0.02
‑
0.03ug/ml、表皮生长因子0.05
‑
0.1μg/ml、重组人胰岛素15
‑
30μg/ml、柠檬酸铁0.1
‑
0.2μg/ml、cacl2·
2h2o 0.3
‑
0.5mg/ml、cuso4·
5h2o 0.25
‑
0.4mg/ml、feso4·
7h2o 0.2
‑
0.3μg/ml；
11.血清白蛋白为50mg/ml的水溶液；，
12.有益效果在于，鸡胚提取物中与胎牛血清相比含有更早期的生长因子，在皮肤细胞向间充质干细胞转化过程中利于产生更多的细胞表面信号分子，更有利于激活体内的细胞全能活性；
13.间充质干细胞培养血清加油包的制备方法是将上述原料混匀后，无菌膜过滤，冷藏备用；
14.本发明还提供了间充质干细胞培养血清加油包在制备间充质干细胞培养制剂中的应用；
15.一种间充质干细胞培养血清，按体积计，间充质干细胞培养血清加油包∶人血清＝1∶(2
‑
3)；
16.优选的，本发明还提供了间充质干细胞培养血清在制备间充质干细胞培养制剂中的应用；
17.本发明还提供了一种皮肤间充质干细胞原代培养基，按体积计，基础培养基∶间充质干细胞培养血清＝10∶(4
‑
6)；
18.优选的，一种皮肤间充质干细胞传代培养基，按体积计，基础培养基∶间充质干细胞培养血清＝10∶(2
‑
4)；
19.优选的，本发明还提供了皮肤间充质干细胞培养基在皮肤间充质干细胞培养中的应用；
20.优选的，所述人血清为igg去除90％以上的人血清；
21.优选的，所述基础培养基dmem培养基；
22.优选的，所述基础培养基为dmem：f12混合培养基；
23.一种皮肤间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
24.1)取皮肤组织剪碎，加入酶解液，消化后，离心，去上清，得酶解组织；
25.2)酶解组织加入传代培养基终止酶活，离心，去上清；
26.3)将酶解组织置于血清白蛋白包被的培养皿中，加入原代培养基，通入空气、co2和n2的混合气体，37℃条件下培养；
27.4)当细胞丰度达到65
‑
75％，收获原代间充质干细胞；
28.5)将步骤4)中原代间充质干细胞传代培养；
29.优选的，步骤1)中，消化温度为37℃，时间为120
‑
240min，离心转数1000rpm，时间为8
‑
15min；
30.优选的，反应时间为90min；
31.优选的，步骤2)中，酶解组织按1∶5加入终止血清，离心转数为1000rpm；
32.优选的，酶消化液为添加质量百分比0.2
‑
0.4％i型胶原蛋白酶的原代培养基；
33.优选的，酶消化液中含有0.1
‑
0.3mg/ml的青霉素和0.1
‑
0.3mg/ml链霉素；
34.优选的，i型胶原蛋白酶质量百分比浓度浓度为0.3％；
35.有益效果在于：不同蛋白酶水解位点及键位均不同，不同类型的皮肤细胞表面蛋
白种类和适用的信号活性位点均不同，i型胶原蛋白酶处理过的皮肤细胞，保留更多的间充质干细胞转化活性信号位点，更有利于向皮肤间充质干细胞转化及细胞全能性的激发；
36.优选的，青霉素浓度为0.2mg/ml；
37.优选的，链霉素0.2mg/ml；
38.优选的，酶消化液经的配置将酶消化液由0.2
‑
0.4％的i型胶原蛋白酶，0.1
‑
0.3mg/ml的青霉素，0.1
‑
0.3mg/ml链霉素，基础培养基组成混匀后，无菌过滤，冷藏备用；
39.优选的，血清白蛋白为重组人血清白蛋白；
40.有益效果在于：重组人血清白蛋白不仅作为血液基质蛋白还具有一定信号作用，本申请使用重组人血清白蛋白更能模仿体内皮肤细胞的生长环境，利于成纤维皮肤成纤维表面蛋白分子的生长；
41.优选的，混合气体为空气∶n2∶co2体积比为(67∶30∶3)
‑
(63∶30∶7)；
42.优选的，混合气体为空气∶n2∶co2体积比为65∶30∶5；
43.有益效果在于：本申请通入的气体具有更少的氧气比例，更能还原体内皮肤细胞的氧气环境；在体内气体分子作为一种信号影响着干细胞活性，本申请的气体组成更有利于皮肤细胞向间充质干细胞转化及细胞全能性的激活。
