含有丁苯羟酸的猪卵母细胞体外成熟体系及应用的制作方法

【技术领域】

本发明涉及卵母细胞体外成熟培养技术领域，具体涉及含有丁苯羟酸的猪卵母细胞体外成熟体系及应用。

背景技术：

由于猪的生物学特性和遗传特性与人类具有相当高的同源性，被认为是人体异种器官来源的首选动物，因此猪在生物医学研究中是重要的模式动物。体外培养技术和当今飞速发展的基因编辑技术的有效结合，不仅促进了胚胎工程的发展及应用，而且带动了医学领域的发展。卵母细胞体外成熟(ivm)作为胚胎工程的关键环节，在家畜良种繁育、资源保护及生物学研究中具有重要应用价值。然而卵母细胞成熟仍面临效率低、质量差等问题。因此猪卵母体外成熟一直是研究卵母细胞体外培养、体外受精和胚胎发育等关键步骤，也一直是研究热点和难点。所以深入探索卵母细胞的成熟规律，改善卵母细胞体外成熟的培养环境，建立一种完善的卵母细胞体外成熟体系，是当前胚胎工程研究的重要内容之一。

研究发现，依赖于减数分裂阶段的组蛋白动态变化对卵子生长发育至关重要。组蛋白修饰的破坏将导致染色质缺陷和卵子成熟延迟，最终引起卵母细胞衰老。因此可以通过去乙酰化途径缓解卵母细胞衰老相关的减数分裂缺陷。大量研究表明，组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以通过参与调控基因转录对哺乳动物卵母细胞成熟及早期胚胎发育产生作用。

高海霞，丙戊酸对牛胎儿成纤维细胞生长、牛卵母细胞成熟及早期胚胎发育的影响，呼和浩特：内蒙古大学，2012，探讨了vpa处理牛胎儿成纤维细胞后对细胞生长及细胞周期的影响，提到了丙戊酸(valproicacid，vpa)作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，能特异性抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，提高细胞内组蛋白乙酰化水平，激活基因的表达，但vpa对体细胞生长、卵母细胞成熟以及胚胎发育的作用机制还不清楚。

目前，已有丙戊酸等对组蛋白去乙酰化酶的特异性抑制剂的研究，研究了组蛋白去乙酰化酶的特异性抑制剂在猪卵母细胞成熟过程中对hdac6具有特异性的抑制作用，可以显著改善组蛋白乙酰化水平。丁苯羟酸(bufexamac)，是一种非甾体消炎镇痛药，其消炎、镇痛疗效与保泰松相似，适用于类风湿性关节炎及髋关节炎等，有研究表明丁苯羟酸是iib型组蛋白去乙酰化酶的特异性抑制剂，是hdac6和hdac10这两种组蛋白去乙酰化酶的特异性抑制剂，提高组蛋白乙酰化水平，且其毒性和副作用较小。然而，以上这些研究只是一些机制研究以及细胞中的研究状况，对于能否促进减数分裂，提高卵母细胞发育效率，降低卵母细胞体外发育的凋亡率，并用于体外发育胚胎方面的应用尚无报道。

因此，研究新的猪卵母细胞体外成熟体系很有必要。

技术实现要素：

针对现有技术中猪卵母细胞体外成熟培养液的卵母细胞体外发育的凋亡率指标不理想，本发明提供了含有丁苯羟酸的猪卵母细胞体外成熟体系及应用，所述的培养液由基础培养液tcm-199、半胱氨酸、青霉素、链霉素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、胎牛血清、猪卵泡液、nahco3、孕马血清促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素和丁苯羟酸(bufexamac)组成，可以降低卵母细胞体外发育的凋亡率；提高第一极体排出率、孤雌胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数、体外受精胚胎卵裂率、囊胚率以及囊胚总细胞数。

