用于检测肺炎支原体核酸及其有无耐药基因变异的试剂盒及检测方法与流程

1.本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及肺炎支原体核酸及其耐药基因变异的检测试剂盒及检测方法，该试剂盒用于在体外定性地检测痰样本、咽拭子样本、或者鼻拭子样本中的肺炎支原体23s rrna基因及其变异，适用于肺炎支原体感染的辅助诊断。


背景技术：

2.肺炎支原体(m pneumonia，也简称为mp或者mp)是人类支原体肺炎的病原体，主要经飞沫传染，潜伏期2～3周。目前肺炎支原体已成为儿童社区获得性肺炎的主要病原之一，同时是青少年和老年人呼吸道感染的常见病原体，可以引起支原体肺炎、上呼吸道感染、支气管炎、肾炎等，严重时可导致死亡。mp对抑制微生物蛋白质合成的大环内脂类抗生素、作用于dna拓扑异构酶的喹诺酮类抗生素及四环素类抗生素均敏感。但鉴于儿童的生理特点及药物的不良反应，四环素及喹诺酮类抗生素被限制用于儿童支原体感染的治疗，大环内酯类抗生素成为临床mp感染的一线用药。随着大环内酯类药物在临床上的广泛应用，由基因突变导致的抗药现象也不断出现。近年来国内外多篇文献陆续报道临床分离出了对大环内酯类抗生素抗药的mp抗药株。德国报道，mp的抗药率为3％；日本的研究显示，2002～2006年mp的抗药率从5％增至30％以上；中国儿童mp的抗药率＞80％；更进一步增加了儿童mp肺炎及其肺外并发症治疗的难度。因此，临床开展儿童mp感染患者耐药基因的常规检测对于对支原体感染患儿的进一步有效治疗、减少肺外并发症的发生、以及对后期抗药mp感染的治疗及抗药机制的研究、抗药控制等均有一定的临床指导意义。
3.目前临床检测肺炎支原体主要包括分离培养法、抗原检测法、pcr检测方法以及血清学检测法。
4.对于分离培养法来说，从临床被检体中分离培养mp所需的费用和工作量都比较大，需要用特殊的培养基进行一系列的传代培养，培养需要数周。即使提高培养基分离效率，这种方法诊断的敏感性也不到pcr方法的60％，但分离培养法的特异性可达到100％。
5.利用抗原检测技术对呼吸道感染的mp直接进行快速抗原检测的方法包括直接免疫荧光法、反相免疫电泳技术、免疫印迹和酶联抗原免疫捕获技术。考虑到患者痰被检体中mp的浓度大约在102～106cfu/ml，而抗原检测技术可检测的浓度范围在10～100cfu/ml，不经过mp扩增培养的抗原检测的灵敏度十分有限，因此在能利用核酸扩增技术诊断时，不推荐应用抗原检测来诊断。
6.pcr诊断技术的应用已取代了传统的分离培养法，80年代后期通过对模拟临床被检体、动物模型及临床实验证明了pcr技术对mp感染的诊断能力。美国疾控中心现在推荐使用的常规mp pcr检测方法依据bernet等最初设计的pcr检测方法来扩增mpatp酶基因序列区域的片段。
7.血清学检测方法长期以来一直是mp诊断和流行病学研究的主要方法。对成年人的mp感染检测精度最高的诊断方法是感染后2～3周时同时对igm和igg检测两次。当抗体滴度
相差4倍以上为mp阳性。有mp感染史的患者体内igg抗体持续升高、较长一段时间内在成年人中可能没有igm反应，这些都是利用血清学方法单独检测mp感染的限制。
8.随着抗药株的增多，在用药治疗前检测是否是抗药株非常必要，各类检测方法中，只有pcr方法可以对抗药株的基因进行分析。因此截至目前为止，仍在对用于迅速进行肺炎支原体的检测和/或抗药性检查的方法进行研究(专利文献1、2、非专利文献1)。但是，要求开发出更有用的检测试剂盒及检测方法。
9.现有技术文献
10.专利文献
11.专利文献1：日本特开2015
‑
128400号公报
12.专利文献2：日本特开2014
‑
042459号公报
13.非专利文献
14.非专利文献1：antimicrobial agents and chemotherapy oct.2008,p.3542
‑
3549


技术实现要素：

15.发明要解决的问题
16.本发明的目的在于，提供肺炎支原体核酸及其耐药基因变异的检测试剂盒及检测方法，利用该试剂盒能够迅速且简便地检测肺炎支原体核酸、肺炎支原体23s rrna基因及23s rrna上的第2063或者2064基因座是否发生了变异。
17.用于解决问题的方案
18.为了达成上述目的，本发明的技术方案如下。肺炎支原体核酸及其耐药基因变异的检测试剂盒包含kod dna聚合酶、引物mpn
‑
f、引物mpn
‑
r、及特异性靶向荧光探针；
19.前述引物mpn
‑
f为由肺炎支原体核酸23s rrna基因(序列号33)的第1910号到第2039号所示的碱基序列中的或者与其互补的碱基序列中的连续且长度为25～36个碱基的碱基序列构成的正向引物；
20.前述引物mpn
‑
r为由肺炎支原体核酸23s rrna基因(序列号33)的第2091号到第2257号所示的碱基序列中的或者与其互补的碱基序列中的连续且长度为25～36个碱基的碱基序列构成的反向引物；