44.综上所述，本发明公开了一种间充质干细胞培养血清及其制备方法，通过鸡胚提取物、重组人血清白蛋白、i型胶原蛋白酶和更低的氧气比例以及其他操作的相互配合，可以在短时间内培养出大量具有间质填充功能的皮肤间充质干细胞，回注皮肤褶皱区域后，可有效填充内部区域，使褶皱区域展平，且无排异反应，为皮肤干细胞体内再生医疗工程打下基础。
具体实施方式
45.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
46.药剂均购自常规试剂公司。
47.参考cn201911135676.0方法，将人血清做igg、补体去除，去除率达90％以上的人血清，热灭火后，用于下列实验。
48.实施例1
49.取50mg/ml重组人血清白蛋白水溶液5ml，添加以下原料并调节终浓度为：维生素c 10mg/ml、丙氨酸
‑
谷氨酰胺二肽0.1mg/ml、碱性成纤维生长因子50ng/ml、tgf
‑
β1 0.02ug/ml、表皮生长因子0.05μg/ml、重组人胰岛素15μg/ml、柠檬酸铁0.1μg/ml、cacl2·
2h2o 0.3mg/ml、cuso4·
5h2o 0.25mg/ml、feso4·
7h2o 0.2μg/ml，得间充质干细胞培养血清加油包。
50.将人血清40ml和80ml充质干细胞培养血清加油包混合，得间充质干细胞培养血清。
51.1)培养基及试剂的配置
52.原代培养基：
53.取dmem培养基1000ml，加入间充质干细胞培养血清400ml，无菌过滤，得原代培养基。
54.传代培养基：
55.取dmem培养基1000ml，加入间充质干细胞培养血清200ml，无菌过滤，传代培养基。
56.酶解液：
57.取原代培养基，加入0.2％的i型胶原蛋白酶、0.1cmg/ml的青霉素、0.1cmg/ml链霉素混匀后，无菌过滤，冷藏备用。
58.原代间充质干细胞培养：
59.超净台，取1cm2皮肤组织，剪碎，加入30ml的酶解液，37℃反应120min，1000rpm离心10min，去上清，将酶解组织按体积比1∶5加入原代培养基终止消化，1000rpm离心5min，去上清，将酶解组织加入人白蛋白包被的培养皿中，并加入原代培养基100ml，通入空气∶n2∶co2体积比为63∶30∶7的混合气体，37℃培养；当皮肤细胞丰度生长至65％时，收获原代皮肤间充质干细胞，用于后续实验。
60.传代间充质干细胞培养：
61.超净台，将含有原代培养基的原代皮肤间充质干细胞用生理盐水冲洗3次，加入酶解液20min，1000rpm离心10min，去上清；加入5倍体积的传代培养基终止消化，1000rpm离心5min，去上清，得消化后的原代皮肤间充质干细胞；将消化后的原代皮肤间充质干细胞用传代培养基重新放入人白蛋白包被的培养容器中，通入空气∶n2∶co2体积比为63∶30∶7的混合气体，37℃培养，每3天换一次培养液，5天左右可再次传代。
62.实施例2
63.取50mg/ml重组人血清白蛋白水溶液8ml，添加以下原料并调节终浓度为：维生素c 20mg/ml、丙氨酸
‑
谷氨酰胺二肽0.2mg/ml、碱性成纤维生长因子70ng/ml、tgf
‑
β1 0.03ug/ml、表皮生长因子0.1μg/ml、重组人胰岛素30μg/ml、柠檬酸铁0.2μg/ml、cacl2·
2h2o 0.5mg/ml、cuso4·
5h2o 0.4mg/ml、feso4·
7h2o 0.3μg/ml，得间充质干细胞培养血清加油包。
64.将人血清40ml和120ml充质干细胞培养血清加油包混合，得间充质干细胞培养血清
65.1)培养基及试剂的配置
66.原代培养基：
67.取dmem：f12体积比2∶1的培养基1000ml，加入间充质干细胞培养血清600ml，无菌过滤，得原代培养基。
68.传代培养基：
69.取dmem培养基1000ml，加入间充质干细胞培养血清400ml，无菌过滤，传代培养基。
70.酶解液：
71.取原代培养基，加入0.4％的i型胶原蛋白酶、0.3mg/ml的青霉素、0.3mg/ml链霉素混匀后，无菌过滤，冷藏备用。
72.原代间充质干细胞培养：
73.超净台，取1cm2皮肤组织，剪碎，加入30ml的酶解液，37℃反应240min，1000rpm离心10min，去上清，将酶解组织按体积比1∶5加入原代培养基终止消化，1000rpm离心5min，去