本发明所述的含有丁苯羟酸的猪卵母细胞体外成熟体系，包括卵母细胞的成熟培养液和胚胎培养液：

卵母细胞的成熟培养液：80％体积的tcm199、10％体积的猪卵泡液、10％体积的胎牛血清、0.1g/l半胱氨酸、0.075g/l青霉素、0.05g/l链霉素、10ng/ml胰岛素样生长因子、50ng/ml表皮生长因子、2.2g/lnahco3、10iu/ml孕马血清促性腺激素、10iu/ml人绒毛膜促性腺激素、10-30μmol/l丁苯羟酸；电激活液的主要成分为：0.3mmol/l甘露醇、0.1mmol/lcacl2·h2o、0.1mmol/lmgso4·7h2o、0.5mmol/lhepes、0.01％(w/v)聚乙烯醇(pva)；

胚胎培养液：6.31g/lnacl、0.74g/lkcl、0.047g/lkh2po4、2.1g/lnahco3、0.022g/l丙酮酸钠、0.62g/l乳酸钙、0.15g/ll-谷氨酰胺、0.55g/l亚牛磺酸、20ml/l必需氨基酸、10ml/l非必需氨基酸、0.065g/l青霉素、0.05g/l链霉素、4g/l牛血清蛋白(bsa)。

含有丁苯羟酸的猪卵母细胞体外成熟体系的应用，包括如下步骤：

1)准备卵母细胞的成熟培养液：80％体积的tcm199、10％体积的猪卵泡液、10％体积的胎牛血清、0.1g/l半胱氨酸、0.075g/l青霉素、0.05g/l链霉素、10ng/ml胰岛素样生长因子、50ng/ml表皮生长因子、2.2g/lnahco3、10iu/ml孕马血清促性腺激素、10iu/ml人绒毛膜促性腺激素、20μmol/l丁苯羟酸；电激活液的主要成分为：0.3mmol/l甘露醇、0.1mmol/lcacl2·h2o、0.1mmol/lmgso4·7h2o、0.5mmol/lhepes、0.01％(w/v)聚乙烯醇(pva)；

2)准备胚胎培养液：6.31g/lnacl、0.74g/lkcl、0.047g/lkh2po4、2.1g/lnahco3、0.022g/l丙酮酸钠、0.62g/l乳酸钙、0.15g/ll-谷氨酰胺、0.55g/l亚牛磺酸、20ml/l必需氨基酸、10ml/l非必需氨基酸、0.065g/l青霉素、0.05g/l链霉素、4g/l牛血清蛋白(bsa)；

3)猪卵泡液的制备：从猪卵巢上抽出3-8mm大小的透亮卵泡，获取卵泡液，对该液体进行离心，收集上清液，用0.22μm过滤器进行过滤除杂，获得所需要的猪卵泡液；

4)卵母细胞的培养：猪卵巢采用75％乙醇清洗15s，然后用37℃加有青霉素和链霉素的生理盐水清洗3遍，用装12号针头的10ml注射器轻柔抽取2-6mm透亮卵泡，放入38.5℃恒温架中的试管中；在体视显微镜下挑选含有3层及3层以上颗粒、卵丘细胞包被、折光性良好的卵丘卵母细胞复合体(cocs)，将卵母细胞移入含有孕马血清促性腺激素(ecg)和人绒毛膜促性腺激素(hcg)的成熟液中培养20-22h，再换至无激素的成熟液中继续培养20-22h；设置20μmol/l丁苯羟酸的处理组和空白对照组，比较卵母细胞凋亡率、第一极体排出率；

5)体外受精(ivf)和孤雌(pa)胚胎生产：新鲜猪精液镜检活率0.7以上、畸形率低于50％为合格；将9ml洗精液加入1ml新鲜猪精液中，1500r/min离心3次，每次3min，弃去上清液，加入受精液重悬，待用；卵母细胞在获能液中清洗3遍，移入12孔板受精液中，加入重悬获能的精子，调整精子密度为1×10⁶个/ml，将卵母细胞与精子比例调整为1：(1000-1500)放入培养箱共孵育；3h后移入胚胎培养液中轻柔吹打，去除多余精子，将受精卵移入胚胎培养液微滴中继续培养；

