一种基于miR-532-5p及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法

一种基于mir
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532
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5p及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法
技术领域
1.本发明属于细胞工程以及基因工程技术领域，具体涉及一种基于mir
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5p及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法。


背景技术：

2.卵泡是哺乳动物生殖系统的核心功能单位，卵泡发育涉及神经调节、神经内分泌调节、内分泌调节以及旁分泌调节和自然分泌等一系列协调生理过程。卵泡由膜细胞、颗粒细胞和卵母细胞组成。在卵巢中，卵母细胞发育成熟的过程是在由颗粒细胞包绕的环境中完成的，临近卵母细胞的颗粒细胞具有较长的细胞质延伸，渗透到透明带中与卵母细胞膜形成间隙连接，因此颗粒细胞可以为卵母细胞的发育和成熟提供必需的小分子。颗粒细胞为卵母细胞的发育提供了充足的物理和化学条件，对支持卵母细胞发育成熟、传递内分泌即其他环境信号由至关重要的作用。因此开发调控颗粒细胞的调控方法以及产品，对了解颗粒细胞以及卵泡生理生化功能具有重要作用。
3.mirna是一类长度22nt左右的小分子绝大多数不具备编码能力的小分子rna，主要依赖于2
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8位的种子序列与编码基因的3’端非翻译区相结合，从而沉默复合靶基因发挥生物学功能。大量研究表明mirna在调控卵泡发育、闭锁等生物过程中扮演重要角色，并且在卵巢癌症等相关领域也有大量报道。然而，如何利用mirna调控卵巢颗粒细胞的增值，目前仍待研究。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足和需求，本发明的目的在于提供一种基于mir
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5p及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法。
5.为了实现上述目的，本发明提供的方案如下：
6.向卵巢颗粒细胞中转染mir
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5p基因或pak7基因。
7.作为本发明的一个实施方案，所述卵巢颗粒细胞为猪卵巢颗粒细胞。
8.作为本发明的优选方案，在进行转染时，按照lipofectamine3000试剂盒的说明书进行。
9.作为本发明的一个实施方案，所述方法还包括卵巢颗粒细胞的分离、接种和传代培养步骤。
10.作为本发明的优选方案，进行所述分离步骤时，采用如下方法：
11.1)于母猪屠宰后取出卵巢，置于pbs中清洗后，将卵巢保存在38摄氏度的生理盐水中于1小时内分离卵巢颗粒细胞；
12.2)将卵巢放到预热好的37度生理盐水中清洗干净后，用手术刀将卵巢表面每间隔1毫米均匀轻轻划破，收集卵泡液，将吸取后的卵泡液放入15ml离心管，1000rpm离心8分钟，弃上清，用预热的pbs轻轻吹打均匀清洗离心重复两次；
13.3)配制的卵巢颗粒细胞培养液为20％fbs加dmem以及1％的抗生素。
14.作为本发明的优选方案，在进行接种前，待卵巢颗粒细胞增殖到85％后，弃掉原培养基，用pbs清洗两次后用巴氏吸管加入1ml胰酶，放入37度细胞培养箱，放置2min后加入新鲜培养基终止消化，将细胞吹打下来，将悬液吸入15ml离心管；最终将细胞用培养液冲匀接种到12孔板中进行培养。
15.作为本发明的优选方案，在细胞转染前一天，将处于细胞接种至12孔培养板中，当增殖细胞密度达到35～45％时，进行转染，48小时候后收样。
16.作为本发明的优选方案，所述抗生素为青霉素、链霉素和两性霉素。
17.作为本发明的优选方案，进行所述收样时，将rna isoplus加入每个孔，裂解一分钟后反复吹打吸出，并将样品于
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80℃下保存。
18.作为本发明的优选方案，在进行转染时，细胞密度为40％。
19.本发明的有益效果：
20.本发明可以显著的调控的卵巢颗粒细胞增值，在颗粒细胞中用mir
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5p过表达试剂转染猪卵巢颗粒细胞可以显著促进颗粒细胞的增殖情况，而当转染mir
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5p的靶基因pak7后可以显著抑制mir
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5p过表达的作用，从而起到抑制猪卵巢颗粒细胞增殖的作用。
附图说明
21.图1为mir
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5p二级结构图；
22.图2为本发明的转染效率实验结果图；
23.图3为对卵巢颗粒细胞转染mimics inhibitor mimics nc，inhibitor nc加入cck试剂检测细胞增殖情况实验结果图；
24.图4为对卵巢颗粒细胞转染mimics inhibitor mimics nc，inhibitor nc检测cyclind基因表达量实验结果图；
25.图5为对卵巢颗粒细胞转染mimics inhibitor mimics nc，inhibitor nc检测cycline基因表达量实验结果图；
26.图6为使用双荧光素酶报告系统检测mir
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5p与pak7的靶标关系图；
27.图7为对卵巢颗粒细胞转染pak7 sirna干扰其表达后检测cyclind基因表达量实验结果图；