上清，将酶解组织加入人白蛋白包被的培养皿中，并加入原代培养基200ml，通入空气∶n2∶co2体积比为67∶30∶3的混合气体，37℃培养；当皮肤细胞丰度生长至75％时，收获原代皮肤间充质干细胞，用于后续实验。
74.传代间充质干细胞培养：
75.超净台，将含有原代培养基的原代皮肤间充质干细胞用生理盐水冲洗3次，加入酶解液20min，1000rpm离心10min，去上清；加入5倍体积的传代培养基终止消化，1000rpm离心5min，去上清，得消化后的原皮肤代间充质干细胞；将消化后的原代皮肤间充质干细胞用传代培养基重新放入人白蛋白包被的培养容器中，通入空气∶n2∶co2体积比为67∶30∶3的混合气体，37℃培养，每3天换一次培养液，5天左右可再次传代。
76.实施例3
77.取50mg/ml重组人血清白蛋白水溶液6ml，添加以下原料并调节终浓度为：维生素c 15mg/ml、丙氨酸
‑
谷氨酰胺二肽0.15mg/ml、碱性成纤维生长因子60ng/ml、tgf
‑
β1 0.015ug/ml、表皮生长因子0.075μg/ml、重组人胰岛素20μg/ml、柠檬酸铁0.15μg/ml、cacl2·
2h2o 0.4mg/ml、cuso4·
5h2o 0.35mg/ml、feso4·
7h2o 0.25μg/ml，得间充质干细胞培养血清加油包。
78.将人血清40ml和100ml充质干细胞培养血清加油包混合，得间充质干细胞培养血清
79.1)培养基及试剂的配置
80.原代培养基：
81.取dmem培养基1000ml，加入间充质干细培养血清500ml，无菌过滤，得原代培养基。
82.传代培养基：
83.取dmem：f12体积比1∶1的培养基1000ml，加入间充质干细胞培养血清300ml，无菌过滤，传代培养基。
84.酶解液：
85.取原代培养基，加入0.3％的i型胶原蛋白酶、0.2mg/ml的青霉素、0.2mg/ml链霉素混匀后，无菌过滤，冷藏备用。
86.原代间充质干细胞培养：
87.超净台，取1cm2皮肤组织，剪碎，加入30ml的酶解液，37℃反应180min，1000rpm离心10min，去上清，将酶解组织按体积比1∶5加入原代培养基终止消化，1000rpm离心5min，去上清，将酶解组织加入人白蛋白包被的培养皿中，并加入原代培养基，通入空气∶n2∶co2体积比为65∶30∶5的混合气体，37℃培养；当皮肤细胞丰度生长至65％
‑
75％时，收获原代皮肤间充质干细胞，用于后续实验。
88.传代间充质干细胞培养：
89.超净台，将含有原代培养基的原代皮肤间充质干细胞用生理盐水冲洗3次，加入酶解液20min，1000rpm离心10min，去上清；加入5倍体积的传代培养基终止消化，1000rpm离心5min，去上清，得消化后的原代皮肤间充质干细胞；将消化后的原代皮肤间充质干细胞用传代培养基重新放入人白蛋白包被的培养容器中，通入空气∶n2∶co2体积比为65∶30∶5的混合气体，37℃培养，每3天换一次培养液，5天左右可再次传代。
90.对比例1
91.取50mg/ml重组人血清白蛋白水溶液5ml混匀，添加以下原料并调节终浓度为：维生素c 20mg/ml、丙氨酸
‑
谷氨酰胺二肽0.2mg/ml、碱性成纤维生长因子70ng/ml、tgf
‑
β1 0.03ug/ml、表皮生长因子0.1μg/ml、重组人胰岛素30μg/ml、柠檬酸铁0.2μg/ml、cacl2·
2h2o 0.5mg/ml、cuso4·
5h2o 0.4mg/ml、feso4·
7h2o 0.3μg/ml，得间充质干细胞培养血清加油包1。
92.将人血清40ml和100ml充质干细胞培养血清加油包混合，得间充质干细胞培养血清1。
93.取50mg/ml重组人血清白蛋白水溶液5ml，添加以下原料并调节终浓度为：维生素c 20mg/ml、丙氨酸
‑
谷氨酰胺二肽0.2mg/ml、碱性成纤维生长因子70ng/ml、tgf
‑
β1 0.03ug/ml、表皮生长因子0.1μg/ml、重组人胰岛素30μg/ml、柠檬酸铁0.2μg/ml、cacl2·
2h2o 0.5mg/ml、cuso4·
5h2o 0.4mg/ml、feso4·
7h2o 0.3μg/ml，得间充质干细胞培养血清加油包2。