21.前述特异性靶向荧光探针为一种探针，其特征在于，被设计成由肺炎支原体核酸23s rrna基因(序列号33)的第2040号到第2081号所示的碱基序列中的或者与其互补的碱基序列中的连续且长度为16～23个碱基的碱基序列构成，并且，任意的末端碱基上标记有荧光色素。
22.如以下所述，对上述技术方案中的相关内容进行说明。
23.1、在上述技术方案中，kod dna聚合酶是从鹿儿岛县小宝岛的含硫气孔中分离出来的超嗜热原始菌thermococcus kodakaraensis kod1提取纯化出来的，具有很强的3
’→5’
核酸外切酶活性(校正活性)，准确性约为taq dna聚合酶的50倍。具有1kb/30s以上的dna合成速度，该速度是最为普通的taq聚合酶的两倍。另外，持续合成能力等优异也是其延伸速度很快的主要原因之一。采用kod dna聚合酶，可以使一次循环的时间从原来的几分钟缩短为几十秒。可以适宜使用例如东洋纺株式会社销售的kod dna聚合酶。
24.2、在上述技术方案中，所述荧光探针优选为q探针，是标记有具有因混合特定序列发生荧光淬灭这一特征的荧光色素的探针。q探针的结构参见日本专利第3437816号等，利用这一特征，就无需使用dna嵌入剂等其它插入双链核酸结构的色素，也无需使用会引起fret现象的两种探针，通过使用被一种荧光物质标记的探针，能够在不阻碍高速扩增的同时特异性地检测出目标核酸序列。
25.3、在上述技术方案中，所述试剂盒还包括内部对照引物ic
‑
f、内部对照引物ic
‑
r、内部对照探针以及内部对照模板。在优选的实施方式中，前述内部对照引物ic
‑
f例如是针对马达加斯加蜈蚣草(lagarosiphon madagascar iensis)的matk基因设计的正向引物，该正向引物的序列为5
’‑
cccggttattgtagaaattcctttctcccgtc
‑3’
(序列号34)，
26.前述内部对照引物ic
‑
r例如是针对马达加斯加蜈蚣草的matk基因设计的反向引物，该反向引物的序列为5
’‑
ccccatccaggattgtagaatttgaatcaag
‑3’
(序列号35)，
27.前述内部对照探针是将例如马达加斯加蜈蚣草的matk基因作为模板而设计的探针，该探针的序列为5
’‑
gatctattcattcgatattcc
‑3’
(序列号36)，
28.前述内部对照模板为例如马达加斯加蜈蚣草的matk基因的1个片段，序列为5
’‑
gcggttattgtagaaattcctttctcccgtccattttttcttgaagaaaaaaaagaaataccaaaatatcaaaatttacgatctattcattcgatattcccttttttagaggacaaatttttacatttaaattatgtgtctgatatagtaataccttatcctattcatctcgaaatcttgattcaaattctacaatcctggat
‑3’
(序列号37)。
29.前述马达加斯加蜈蚣草(拉丁文学名为lagarosiphon madagascariensis)为水草、有茎草，主要分布在马达加斯加。
30.4、在上述技术方案中，前述阳性对照试剂1和阳性对照试剂2均是事先设计好的、浓度及碱基序列已知的样本，和其他被检样本一起进行检测，从而验证检测结果的准确性。
31.为了达成上述目的，本发明的肺炎支原体核酸及其有无耐药基因变异的检测方法包括如下的步骤：
32.步骤1：作为检测对象，准备从痰、咽拭子、或者鼻拭子采集并且经过了预处理的被检样本；
33.步骤2：以前述被检样本中所含的核酸作为模板基因链，使用上述试剂盒进行pcr扩增反应；和
34.步骤3：使用熔解曲线解析法对前述步骤2中得到的扩增产物进行检测，利用不具有耐药基因变异的扩增产物和探针的熔解温度、与具有耐药基因变异的扩增产物和探针的熔解温度不同这一点来确认扩增产物中有无耐药基因变异。
35.1、在上述技术方案中，前述pcr扩增反应任选包含dntp，该dntp为脱氧腺苷三磷酸(datp)、脱氧胞苷三磷酸(dctp)、脱氧鸟苷三磷酸(dgtp)、脱氧胸苷三磷酸(dttp)的混合物。
36.2、在上述技术方案中，前述步骤2的pcr扩增反应的反应过程例如如下：
37.(1)在94.0℃下预变性30.0秒～2.0分钟，
38.(2)在97.0～98.0℃下变性1.0～10.0秒，
39.(3)在58.0～60.0℃下退火3.0～30.0秒，
40.(4)在63.0～68.0℃下延伸5.0～30.0秒，将(2)～(4)的步骤循环50～70次(优选例如60次)。
41.3、在上述技术方案中，熔解曲线解析可以为基于高分辨率熔解曲线(high
‑
resolution melt、hrm)分析技术的解析。前述高分辨率熔解曲线分析是近几年来在国外兴起的一种用于变异扫描和基因分型的最新遗传学分析方法，是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态的熔解曲线的基因分析新技术，具有高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测基因座的局限。
