杜鹃花苯丙氨酸解氨酶PAL蛋白、编码基因及其基因克隆方法

本发明涉及杜鹃花花香合成途径中的关键酶与其编码基因，具体涉及一种杜鹃花苯丙氨酸解氨酶(pal)蛋白以及编码基因和编码基因的克隆方法，属于生物技术领域。

背景技术：

植物香气物质由许多低分子量、易挥发的化合物组成，是次生代谢的产物。运用顶空固相微萃取法分析云锦杜鹃花瓣中香气组成，发现苯环型物质相对含量最高。植物香气物质苯丙酸类/苯环型化合物主要由苯丙烷类代谢途径合成。苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷类代谢途径的关键限速酶，是植物次生代谢研究最多的酶。它以莽草酸为底物，通过肉桂酸途径生成反式肉桂酸，在甲基转移酶和酰基转移酶的共同作用下最终生成多种醛类和醇类。大多数花香化合物的生物合成过程非常复杂，是由多个酶在不同组织中共同完成，在目前的研究中，苯丙氨酸解氨酶对下游产生植香气物质基因的调控机制尚未清晰。

云锦杜鹃(rhododendronfortuneilindl.)是一种常绿灌木或小乔木，为中国特有的杜鹃属物种，主要生长在海拔600～2000m的山脊阳处或林下。它是常绿杜鹃亚属的代表种之一，也是杜鹃属植物种间杂种(品种)的重要祖先亲本，国内外很多杜鹃品种均与其有一定的亲缘关系。云锦杜鹃叶形大，花形美丽且清香，有较高的园艺观赏价值。作为少有的香气品种，云锦杜鹃开发潜力巨大，具有良好的产业化前景。

目前，已经从许多植物中克隆了苯丙氨酸解氨酶基因(pal)，例如拟南芥、枸杞、葡萄、大豆等。云锦杜鹃作为花香物质含量丰富的花科植物之一，对于云锦杜鹃花pal基因的克隆、表达情况等相关报道并不常见。

技术实现要素：

本发明的目的在于填补杜鹃花pal家族成员的克隆、表达情况分析以及杜鹃花pal蛋白以及编码基因的空白。

为了解决上述问题，本发明提供了一种杜鹃花pal基因及其cdna、gdna以及氨基酸序列；

本发明提供了一种杜鹃花苯丙氨酸解氨酶pal蛋白，包括：

(a)如seqidno:1所示氨基酸序列组成的蛋白质；或

(b)在(a)中所示的seqidno:1的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有杜鹃花苯丙氨酸解氨酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明还提供了编码所述的一种杜鹃花苯丙氨酸解氨酶pal蛋白的基因。

作为优选的方案，所述编码pal蛋白的gdna(全长)基因序列如seqidno:2所示。

作为优选的方案，所述编码pal蛋白的cdna(保守区)基因序列如seqidno:3所示。

本发明解决的另一个技术问题是：提供了该杜鹃花苯丙氨酸解氨酶pal基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)提取以及纯化杜鹃花瓣rna；

(2)将杜鹃花瓣rna逆转录获得cdna第一链；

(3)利用一对引物对步骤(2)获得的cdna第一链进行扩增得到cdna序列，所述引物为：

(4)将提取的rna进行逆转录合成得到合成3’和5’cdna，以合成的cdna为模板，利用引物进行扩增得到3’和5’序列，拼接后得到pal基因全长序列。

作为优选的方案，所述步骤(3)中采用的引物为：

f1:agtgattgggtgatggagagca

r1:cataaccaagatgtgaactc。

作为优选的方案，所述步骤(4)中采用的引物为：

3’race：gatgccgcagaagcgttccgcctagccg

5’race：cctagtgaatggcacggctgttggg。

作为优选的方案，步骤(3)中，cdna第一链扩增后，还包括将扩增产物连接至载体上，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取白色单菌落经过菌液pcr筛选阳性克隆的步骤。

作为优选的方案，所述的载体为pmd18-t载体。

该技术方案具有以下有益的技术效果：

杜鹃花作为观赏性植物，在国内外都很受欢迎，而云锦杜鹃花的香气物质也相当地丰富，目前对于杜鹃花pal基因的克隆、表达情况等相关报道并不常见，本发明针对目前杜鹃花苯丙氨酸解氨酶pal蛋白的研究还比较薄弱的现状，提供了一种的杜鹃花pal基因的克隆方式，并且对于克隆所得的pal基因进行了再不同组织以及不同时期表现情况的分析，为今后杜鹃花的相关研究提供了理论依据，为今后利用基因工程技术改了植物品质、获得不同花香的植物提供理论依据，具有较高的应用价值。

附图说明

图1为杜鹃花氨基酸与白梨(np_001306736.1)、雷公藤(kaf5750402.1)、麻风树(abi33979.1)、猕猴桃(afq92052.1)和中华猕猴桃(psr89950.1)中的pal氨基酸系列对比图；

图2为杜鹃花pal蛋白在不同组织器官中的表达水平表现图；

图3为杜鹃花pal蛋白在花瓣的不同发育阶段时的表达水平。

具体实施方案

以下结合具体实施例，对本发明做进一步描述。

以下所提供的实施例并非用以限制本发明所涵盖的范围，所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进，亦落入本发明要求的保护范围之内。

实施例1、杜鹃花pal基因的克隆

1.植物材料的获得

本实验所用的植物材料为杜鹃花优质种质资源云锦杜鹃。云锦杜鹃为少有的香气品种。实验材料采自浙江省宁波市四明山国家森林公园。在自然条件下育苗，生长并开花。采集杜鹃花的盛开期的花瓣用于提取rna和dna。