94.将人血清40ml和100ml充质干细胞培养血清加油包混合，得间充质干细胞培养血清2
95.1)培养基及试剂的配置
96.原代培养基：
97.取dmem培养基1000ml，加入间充质干细胞培养血清1500ml，无菌过滤，得原代培养基。
98.传代培养基：
99.取dmem培养基1000ml，加入间充质干细胞培养血清2300ml，无菌过滤，传代培养基。
100.酶解液：
101.取原代培养基，加入0.2％的i型胶原蛋白酶、0.1cmg/ml的青霉素、0.1cmg/ml链霉素混匀后，无菌过滤，冷藏备用。
102.原代间充质干细胞培养：
103.超净台，取1cm2皮肤组织，剪碎，加入30ml的酶解液，37℃反应120min，1000rpm离心10min，去上清，将酶解组织按体积比1∶5加入原代培养基终止消化，1000rpm离心5min，去上清，将酶解组织加入人白蛋白包被的培养皿中，并加入原代培养基150ml，通入空气∶n2∶co2体积比为65∶30∶5的混合气体，37℃培养；当皮肤细胞丰度生长至65％时，收获原代皮肤间充质干细胞，用于后续实验。
104.传代间充质干细胞培养：
105.超净台，将含有原代培养基的原代皮肤间充质干细胞用生理盐水冲洗3次，加入酶解液20min，1000rpm离心10min，去上清；加入5倍体积的传代培养基终止消化，1000rpm离心5min，去上清，得消化后的原代皮肤间充质干细胞；将消化后的原代皮肤间充质干细胞用传代培养基重新放入人白蛋白包被的培养容器中，通入空气∶n2∶co2体积比为63∶30∶7的混合气体，37℃培养，每3天换一次培养液，5天左右可再次传代。
106.对比例2
107.取50mg/ml重组人血清白蛋白水溶液8ml，添加以下原料并调节终浓度为：维生素c 8mg/ml、丙氨酸
‑
谷氨酰胺二肽0.09mg/ml、碱性成纤维生长因子40ng/ml、tgf
‑
β1 0.01ug/
ml、表皮生长因子0.05μg/ml、重组人胰岛素12μg/ml、柠檬酸铁0.1μg/ml、cacl2·
2h2o 0.3mg/ml、cuso4·
5h2o 0.25mg/ml、feso4·
7h2o 0.2μg/ml，得间充质干细胞培养血清加油包。
108.将人血清40ml和100ml充质干细胞培养血清加油包混合，得间充质干细胞培养血清。
109.1)培养基及试剂的配置
110.原代培养基：
111.取dmem培养基1000ml，加入间充质干细胞培养血清600ml，无菌过滤，得原代培养基。
112.传代培养基：
113.取dmem培养基1000ml，加入间充质干细胞培养血清400ml，无菌过滤，传代培养基。
114.酶解液：
115.取原代培养基，加入3.5％的胰蛋白酶、0.1cmg/ml的青霉素、0.1cmg/ml链霉素混匀后，无菌过滤，冷藏备用。
116.原代间充质干细胞培养：
117.超净台，取1cm2皮肤组织，剪碎，加入30ml的酶解液，37℃反应60min，1000rpm离心10min，去上清，将酶解组织按体积比1∶5加入原代培养基终止消化，1000rpm离心5min，去上清，将酶解组织加入人白蛋白包被的培养皿中，并加入原代养基150ml，通入空气∶n2∶co2体积比为63∶30∶7的混合气体，37℃培养；当皮肤细胞丰度生长至65％时，收获原代皮肤间充质干细胞，用于后续实验。
118.传代间充质干细胞培养：
119.超净台，将含有原代培养基的原代皮肤间充质干细胞用生理盐水冲洗3次，加入酶解液20min，1000rpm离心10min，去上清；加入5倍体积的传代培养基终止消化，1000rpm离心5min，去上清，得消化后的原代皮肤间充质干细胞；将消化后的原代皮肤间充质干细胞用传代培养基重新放入人白蛋白包被的培养容器中，通入空气∶n2∶co2体积比为65∶30∶5的混合气体，37℃培养，每3天换一次培养液，5天左右可再次传代。
120.对比例3
121.取50mg/ml重组人血清白蛋白水溶液5ml，添加以下原料并调节终浓度为：维生素c 25mg/ml、丙氨酸
‑
谷氨酰胺二肽0.2mg/ml、碱性成纤维生长因子80ng/ml、tgf
‑
β1 0.05ug/ml、表皮生长因子0.2μg/ml、重组人胰岛素30μg/ml、柠檬酸铁0.2μg/ml、cacl2·