6)孤雌激活采用电激活法，用平衡15min的激活液清洗融合槽3遍，将卵母细胞在激活液中清洗3遍后，移至覆盖满电激活液的融合槽电极丝中间，以1.00kv/cm、80μs的直流脉冲激活3次，电激活后的卵母细胞置于pzm3胚胎培养液中清洗3遍，移入胚胎培养液微滴中继续培养，继续培养条件为5％co2、饱和湿度、39℃；

7)将上步骤培养到168h的囊胚，置于hoechst33342中染色15min，之后滴1-2滴甘油压片、封片，使其均匀铺散在载玻片上，再于荧光照射下进行细胞计数；

8)统计pa胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数、ivf胚胎卵裂率、囊胚率以及囊胚总细胞数。

本发明中：

步骤1)所述的丁苯羟酸，用量是20μmol/l。

步骤3)所述的离心，转速3500r/min，时间15min。

步骤5)所述的将卵母细胞与精子放入培养箱共孵育，比例调整为1：1000。

步骤7)所述的hoechst33342，用量是10μg/ml。

和现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明所述的含有丁苯羟酸的猪卵母细胞体外成熟体系，对于丁苯羟酸能否促进减数分裂、提高卵母细胞发育效率、降低卵母细胞体外发育的凋亡率、并用于体外发育胚胎方面的应用进行了研究，研究发现含有丁苯羟酸的猪卵母细胞体外成熟体系可以降低卵母细胞体外发育的凋亡率；提高第一极体排出率、孤雌胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数、体外受精胚胎卵裂率、囊胚率以及囊胚总细胞数。

2、本发明所述的含有丁苯羟酸的猪卵母细胞体外成熟体系，和现有研究中的组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(vpa)相比，丁苯羟酸在促进卵母细胞体外成熟发育方面，要求的最佳浓度更低，在一定程度上组蛋白去乙酰化酶抑制剂的毒副作用得到降低。

【附图说明】

图1是本发明实施例1中采用20μmol/lbufexamac处理卵母细胞后的体外成熟情况的图。

图2是本发明实施例1中采用20μmol/lbufexamac处理卵母细胞后的pa胚胎发育情况的图。

图3是本发明实施例1中采用20μmol/lbufexamac处理卵母细胞后的ivf胚胎发育情况的图。

【具体实施方式】

以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。

实施例1：

含有丁苯羟酸的猪卵母细胞体外成熟体系的应用，包括如下步骤：

1)准备卵母细胞的成熟培养液：80％体积的tcm199、10％体积的猪卵泡液、10％体积的胎牛血清、0.1g/l半胱氨酸、0.075g/l青霉素、0.05g/l链霉素、10ng/ml胰岛素样生长因子、50ng/ml表皮生长因子、2.2g/lnahco3、10iu/ml孕马血清促性腺激素、10iu/ml人绒毛膜促性腺激素、20μmol/l丁苯羟酸；电激活液的主要成分为：0.3mmol/l甘露醇、0.1mmol/lcacl2·h2o、0.1mmol/lmgso4·7h2o、0.5mmol/lhepes、0.01％(w/v)聚乙烯醇(pva)；

2)准备胚胎培养液：6.31g/lnacl、0.74g/lkcl、0.047g/lkh2po4、2.1g/lnahco3、0.022g/l丙酮酸钠、0.62g/l乳酸钙、0.15g/ll-谷氨酰胺、0.55g/l亚牛磺酸、20ml/l必需氨基酸、10ml/l非必需氨基酸、0.065g/l青霉素、0.05g/l链霉素、4g/l牛血清蛋白(bsa)；

3)猪卵泡液的制备：从猪卵巢上抽出3-8mm大小的透亮卵泡，获取卵泡液，对该液体进行离心，3500r/min，15min，收集上清液，用0.22μm过滤器进行过滤除杂，获得所需要的猪卵泡液；

4)卵母细胞的培养：猪卵巢采用75％乙醇清洗15s，然后用37℃加有青霉素和链霉素的生理盐水清洗3遍，用装12号针头的10ml注射器轻柔抽取2-6mm透亮卵泡，放入38.5℃恒温架中的试管中；在体视显微镜下挑选含有3层及3层以上颗粒、卵丘细胞包被、折光性良好的卵丘卵母细胞复合体(cocs)，将卵母细胞移入含有孕马血清促性腺激素(ecg)和人绒毛膜促性腺激素(hcg)的成熟液中培养20-22h，再换至无激素的成熟液中继续培养20-22h；设置20μmol/l丁苯羟酸的处理组和空白对照组，比较卵母细胞凋亡率、第一极体排出率；