42.本发明的设计原理如下。本发明的试剂盒使用pcr熔解曲线法检测肺炎支原体核酸的23s rrna基因及其第2063或者2064基因座是否发生变异。其检验原理分为两个部分，一部分为利用实时荧光定量pcr技术，以肺炎支原体的23s rrna基因领域为目标模板基因链，加入肺炎支原体特异性扩增引物，进行变性、退火，利用可高速扩增的kod dna聚合酶催化各引物而使基因链延伸。这时，dntp底物、镁离子的酶活性作用于进行退火的引物并延伸，反复进行，由此扩增目标基因链。之后，扩增出的目标基因链与特异性配对的肺炎支原体荧光探针(该探针能够快速简便地检测)发生杂交，引起荧光变化，由此检测是否存在肺炎支原体。另一部分为利用野生型肺炎支原体核酸与该基因第2063或2064基因座有变异时的熔解温度不同这一点，通过检测荧光变化来绘制其熔解曲线的方法，从而确定肺炎支原体23s rrna基因的第2063或2064基因座是否发生变异。此外，以上反应体系中还加入了内部对照样本，可以了解临床样本的妨碍物质对pcr反应的影响，进一步防止肺炎支原体检测的假阴性。
43.在特定的实施方式中，使用全自动核酸纯化/荧光pcr分析仪进行pcr扩增、与肺炎支原体的特异性荧光探针的杂交后，检测其荧光变化。装置的软件系统自动实时对荧光强度进行监测，计算实时荧光变化量，从而绘制熔解曲线，得到未知样本的荧光微分值以及熔解温度，从而实现对未知样本的检测。
44.本发明的肺炎支原体核酸及其耐药基因变异的检测试剂盒(pcr熔解曲线法)用于在体外利用pcr扩增法定性地检测痰、咽拭子样本或鼻拭子样本中的肺炎支原体23s rrna基因及其抗药变异，适用于肺炎支原体感染的辅助诊断。利用全自动核酸纯化/荧光pcr分析仪(优选genecube(注册商标))检测肺炎支原体的23s rrna基因及其第2063或2064基因座的变异能够辅助临床医师决定治疗肺炎支原体的最佳治疗方案，临床医师可据此决定适合患者的药物、剂量及经济的治疗方案，为临床合理用药、个体化用药和治疗提供强有力的手段。
45.发明的效果
46.本发明的有益的效果如下所述。
47.(1)根据本发明，通过使用kod dna聚合酶、引物mpn
‑
f、引物mpn
‑
r、及特异性标记荧光探针的组合，能够有效地扩增肺炎支原体核酸23s rrna，能够区别其野生型和变异型地高灵敏度地检测。
48.(2)以往的pcr反应体系通常需要40μl的量，本发明的荧光定量pcr扩增反应体系的量最低仅为13.2μl。
49.(3)本发明的荧光定量pcr扩增反应时间大幅缩短，能够在最低40分钟内完成60次变性、退火、延伸的循环。
50.(4)以往的肺炎支原体核酸的耐药基因变异的检测试剂盒需要在
‑
20℃的条件下保存，本发明的试剂盒可以在2～8℃的条件下保存。
51.(5)本发明采用完全密封的pcr扩增，能够防止残余污染(carry
‑
over)等造成的假阳性结果。
52.(6)本发明的阳性对照样本实质是事先设计好的、浓度及碱基序列已知的样本，和其他被检样本(例如咽拭子样本)一起利用相关的肺炎支原体核酸及其耐药基因变异的检测试剂盒进行检测，从而验证被检样本的检测结果的准确性。也就是说，在利用肺炎支原体核酸及其耐药基因变异的检测试剂盒检测被检样本时，本发明的阳性对照样本相当于浓度已知的阳性样本，用于验证肺炎支原体核酸及其耐药基因变异的检测试剂盒的检测结果是否真实、有效，解决了肺炎支原体核酸及其耐药基因变异的品质检测问题。
53.总之，本发明的试剂盒及其检测方法通过设计特定序列的引物mpn
‑
f、引物mpn
‑
r和特异性靶向荧光探针，达成了迅速、简便且准确地检测肺炎支原体核酸、肺炎支原体核酸23s rrna基因及23s rrna上的第2063或者2064基因座的变异的目的。
附图说明
54.图1是肺炎支原体核酸阳性、23s rrna基因的第2063或者2064基因座无变异时的荧光定量pcr扩增熔解曲线图，横轴为温度、纵轴为荧光微分值。
55.图2是肺炎支原体核酸阳性、23s rrna基因的2063基因座有变异时的荧光定量pcr扩增熔解曲线图，横轴为温度、纵轴为荧光微分值。
56.图3是肺炎支原体核酸阳性、23s rrna基因的2064基因座有变异时的荧光定量pcr扩增熔解曲线图，横轴为温度、纵轴为荧光微分值。
57.图4是为肺炎支原体核酸阴性时的荧光定量pcr扩增熔解曲线图，横轴为温度、纵轴为荧光微分值。
58.图5是内部对照样本的荧光定量pcr扩增熔解曲线图，横轴为温度、纵轴为荧光微分值。
59.图6是表示引物与探针的评价试验2的结果的pcr扩增熔解曲线图。上侧的图是使用了特异性标记荧光探针qp
‑
1的结果，下侧的图是使用了特异性标记荧光探针qp
‑