2.rna和dna的提取

采用rnapreppure多糖多酚植物总rna提取试剂盒提取rna(试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司)。变性后用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定rna的完整性，在分光光度计(thermoscientificnanodrop2000)上测定rna的纯度和浓度。

采用hpplantdnakit试剂盒提取总dna(omegabio-tek(美国)公司)

3.基因的全长克隆

基于genebank中pal基因的保守序列设计一对引物，将提取的rna进行逆转录(superrtcdnasynthesiskit：康为世纪生物科技有限公司)，以第一链cdna为模板，利用引物

f1:agtgattgggtgatggagagca

r1:cataaccaagatgtgaactc

进行pcr，扩增得到预期长度后回收并连接到pmd18-t(宝日医生物技术(北京)有限公司)载体上，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取白色单菌落经过菌液pcr筛选阳性克隆，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，得到cdna序列。

根据相同引物，以dna为模板，扩增pal的gdna，扩增得到产物回收后连接到pmd18-t(宝日医生物技术(北京)有限公司)载体上，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取白色单菌落经过菌液pcr筛选阳性克隆，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，得到gdna序列。

根据得到的cdna序列设计一对引物

将提取的rna进行逆转录(5’/3’kit：宝日医生物技术(北京)有限公司)合成3’和5’cdna，以合成的cdna为模板，利用引物

3’race：gatgccgcagaagcgttccgcctagccg

5’race：cctagtgaatggcacggctgttggg

进行pcr，扩增得到预期长度后回收并连接到pmd18-t(宝日医生物技术(北京)有限公司)载体上，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取白色单菌落经过菌液pcr筛选阳性克隆，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，得到3’和5’序列。将得到的序列进行拼接，得到基因全长序列。

实例2、杜鹃花pal基因的序列信息及同源性分析

得到的pal基因经过orf预测，序列中286-2430bp为orf序列，长度为2145bp，推测编码了715个氨基酸。pal编码蛋白分子量为77,58kda，理论等电点pi为6.03，pal的基因组包含了2个外显子和1个内含子。

将杜鹃花pal的开放阅读框序列及其编码蛋白的氨基酸序列在ncbi、embl等在线分析上利用blast程序进行核苷酸和蛋白质同源性检索。

实例3、杜鹃花pal基因在不同组织中的表达差异和花瓣不同发育阶段的表现情况

1.植物材料的获得

采集不同发育阶段的花瓣，在开花期分别采集叶、花瓣以及雄(雌)蕊，将样品分别用自封袋包好，液氮速冻后，于-80℃超低温冰箱中储存。

2.rna的提取

采用rnapreppure多糖多酚植物总rna提取试剂盒提取rna(试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司)。变形后用1％琼脂糖凝胶电泳(1tae；120v，20min)鉴定rna的完整性，在分光光度计(thermoscientificnanodrop2000)上测定rna的纯度和浓度。

3.cdna的获得

以500ng的总rna为模板，按照诺唯赞公司ⅱqrtsupermixforqpcr(+gdnawiper)试剂盒操作说明进行反转录制备cdna。

4.设计特异性引物进行实时荧光定量pcr分析基因在不同组织中和不同发育阶段的表达量。根据已经获得的杜鹃花pal基因序列，利用引物设计软件设计用于real-timepcr的特异性引物。

pal-f：ggctctggcttcgattggtaaactc

pal-r：ggacatgattggtgacagggttagc

内参基因为ef1α，其引物为

ef1α-f：ctcgattgccacacttccca

ef1α-r：catcttcaccatcccagcgt

5.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析。以合成的cdna为模板，分别用目的基因与内参基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，real-timepcr反应在cfx-96实时定量仪上进行，反应体系为20μl。采用三步法，95℃变性1min；95℃10s，60℃30s，40个循环；60℃60s，95℃15s，采集融解曲线。

6.采用利用2-[ct(目的基因)-ct(18s)]得到目的基因对内参基因的表达水平，每种样品都设3次重复。如图2、图3所示，图2为杜鹃花pal蛋白在不同组织器官中的表达水平表现图；图3为杜鹃花pal蛋白在花瓣的不同发育阶段时的表达水平表现图‘’结果显示pal基因在杜鹃花的叶、雄(雌)蕊和花瓣中均有表达，其中在叶中的表达最高，其次是花瓣，雄蕊和雌蕊则最低，说明pal基因的表达具有明显的空间差异性。而在不同的发育阶段，pal基因的表达呈现先上升后下降的趋势，在盛花期的表达达到最高。

实施例4、杜鹃花pal蛋白与其他植物pal蛋白的序列对比

如图1所示，图1为本发明克隆所得的杜鹃花pal蛋白的序列与白梨(np_001306736.1)、雷公藤(kaf5750402.1)、麻风树(abi33979.1)、猕猴桃(afq92052.1)和中华猕猴桃(psr89950.1)的对比图，可以看出杜鹃花pal蛋白的氨基酸序列与上述对比例的氨基酸序列类似，属于同一家族。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权力要求的范围内做出各种变性或修改，这并不影响本发明的实质内容。

序列表

<110>浙江万里学院

<120>杜鹃花苯丙氨酸解氨酶pal蛋白、编码基因及其基因克隆方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>716

<212>prt

<213>云锦杜鹃(rhododendronsimsii)

<400>1

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<213>云锦杜鹃(rhododendronsimsii)

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