5)体外受精(ivf)和孤雌(pa)胚胎生产：新鲜猪精液镜检活率0.7以上、畸形率低于50％为合格；将9ml洗精液加入1ml新鲜猪精液中，1500r/min离心3次，每次3min，弃去上清液，加入受精液重悬，待用；

卵母细胞在获能液中清洗3遍，移入12孔板受精液中，加入重悬获能的精子，调整精子密度为1×10⁶个/ml，将卵母细胞与精子比例调整为1：1000放入培养箱共孵育；3h后移入胚胎培养液中轻柔吹打，去除多余精子，将受精卵移入胚胎培养液微滴中继续培养；

6)孤雌激活采用电激活法，用平衡15min的激活液清洗融合槽3遍，将卵母细胞在激活液中清洗3遍后，移至覆盖满电激活液的融合槽电极丝中间，以1.00kv/cm、80μs的直流脉冲激活3次，电激活后的卵母细胞置于pzm3胚胎培养液中清洗3遍，移入胚胎培养液微滴中继续培养，继续培养条件为5％co2、饱和湿度、39℃；

7)将上步骤培养到168h的囊胚，置于hoechst33342中染色15min，之后滴1-2滴甘油压片、封片，使其均匀铺散在载玻片上，再于荧光照射下进行细胞计数；

8)设置20μmol/l丁苯羟酸的处理组和空白对照组，比较pa胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数、ivf胚胎卵裂率、囊胚率以及囊胚总细胞数；

统计pa胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数、ivf胚胎卵裂率、囊胚率以及囊胚总细胞数。

实施例2：

含有丁苯羟酸的猪卵母细胞体外成熟体系的应用，和实施例1相比，步骤1)中丁苯羟酸的用量是10μmol/l，其他同实施例1。

实施例3：

含有丁苯羟酸的猪卵母细胞体外成熟体系的应用，和实施例1相比，步骤1)中丁苯羟酸的用量是30μmol/l，其他同实施例1。

对比例1：

和实施例1相比，步骤1)中将20μmol/l丁苯羟酸替换为1mmol/lvpa(丙戊酸)，其他同实施例1。

对比例2：

和实施例1相比，将20μmol/l丁苯羟酸替换为2mmol/lvpa(丙戊酸)，其他同实施例1。

实验结果：

详见表1-3以及附图1-2。

表120μmol/lbufexamac处理对卵母细胞成熟效率的影响

注：同列数据肩标不同字母代表同列数据差异显著(p<0.05)，无字母或含相同字母表示差异不显著p>0.05)。下表同。

表220μmol/lbufexamac处理对pa胚胎发育效率的影响

表320μmol/lbufexamac处理对ivf胚胎发育效率的影响

结论：

1、通过实施例1-3的比较，结果表明：添加20μmol/lbufexamac相比添加10μmol/lbufexamac、30μmol/lbufexamac的效果更好。

2、通过实施例1-3和对比例1-2的比较，结果表明：在卵母细胞的体外成熟培养液中添加10-30μmol/lbufexamac，相比1mmol/lvpa，2mmol/lvpa，可以降低卵母细胞体外发育的凋亡率；提高第一极体排出率、孤雌胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数以及提高了体外受精胚胎卵裂率、囊胚率以及囊胚总细胞数。

3、通过实施例1-3和对比例1-2的比较，结果表明：相比组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(vpa)而言，丁苯羟酸在促进卵母细胞体外成熟发育方面，要求的最佳浓度更低，这与丁苯羟酸与卵母细胞的亲和力有关，低浓度的丁苯羟酸能保持较高的组蛋白去乙酰化水平，从而促进了猪卵母细胞体外成熟发育以及后续的pa，ivf胚胎的发育能力。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。