2的结果。各线分别表示以各种稀释倍率使用肺炎支原体基因组模板的情况和使用纯化水作为比较例的情况(不包含模板)。
60.图7是表示引物与探针的评价试验3的结果的pcr扩增熔解曲线图。
61.图8是表示引物与探针的评价试验4的结果的pcr扩增熔解曲线图。
62.图9是表示引物与探针的评价试验5的结果的pcr扩增熔解曲线图。
具体实施方式
63.以下参照附图及实施例进一步对本发明进行说明。
64.实施例、检测肺炎支原体核酸及其有无耐药基因变异的试剂盒及检测方法
65.可以为本发明的一个检测对象的肺炎支原体核酸23s rrna基因的野生型的碱基序列为序列表中序列号33所示的碱基序列。
66.该肺炎支原体核酸及其耐药基因变异的检测试剂盒包含kod dna聚合酶、引物mpn
‑
f、引物mpn
‑
r、及特异性靶向荧光探针，
67.前述引物mpn
‑
f为由肺炎支原体核酸23s rrna基因(序列号33)的第1910号到第
2039号所示的碱基序列中的或者与其互补的碱基序列中的连续且长度为25～36个碱基的碱基序列构成的正向引物，
68.前述引物mpn
‑
r为由肺炎支原体核酸23s rrna基因(序列号33)的第2091号到第2257号所示的碱基序列中的或者与其互补的碱基序列中的连续且长度为25～36个碱基的碱基序列构成的反向引物，
69.前述特异性靶向荧光探针的特征在于，设计成由肺炎支原体核酸23srrna基因(序列号33)的第2040号到第2081号所示的碱基序列中的或者与其互补的碱基序列中的连续且长度为16～23个碱基的碱基序列构成，并且任意的末端碱基上标记有荧光色素。
70.前述引物mpn
‑
r、引物mpn
‑
f、特异性靶向荧光探针只要由如上所述的碱基序列构成就没有特别限定，从能够实现更高灵敏度的肺炎支原体核酸23s rrna基因的检测的观点出发，
71.前述引物mpn
‑
f优选为由肺炎支原体核酸23s rrna基因(序列号33)的第1988号到第2030号所示的碱基序列中的或者与其互补的碱基序列中的连续且长度为25～36个碱基的碱基序列构成的正向引物；
72.前述引物mpn
‑
r优选为由肺炎支原体核酸23s rrna基因(序列号33)的第2101号到第2140号所示的碱基序列中的或者与其互补的碱基序列中的连续且长度为25～36个碱基的碱基序列构成的反向引物；
73.前述特异性靶向荧光探针优选设计成由肺炎支原体核酸23s rrna基因(序列号33)的第2050号到第2071号中的连续且长度为16～22个碱基的碱基序列构成，并且任意的末端碱基上标记有荧光色素。
74.在特定的优选的实施方式中，
75.前述引物mpn
‑
f为由序列号1～10中的任意者所示的碱基序列或者与其互补的碱基序列构成的正向引物；
76.前述引物mpn
‑
r为由序列号11～20中的任意者所示的碱基序列或者与其互补的碱基序列构成的反向引物；
77.前述特异性靶向荧光探针使用设计成由序列号21～30中的任意者所示的碱基序列或者与其互补的碱基序列构成、并且任意的末端碱基上标记有荧光色素的探针，由此能够更可靠地实现高灵敏度的肺炎支原体核酸23s rrna基因的检测。
78.这里，由序列号1～10中的任意者所示的碱基序列构成的引物mpn
‑
f对应于肺炎支原体核酸23s rrna基因(序列号33)的第1910号到第2039号所示的碱基序列中的连续且长度为25～36个碱基的碱基序列。
79.由序列号11～20中的任意者所示的碱基序列构成的引物mpn
‑
r对应于与肺炎支原体核酸23s rrna基因(序列号33)的第2091号到第2257号所示的碱基序列互补的碱基序列中的连续且长度为25～36个碱基的碱基序列。
80.由序列号21～30中的任意者所示的碱基序列构成的前述特异性靶向荧光探针对应于肺炎支原体核酸23s rrna基因(序列号33)的第2040号到第2081号所示的碱基序列中的连续且长度为16～23个碱基的碱基序列。
81.在一个实施方式中，本发明的试剂盒还可以包含2种阳性对照试剂(阳性对照试剂1及阳性对照试剂2)。通过包含这样的阳性对照试剂，容易验证在被检样本中是否包含肺炎
支原体核酸的23s rrna基因的检测结果是否准确，能够解决肺炎支原体核酸的23s rrna基因检查的品质检测问题。
82.在特定的实施方式中，例如，前述阳性对照试剂1为以野生型肺炎支原体核酸23s rrna基因作为模板而设计的dna序列，其序列可以为5
’‑
ccatctcttgactgtctcggctatagactcggtgaaatccaggtacgggtgaagacacccgttaggcgcaacgggacggaaagaccccgtgaagctttactgtagcttaatattgatcaggacattatcatgtagagaataggtaggagcaatcgatgcaagttcgctaggacttgttgatgcgaaaggtggaatact
‑3’
(序列号38)。