28.图8为对卵巢颗粒细胞转染pak7 sirna干扰其表达后检测p21蛋白表达量实验结果图。
具体实施方式
29.下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
30.实施例1
31.一、实验方案
32.1.猪卵巢颗粒细胞分离及培养
33.于母猪屠宰后取出卵巢，置于pbs中清洗后，将卵巢保存在38摄氏度的生理盐水中
于1小时内带回实验室分离卵巢颗粒细胞。
34.将卵巢放到预热好的37度生理盐水中清洗干净后，用手术刀将卵巢表面每间隔1毫米均匀轻轻划破，收集卵泡液，将吸取后的卵泡液放入15ml离心管，1000rpm离心8分钟，弃上清，用预热的pbs轻轻吹打均匀清洗离心重复两次。
35.配制的卵巢颗粒细胞培养液为20％fbs加dmem以及1％三抗(青霉素、链霉素和两性霉素)
36.2.细胞接种、传代、转染、收样
37.待卵巢颗粒细胞增殖到85％弃掉原培养基，用pbs清洗两次后用巴氏吸管加入1ml胰酶，放入37度细胞培养箱，2min后，加入新鲜培养基终止消化，将细胞吹打下来，将悬液吸入15ml离心管。最终将细胞用培养液冲匀接种到12孔板中进行培养。细胞转染前一天，将处于细胞接种至12孔培养板中(根据实验需求接种相应的密度)，当增殖细胞密度达到40％时，即可进行第一次转染mir
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5p基因或pak7基因，48小时候收样。收样，将rna isoplus加入每个孔，裂解一分钟后反复吹打吸出，并将样品于
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80℃保存。
38.3.细胞转染
39.待细胞密度长到40％开始转染，转染按照lipofectamine3000试剂盒的说明书进行，48小时后进行收样处理或进行后续检测。
40.二、检测方案
41.1.rna抽提及反转录
42.tripure试剂盒被用来提取组织和细胞总rna，具体步骤如下：
43.(1)组织匀浆：取50
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100mg组织在研磨中磨至粉末(边加液氮边磨)，给磨完后的样品中加入1ml的tripure。12孔c2c12细胞样品则直接在细胞培养板孔里加入1ml的tripure溶解，通过移液枪移出细胞裂解物至ep管中。
44.(2)蛋白质/rna/dna分离阶段：将加了tripure的匀浆样品在15
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30℃条件下孵育5分钟后每1ml tripure加200微升氯仿。用涡旋仪剧烈涡旋震荡使其充分裂解，随后常温下孵育2～3分钟。12,000
×
g的离心力高速冷冻离心15分钟(2
‑
8℃)。
45.(3)上述溶液离心后会得到三层水样溶液，用移液枪轻轻将最上层水样层转移到干净的ep管中。随后向其加入异丙醇的量是上述裂解液的一半量。混合的溶液上下轻轻颠倒混匀，常温孵育10分钟，离心10分钟(12,000
×
g)。这一步骤用于rna的沉淀。
46.(4)上述离心后的溶液轻轻倒掉上层悬液，加入75％的乙醇(1ml)洗涤一次。500
×
g离心5分钟。这一步骤用于rna的漂洗。
47.(5)倒掉上述离心管中的上清液，在空气中干燥几分钟。用移液枪吸取30毫升无rna酶的水溶解rna，用nanodrop nd
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2000分光光度计检测rna质量和浓度，最后保存rna(
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80℃)。
48.2.反转录pcr
49.2.1mrna反转录
50.1st strand cdna synthesis试剂盒被用来反转录mrna，具体步骤如下：
51.(1)去除基因组dna反应
52.为了保证实验的质量，在冰上进行操作，将反应试剂加入到pcr管中，瞬离混匀后
在42℃下反应2分钟。
53.(2)cdna制备
54.在上述反应pcr管中继续加入反应体系试剂。瞬离混匀。反应程序为37℃，15min；85℃,5s，反应结束后将其稀释至100ul，混匀并
‑
20℃保存。
55.2.2mirna反转录
56.按照mirna rt
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qpcr试剂盒说明书进行mirna反转录。反应液在37℃的条件下反应60min；85℃反应5min。反应结束后，稀释至100ul，混匀并分装，
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20℃保存和备用。
57.3.cck
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8实验
58.将颗粒细胞接种到96孔细胞板中，每个处理9个重复，待细胞密度40％左右，进行细胞转染，48小时后使用庄盟cck
‑
8试剂盒检测细胞上清液吸光度。
59.4.edu实验
60.(1)将卵巢颗粒细胞接种到96孔细胞板里，转染细胞后要染色的细胞孔里加入100μl edu稀释液进行反应。edu稀释液可按照edu溶液(试剂a)与细胞培养基比例为1：1000的配置，最终浓度为50μm；
61.(2)pbs在37℃水浴锅中预热，并用pbs清洗细胞1
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2次，脱色摇床洗1
‑
3次；
62.(3)每孔加入50
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100μl的4％多聚甲醛放置室温孵育，30min后丢弃甲醛，用pbs清洗3
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5次，脱色摇床摇2
‑
3次；
63.(4)每孔加入100μl现配的apollo液染色(此燃料需现配现用，500μl体系的apollo染色液配制顺序：469μl去离子水；25μl试剂b；5μl试剂c；1.5μl试剂d；5mg试剂e)，避光处理且室温、孵育30min后丢弃染液，每孔加入0.5％tritonx
