

caccgggtttatcctttcgattacg25

<210>4

<211>25

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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<210>5

<211>25

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

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<210>10

<211>25

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

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<210>11

<211>49

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

gtctactcccccaacgggaacaatggtgagcaagggcgaggagctgttc49

<210>12

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

cttcttttaggggcccggagcttgtacagctcgtccatg39

<210>13

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

ggtgacctactgaccctcaacacc24

<210>14

<211>49

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

gaacagctcctcgcccttgctcaccattgttcccgttgggggagtagac49

<210>15

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

catggacgagctgtacaagctccgggcccctaaaagaag39

<210>16

<211>23

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

ctactttacctgcatttcgtcag23

<210>17

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

ctccaactggtttgaccagaacg23

<210>18

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

gacggggtcggccacgtaatcgaaagg27