83.在特定的实施方式中，例如，前述阳性对照试剂2为以在2063基因座具有变异的肺炎支原体核酸23s rrna基因作为模板而设计的dna序列，其序列可以为5
’‑
ccatctcttgactgtctcggctatagactcggtgaaatccaggtacgggtgaagacacccgttaggcgcaacgggacgggaagaccccgtgaagctttactgtagcttaatattgatcaggacattatcatgtagagaataggtaggagcaatcgatgcaagttcgctaggacttgttgatgcgaaaggtggaatact
‑3’
(序列号39)。
84.前述试剂盒还可以包含内部对照引物ic
‑
f、内部对照引物ic
‑
r、内部对照探针及内部对照模板。
85.在特定的实施方式中，前述内部对照引物ic
‑
f例如是针对马达加斯加蜈蚣草的matk基因而设计的正向引物，该正向引物的序列为5
’‑
cccggttattgtagaaattcctttctcccgtc
‑3’
(序列号34)，
86.前述内部对照引物ic
‑
r例如是针对马达加斯加蜈蚣草的matk基因而设计的反向引物，该反向引物的序列为5
’‑
ccccatccaggattgtagaatttgaatcaag
‑3’
(序列号35)，
87.前述内部对照探针例如是以马达加斯加蜈蚣草的matk基因作为模板而设计的探针，该探针的序列为5
’‑
gatctattcattcgatattcc
‑3’
(序列号36)，
88.前述内部对照模板例如是马达加斯加蜈蚣草的matk基因的1个片段，序列可以为5
’‑
gcggttattgtagaaattcctttctcccgtccattttttcttgaagaaaaaaaagaaataccaaaatatcaaaatttacgatctattcattcgatattcccttttttagaggacaaatttttacatttaaattatgtgtctgatatagtaataccttatcctattcatctcgaaatcttgattcaaattctacaatcctggat
‑3’
(序列号37)。
89.如图5所示，前述内部对照引物ic
‑
f、内部对照引物ic
‑
r、内部对照探针及内部对照模板用于检验利用前述试剂盒对肺炎支原体核酸的耐药基因的变异的检测是否真实且有效。
90.在实际的制造中，可以将前述肺炎支原体核酸及其耐药基因变异的检测试剂盒制造成包含以下的成分的试剂盒。其中，以下列举的各试剂
·
样本的名称、液体量、支数均为例示，也可以以下述以外的试剂或样本名称、液体量、支数构成试剂盒。
91.(1)聚合酶试剂[kod mix]：包含kod dna聚合酶及dntp，规格为140μl
×
1支、140μl
×
2支、140μl
×
3支或者140μl
×
6支。
[0092]
(2)引物探针试剂[mpn mix]：即，包含引物mpn
‑
f、引物mpn
‑
r及特异性靶向荧光探针的混合试剂，规格为140μl
×
1支、140μl
×
2支、140μl
×
3支或者140μl
×
6支。
[0093]
(3)阳性对照样本1[mpn pc1]：即，为阳性对照试剂1，规格为300μl
×
1支。
[0094]
(4)阳性对照样本2[mpn pc2]：即，为阳性对照试剂2，规格为300μl
×
1支。
[0095]
(5)阴性对照样本[mpn nc]：即，为不包含dna的tris
‑
hcl缓冲液，规格为300μl
×
1支。
[0096]
阳性对照试剂1及阳性对照试剂2均是构建到载体质粒上保存，原始质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司购入。质粒的构建过程如下。
[0097]
引物设计—pcr扩增—从凝胶中回收dna片段—构建载体—转化培养—阳性克隆鉴定—37℃摇床培养—质粒抽提—测序确认碱基序列。
[0098]
再利用以下的方法将抽提后的质粒制备成前述阳性对照试剂1。
[0099]
(1)稀释液的制备：加入50％配混量的纯化水
→
加入tris
‑
hcl缓冲液(ph7.6)
→
加入剩余的纯化水(涡旋振荡3次，每次5秒)
→
得到0.002mol/l的tris
‑
hcl(ph 7.6)稀释液；
[0100]
(2)野生型肺炎支原体载体质粒的预稀释：加入50％配混量的前述稀释液
→
加入野生型肺炎支原体载体质粒溶液
→
加入剩余的前述稀释液(涡旋振荡3次，每次5秒)
→
得到x拷贝/微升的野生型肺炎支原体载体质粒溶液(x表示质粒浓度的具体数值)；
[0101]
(3)阳性对照试剂1的获得：加入50％配混量的稀释液
→
加入x拷贝/微升的野生型肺炎支原体载体质粒溶液
→
加入剩余的稀释液(涡旋振荡3次，每次5秒)
→
得到阳性对照试剂1。
[0102]
再利用以下的方法将抽提后的质粒制备成前述阳性对照试剂2。
[0103]
(1)稀释液的制备：加入50％配混量的纯化水
→
加入tris
‑
hcl缓冲液(ph 7.6)
