1.一种毕赤酵母工程菌株,其特征在于,所述标赤酵母工程菌株可同时表达chdaii、chia和choa基因。
2.根据权利要求1所述的毕赤酵母工程菌株的构建方法包括如下步骤:
(1)通过pcr从已有pjet转化子上扩增chdaii基因,其核苷酸序列如seqidno.1所示。
(2)通过合成得到chia和choa基因,其核苷酸序列如seqidno.2和seqidno.3所示。(3)chdaii、chia和choa基因共表达的载体以2a肽为连接,2a肽桥联寡核苷酸分别基于p2a(atnfsllkqagdveenpgp)和t2a(egrgslltcgdveenpgp)氨基酸序列合成,桥联寡核苷酸序列分别如seqidno.4所示,和seqidno.5所示,并通过程序进行dna杂合,程序参数如下:95℃–2min;70℃–10min;72℃–5min;4℃–结束。
(4)通过lcr法连接毕赤酵母工程菌的表达载体各部分dna片段,并将所得合成片段与毕赤酵母菌整合载体ppiczαc连接后转化至e.colidh5α感受态细胞中进行复制,提取e.colidh5α中的重组质粒,即得所述的毕赤酵母工程菌的表达载体。
(5)将步骤(4)所得到的毕赤酵母工程菌的表达载体通过限制性内切酶saci进行过夜酶切,继而将酶切所得的线性质粒转化至毕赤酵母菌km71h电转化感受态细胞中,从而获得一种毕赤酵母工程菌株km71h_pchit。
3.根据权利要求2所述的毕赤酵母工程菌株的构建方法,其特征在于通过lcr组装方法连接表达载体各部分dna片段,该方法具体反应体系(20μl)为:2nm每个目的基因dna片段、10nm桥接寡核苷酸、1xtaq连接酶缓冲液、5%dmso和40utaq连接酶。该组装方法具体程序参数为:首先95℃初始变性2min;接着95℃变性30sec,60℃退火2min,进行30个循环;最后55℃再延伸10min,产物置于4℃环境保存。
4.根据权利要求2所述chia和choa基因,其特征在于:其基因在合成时对基因前的α因子进行了优化,避免克隆过程中自发的同源重组的发生,α因子序列如seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8所示。
5.根据权利要求2所述的2a肽桥联寡核苷酸,其特征在于:与目标dna末端(半桥寡核苷酸)互补的桥联寡核苷酸的目标解链温度(tm)设计为50℃。
6.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母工程菌株km71h_pchit及其构建方法和应用,其特征在于,该系统在甲醇诱导下可同时表达生产几丁质酶、壳聚糖酶和几丁质脱乙酰酶,其诱导表达具体步骤为:
(1)将带目标质粒的毕赤酵母菌km71h单菌落接种至含100μg/ml博莱霉素的25mlbmgy培养基中(置于250ml带挡板的锥形瓶中),在28–30℃下,以250–300rpm转速震荡培养18h,至其od600为10-12.
(2)取步骤(1)中所得菌液至装有100mlbmgy的1000ml带挡板锥形瓶中,至其最终od600为0.2后,在28–30℃下,以250–300rpm转速震荡培养至其od600为2-3。
(3)将步骤(2)所得菌液,在1,500–3,000×g的转速下室温离心5min,得到菌体,继而将其重悬于20mlbmmy培养基中(置于100ml带挡板的锥形瓶中,用两层无菌纱布封口),并加入纯甲醇至浓度0.5%,进行诱导表达。