2h2o 0.5mg/ml、cuso4·
5h2o 0.4mg/ml、feso4·
7h2o 0.3μg/ml，得间充质干细胞培养血清加油包。
122.将人血清40ml和80ml充质干细胞培养血清加油包混合，得间充质干细胞培养血清
123.1)培养基及试剂的配置
124.原代培养基：
125.取dmem培养基1000ml，加入间充质干细胞培养血清400ml，无菌过滤，得原代培养基。
126.传代培养基：
127.取dmem培养基1000ml，加入间充质干细胞培养血清2000ml，无菌过滤，传代培养
基。
128.酶解液：
129.取原代培养基，加入0.3％的i型胶原蛋白酶、0.2mg/ml的青霉素、0.2mg/ml链霉素混匀后，无菌过滤，冷藏备用。
130.原代间充质干细胞培养：
131.超净台，取1cm2皮肤组织，剪碎，加入30ml的酶解液，37℃反应180min，1000rpm离心10min，去上清，将酶解组织按体积比1∶5加入原代培养基终止消化，1000rpm离心5min，去上清，将酶解组织加入培养皿中，并加入原代培养基150ml，通入空气∶n2∶co2体积比为67∶30∶3的混合气体，37℃培养；当皮肤细胞丰度生长至65％
‑
75％时，收获原代皮肤间充质干细胞，用于后续实验。
132.传代间充质干细胞培养：
133.超净台，将含有原代培养基的原代皮肤间充质干细胞用生理盐水冲洗3次，加入酶解液20min，1000rpm离心10min，去上清；加入5倍体积的传代培养基终止消化，1000rpm离心5min，去上清，得消化后的原代皮肤间充质干细胞；将消化后的原代皮肤间充质干细胞用传代培养基重新放入人白蛋白包被的培养容器中，通入空气∶n2∶co2体积比为63∶30∶7的混合气体，37℃培养，每3天换一次培养液，5天左右可再次传代。
134.对比试验：
135.将实施例1
‑
3和对比例1
‑
3得到的传代细胞进行生理生化及功能性检测。
136.1、细胞形态观察
137.实施例1，细胞培养36h后95％以上细胞呈梭形，进入增殖期，第2
‑
3天细胞开始对数生长，5天左右细胞达到80％以上的融合度，显微镜下观察极少有内皮细胞，10代以内细胞的表型和形态未有明显变化。
138.实施例2，细胞培养36h后90％左右细胞贴壁呈梭形，细胞第3
‑
4天开始进入对数生长期，6天左右细胞达到80％左右融合度，10代以内细胞的表型和形态未有明显变化。
139.实施例3，细胞培养36h后90％左右细胞贴壁呈梭形，细胞第3
‑
4天开始进入对数生长期，6天左右细胞达到80％左右融合度，10代以内细胞的表型和形态未有明显变化。
140.对比例1，细胞培养36h后细胞开始生长，梭形细胞数量较少，细胞第6
‑
7天开始对数生长期，9
‑
10天左右细胞达到80％左右融合度，7代以后细胞的形态由梭形开始变向扁平状态国度，增殖速度开始变慢。
141.对比例2，细胞培养48h后75％左右细胞贴壁呈梭形，细胞第5
‑
6天进入对数期，8
‑
9天左右细胞达到80％左右融合度，10代以内细胞的表型和形态未有明显变化。
142.对比例3，细胞培养48h后80％左右细胞贴壁呈梭形，细胞第5天开始进入对数生长期，8天左右细胞达到80％左右融合度，10代以内细胞的表型和形态未有明显变化。
143.2、免疫表型检测
144.流式细胞仪检测实施例1
‑
3和对比例1
‑
3的第八代传代细胞表面标记物cd90、cd73、cd105的阳性率。结果如表1，实施例1
‑
3的传代间充质干细胞均具有纯度高原代活性强，对比例1
‑
3活性相对较弱，但仍保持一定活性。
145.表1
[0146] cd90cd73cd105
实施例1＞99％＞99％＞99％实施例2＞99％＞99％＞99％实施例3＞99％＞99％＞99％对比例1＞85％＞87％＞83％对比例2＞89％＞90％＞92％对比例3＞91％＞87％＞88％
[0147]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0148]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。