→
加入剩余的纯化水(涡旋振荡3次，每次5秒)
→
得到0.002mol/l的tris
‑
hcl(ph 7.6)稀释液；
[0104]
(2)肺炎支原体载体质粒(在23s rrna基因的2063基因座有变异)的预稀释：加入50％配混量的稀释液
→
加入肺炎支原体载体质粒(在23s rrna基因的2063基因座有变异)溶液
→
加入剩余的稀释液(涡旋振荡3次，每次5秒)
→
得到x拷贝/微升的肺炎支原体载体质粒(在23s rrna基因的2063基因座有变异)溶液；
[0105]
(3)得到阳性对照试剂2：加入50％配混量的稀释液
→
加入x拷贝/微升的肺炎支原体载体质粒(在23s rrna基因的2063基因座有变异)溶液
→
加入剩余的稀释液(涡旋振荡3次，每次5秒)
→
得到阳性对照试剂2。
[0106]
将阴性对照试剂、阳性对照试剂与被检样本一起注入而进行检测，用于评价检测过程的有效性，同时也用于监控环境。
[0107]
检测方法包括以下步骤。
[0108]
在步骤1中，作为检测对象，准备作为经由痰、咽拭子或鼻拭子采集且经过了预处理的被检样本的目标物；
[0109]
样本采集的条件如下。
[0110]
自然咳痰法：优选为晨痰，用力咳出呼吸道深部的痰，将痰直接吐入痰盒中，取1ml以上的被检体量。
[0111]
基于咽拭子的取痰法：专业医师用弯曲的舌板按压舌的后方，将拭子伸入咽部，转动拭子取出粘液，置入无菌玻璃管，密闭送检。
[0112]
基于鼻拭子的鼻拭液的取法：专业医师将弯曲的拭子插入鼻腔内部，转动拭子取出粘液，置入无菌玻璃管，密闭送检。
[0113]
关于人基因混入造成的影响，已经确认10万拷贝/次测试的人基因混入对本试剂盒的检测无影响。
[0114]
样本保存期限：在2～8℃下可以保存24小时以内，在
‑
20℃以下可以保存3个月以
内，在
‑
70℃以下可以长期保存。在使用冷冻保存的样本时应避免反复的冻融，样本应恢复到室温后再使用。运送采用加冰的保冷箱或加冰的泡沫箱进行运送。
[0115]
在步骤2中，以前述目标物为模板基因链，利用上述试剂盒，在作为优选例的以下的反应体系中进行荧光pcr扩增反应。
[0116][0117]
就上述荧光pcr扩增反应的反应体系而言，可以在不改变各成分的使用浓度的前提下使各成分的使用量为上述数值的2倍以下，即，引物mpn
‑
f的使用体积为0.03～0.3μl、引物mpn
‑
r的使用量为0.03～0.3μl、特异性靶向荧光探针的使用量为0.03～0.3μl、内部对照引物ic
‑
f的使用量为0.01～0.2μl、内部对照引物ic
‑
r的使用量为0.01～0.2μl、内部对照探针的使用量为0.01～0.2μl、内部对照模板的使用量为0.005～0.05μl、mgso4的使用量为1～4μl、dntps的使用量为1～3μl、kod dna聚合酶的使用量为0.1～1μl、kod缓冲液的使用量为1～5μl、模板的使用量为3～10μl。
[0118]
对于荧光pcr扩增反应的反应过程，优选的例子如下：
[0119]
(1)在94.0℃下预变性30.0秒～2.0分钟，
[0120]
(2)在97.0～98.0℃下变性1.0～10.0秒，
[0121]
(3)在58.0～60.0℃下退火3.0～30.0秒，
[0122]
(4)在63.0～68.0℃下延伸5.0～30.0秒，将(2)～(4)的步骤循环50～70次(优选例如60次)。
[0123]
在步骤3中，作为优选的例子，在如下的检测条件下利用高分辨率熔解曲线法进行检测。
[0124]
(1)94.0℃、30.0秒、
[0125]
(2)39.0℃、30.0秒、
[0126]
(3)40.0～75.0℃、0.09℃/秒。
[0127]
整个荧光定量pcr扩增反应直接利用全自动核酸纯化/荧光pcr分析装置(genecube(注册商标)、东洋纺株式会社制造)进行。在全自动核酸纯化/荧光pcr分析装置中放置试验所需的试剂、样本、对照样本以及相应耗材，具体如下所示。
[0128]
(1)将聚合酶试剂和引物
·
探针试剂用涡旋振荡混合5～6秒，以8000rpm离心数秒，放置于仪器的指定位置。
[0129]
(2)在若干0.5ml离心管中分别加入处理后的样本、阳性对照试剂、阴性对照试剂10μl，用涡旋振荡混合5～6秒，以8000rpm离心数秒，放置于仪器的指定位置。
[0130]
(3)将与试验试剂的数量相应的带过滤器的移液枪头、塑料毛细管杯以及管(例如八联管或十二联管)放置于仪器的指定位置。
[0131]
(4)运行全自动核酸纯化/荧光pcr分析装置，进行pcr反应。全自动核酸纯化/荧光pcr分析装置在反应结束后在显示画面上自动显示检测结果。
[0132]
在步骤4中，利用阳性判定值判定检测结果，阳性判定值的3种结果的判定依据如下所述。
[0133]
(1)如图1所示，荧光微分值≥7.5、且熔解曲线的峰值所在的熔解温度在56.1℃～64.1℃之间时，判定为肺炎支原体阳性及在23s rrna基因2063和2064基因座没有变异。
[0134]
(2)如图2及图3所示，荧光微分值≥7.5、且其熔解曲线的峰值所在的熔解温度在46.8℃～54.8℃之间时，判定为肺炎支原体阳性及在23s rrna基因2063或者2064基因座存在变异。
[0135]
(3)如图4所示，荧光微分值＜7.5、内部对照荧光微分值≥1.5、且其熔解曲线的峰值所在的熔解温度在52.0℃～62.0℃之间时，判定为肺炎支原体阴性。
[0136]
前述荧光微分值是指通过对检测的目标物的荧光强度随温度变化的值做微分求导而得到的荧光微分值。
[0137]
只有在图5的熔解曲线中内部对照荧光微分值≥1.0、且熔解曲线的峰值所在的熔解温度在42℃～68℃之间时，表明整个检测系统是正常、有效的，特别是对于判断结果为阴性时这一点尤其重要。
[0138]
(引物与探针的评价试验1)
[0139]
进而进行以下的试验，进行本发明的特定序列的引物及探针的评价。
[0140]
首先，分别利用常规方法合成以下的表1所示的引物mpn
‑
f、引物mpn
‑
r。
[0141]
[表1]
[0142][0143]
确认使用上述各引物能否进行肺炎支原体的基因组的扩增。pcr条件如下所述。
[0144]
＜pcr mix组成(每一个样品的体积)＞
[0145][0146]
(1：使用煮沸的肺炎支原体的灭活物)
[0147]
<pcr循环条件>
[0148]
94℃2分钟、
[0149]
98℃10秒
‑
60℃30秒
‑
68℃30秒(循环数30次)
[0150]
4℃(反应停止)
[0151]
将通过上述pcr反应而得到的产物供于琼脂糖电泳，利用条带的深浅评价扩增产物量。评价基准如下：
○
：可以看到深的条带，
△
：可以看到浅的条带，
×
：看不到条带。将该结果示于以下的表2。
[0152]
[表2]
[0153] mpn
‑
f1mpn
‑
f2mpn
‑
f3mpn
‑
r1
○○○
mpn
‑
r2
△△○
mpn
‑
r3
△△△
[0154]
如上述结果所示，可以确认：全部的、引物mpn
‑
f和引物mpn
‑
r的组合能够扩增肺炎支原体的基因组序列。尤其是能观察到如下的倾向：在本试验条件下，通过使用引物mpn
‑
f3作为引物mpn
‑
f、并且使用引物mpn
‑
r1作为引物mpn
‑
r，容易得到高扩增量，可知扩增量根据所使用的引物的种类而发生变化。
[0155]
(引物与探针的评价试验2)
[0156]
接着，使用由上述试验结果能够确认到能有效地扩增肺炎支原体核酸23s rrna基因的引物的组合(mpn
‑
f3与mpn
‑
r1的组合、mpn
‑
f3与mpn
‑
r2的组合)，对基于q探针法的检测进行评价。作为q探针法中使用的特异性标记荧光探针，使用以下的探针。
[0157]
[表3]
[0158][0159]
制备以下组成的肺炎支原体23s rrna基因检测试剂，利用genecube(注册商标)尝试基于q探针法的检测。pcr循环条件和熔解曲线解析条件如下所述。
[0160]
＜23s rrna基因检测试剂组成(每1个样品的体积)＞
[0161][0162]
(2：使用煮沸的肺炎支原体的灭活物。使用共计4种：稀释倍率10倍、102倍、103倍，作为比较例使用纯化水。)
[0163]
＜pcr循环条件＞
[0164]
94℃30秒
[0165]
98℃1秒
‑
60℃3秒
‑
63℃5秒(循环数50次)
[0166]
＜熔解曲线解析条件＞
[0167]
94℃30秒
[0168]
39℃30秒
[0169]
40.0～75.0℃、0.09℃/秒
[0170]
将该结果示于图6。图6上侧的图表示探针qp
‑
1的结果、图6下侧的图表示探针qp
‑
2的结果。如该结果所示，任何探针的组合均可以检测肺炎支原体。尤其是使用mpn
‑
f3与mpn
‑
r2的引物的组合时，能够确认到更强的荧光强度。
[0171]
(引物与探针的评价试验3)
[0172]
使用在前述试验例2中能够确认到强的荧光强度的mpn
‑
f3和mpn
‑
r2的引物的组合，评价能否识别肺炎支原体核酸23s rrna的野生型和变异型(a2063g)。在本试验例中，作
为特异性标记荧光探针，使用试验例2中所用的qp
‑
1。
[0173]
具体而言，制备以下组成的肺炎支原体23s rrna基因检测试剂，利用genecube(注册商标)尝试基于q探针法的检测。需要说明的是，pcr循环条件、熔解曲线解析条件与试验例2同样。
[0174]
＜23s rrna基因检测试剂组成(每1个样品的体积)＞
[0175][0176][0177]
(3：使用通过其它的评价体系判明了23s rrna基因的2063位发生了a
→
g的变异的肺炎支原体被检体或者野生型的肺炎支原体核酸23s rrna被检体)
[0178]
将该结果示于图7。如该结果所示，可以确认：通过使用本发明的引物及探针的组合，能够从峰值温度的差异区分检测出野生型和变异型的肺炎支原体核酸。已知本试验中使用的变异型(a2063g)为耐药基因变异。由此可知，通过本发明，能够区分检测出肺炎支原体核酸的野生型和抗药变异型。
[0179]
(引物与探针的评价试验4)
[0180]
以更高灵敏度的检测为目的，准备新的引物mpn
‑
r5、r6，与引物mpn
‑
f3、f4组合而尝试基于q探针法检测肺炎支原体核酸23s rrna基因。
[0181]
[表4]
[0182][0183]
制备以下组成的肺炎支原体23s rrna基因检测试剂，利用genecube(注册商标)尝试基于q探针法的检测。本试验例中，作为特异性标记荧光探针，使用试验例2中所用的探针qp
‑
1。此外，pcr循环条件与试验例1同样。
[0184]
＜23s rrna基因检测试剂组成(每1个样品的体积)＞
[0185][0186][0187]
(3：使用利用其它的评价体系判明了23s rrna基因的2063位发生了a
→
g的变异的肺炎支原体被检体或者野生型的肺炎支原体核酸23s rrna被检体)
[0188]
＜pcr循环条件＞
[0189]
94℃30秒
[0190]
97℃1秒
‑
60℃3秒
‑
63℃5秒(循环数50次)
[0191]
＜熔解曲线解析条件＞
[0192]
94℃30秒
[0193]
39℃30秒
[0194]
40.0～75.0℃、0.09℃/秒
[0195]
作为本试验结果的代表例，将组合引物mpn
‑
f4和引物mpn
‑
r6时的结果示于图8。如该结果所示，可以确认：通过使用本发明的引物及探针的组合，能够区分检测出野生型和变异型的肺炎支原体核酸。在使用其它的引物组合时也能确认到同样的结果。如果将本试验结果与上述的评价试验3的结果进行比较，则可以确认：使用本评价试验的引物组合的情况与使用评价试验3的引物组合的情况相比，荧光强度更高，能够更高灵敏度地区分检测出肺炎支原体核酸23s rrna的野生型和变异型。
[0196]
这里，在引物mpn
‑
f3与引物mpn
‑
f4之间、及引物mpn
‑
r5与引物mpn
‑
r6之间，与肺炎支原体核酸23r rrna的碱基序列进行退火的部位错开3～7个碱基的程度。由该结果可知，也可以设计成在相对于各引物mpn
‑
f或者引物mpn
‑
r于5’末端或者3’末端侧添加或者缺失数个碱基左右(例如2～8个碱基、优选3～7个碱基)的位置肺炎支原体核酸23s rrna进行退火。
[0197]
(引物与探针的评价试验5)
[0198]
进而，重新准备引物mpn
‑
f11、f12，与上述的评价试验4中使用的引物mpn
‑
r5组合而尝试基于q探针法检测肺炎支原体核酸23s rrna基因。
[0199]
[表5]
[0200][0201]
制备以下组成的肺炎支原体23s rrna基因检测试剂，利用genecube(注册商标)尝试基于q探针法的检测。在本试验例中，作为特异性标记荧光探针，使用试验例2中所用的探针qp
‑
1。此外，pcr循环条件、熔解曲线解析条件与试验例2同样。
[0202]
＜23s rrna基因检测试剂组成(每1个样品的体积)＞
[0203][0204]
(1：使用煮沸的肺炎支原体的灭活物)
[0205]
将本评价结果示于图9。这里，将组合引物mpn
‑
f11与引物mpn
‑
r5时的结果示于图9的上侧、将组合引物mpn
‑
f12与引物mpn
‑
r5时的结果示于图9的下侧。如该结果所示，可知：使用引物mpn
‑
f11、f12时，即使与引物mpn
‑
r5组合，荧光强度也低，检测灵敏度降低。引物mpn
‑
f11、mpn
‑
f12为以如下方式设计的引物mpn
‑
f：在相对于上述评价试验1中使用的引物mpn
‑
f2于5’末端侧错开约25个残基左右的位置肺炎支原体核酸23s rrna进行退火。如该结果所示，可知：为设计在与本发明的引物所对应的肺炎支原体核酸23srrna的碱基序列部位错开的位置的引物时，无法灵敏度良好地检测肺炎支原体核酸23s rrna。
[0206]
基于上述的评价结果1～5的结果，将对于区分检测肺炎支原体核酸23srrna的野生型和抗药变异型而言优选的、本发明的引物mpn
‑
f、引物mpn
‑
r、特异性标记荧光探针的碱基序列的例子示于以下的表中。
[0207]
[表6]
[0208][0209]
[表7]
[0210][0211]
[表8]
[0212]
[0213]
本发明中可以使用上述各引物mpn
‑
f、引物mpn
‑
r、特异性靶向荧光探针的任意的所有组合。此外，也可以使用包含与上述表6～8所示的各碱基序列互补的碱基序列的引物及探针的组合。
[0214]
上述实施例只不过是说明本发明的技术构思及特征，其目的在于让本领域技术人员能够了解本发明的内容并实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的主旨所作的等效改变或修饰都应涵盖在本发明的保护范围之内。