‑
100 100μl，15分钟后在脱色摇床上清洗3
‑
4次；
64.(5)核燃料的配置是hochest(试剂f)与去离子水按1：100配置，每孔加入50μl核染液，避光处理且室温、孵育30min后丢弃染液，每孔加入100μl pbs洗2
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3次；
65.(6)在荧光显微镜下观察并照相。
66.5.qrt
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pcr
67.5.1mrna荧光定量
68.配制pcr反应液。混好的反应体系置于cfx96 real
‑
time pcr detection system仪器上完成。pcr反应程序分为两步。首先：预变性反应为95℃3min；其次：pcr反应为40次循环，95℃下30s，其中退火温度根据温度梯度反应结果选取最佳退火温度。pcr反应结果以β
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actin为内参来校正结果。mrna的相对表达量通过2
‑
δδct方法计算。
69.5.2mirna荧光定量
70.混好的反应体系置于cfx96 real
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time pcr仪器上完成。同时，以u6作为mirna定量的内参，采用2
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δδct方法计算mirna相对表达量。每个样本都做三次技术性重复。mirna的上游引物是mirna本身的成熟序列，而下游引物是试剂盒中提供的通用引物。
71.6.westernblot
72.6.1蛋白提取
73.1).用pbs冲洗细胞2
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3次，最后一次清洗完，倒掉pbs，用移液器尽量吸干残留液体；
74.2).加入适当体积的ripa裂解液(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)于培养板/
培养瓶内3
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5min。期间反复晃动培养板/瓶，使试剂与细胞充分接触；
75.3).用细胞刮刀将细胞刮下，转移到1.5ml离心管中；
76.4).冰上裂解30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。然后12000rpm,4℃，离心10min，收集上清，即为总蛋白溶液。
77.6.2蛋白浓度测定
78.取未变性的蛋白溶液，用bca蛋白浓度测定试剂盒检测。
79.6.3蛋白变性
80.将蛋白溶液按照4:1的比例加入5*还原型蛋白上样缓冲液，沸水浴变性15min，收入
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20℃冰箱保存备用；
81.6.4sds
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page电泳
82.1).清洗玻璃板；
83.2).制胶与上样；
84.2.1)待玻璃板自然晾干后，将一块凹玻璃板和一块平玻璃组成一对，放入制胶器，插入斜插板将玻璃板固定，检查底部是否对齐，避免漏胶；
85.2.2)根据实验需求配制不同浓度的分离胶，加入temed后立即混合均匀，将分离胶灌到适当的的高度，灌胶之前可以用梳子试一下，梳子齿距离分离胶上液面大约5
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8mm为宜。然后将纯水缓慢均匀加入到分离胶上层，直至加满。大约30min后待分离胶凝固即可倒去分离胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干；
86.2.3)按照上述配方配制5％的浓缩胶，加入temed后立即混合均匀，即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中，注意梳子下面不能有气泡。
87.2.4)等浓缩胶凝固好，取下制胶器，小心拔掉梳子，即可准备开始电泳；
88.2.5)将制胶器放入电泳槽后加足够的电泳液后上样电泳。浓缩胶电压75v，分离胶用120v。电泳至溴酚蓝里最底部大约1cm即可终止电泳，进行转膜。
89.6.5转膜
90.1).准备6张7
×
9cm的滤纸和一张大小适中的pvdf(0.45um)膜，pvdf膜在使用之前要先用甲醇活化2min；
91.2).在加有转移液的盆里放入转膜用的夹子，两块海绵垫，一支玻璃棒，滤纸和经过活化的pvdf膜；
92.3).将夹子打开，左边白色，右边为黑色，在两边各加一块海绵、三层滤纸。
93.4).小心剥下分离胶放在滤纸上，将pvdf膜置于胶上，不要有气泡，在膜上盖三张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫；
94.5).转膜条件(湿转):300ma恒流转膜半小时，转膜过程中将转膜设备放在冰水中降温。
95.6.6免疫反应
96.1).将转印完的膜放入装有tbst的孵育槽中，快速涮洗一次，然后加上的脱脂牛奶，放置脱色摇床上，室温下封闭30min；
97.2).按照抗体说明书，进行一抗稀释，配置好后，倒掉孵育槽中的封闭液，加入配置好的一抗，4℃孵育摇床过夜(摇床慢摇)；
98.3.回收一抗，用tbst快速涮洗膜三次，然后加入tbst，放置脱色摇床上快速洗脱，
每次5min，洗三次；
99.4).将二抗用tbst按照1:5000的比例进行稀释，然后加入孵育槽中，放置摇床上慢摇，室温下孵育30min；
100.5).用tbst快速涮洗膜三次，然后再加入tbst，放置脱色摇床上快速洗脱，每次5min，洗三次。
101.6.7化学发光
102.在暗室中将ecla液和eclb液两种试剂在离心管中等体积混合，在曝光匣上贴双层pe手套或者其他透明薄膜，将pvdf膜的蛋白面朝上放在曝光匣两层薄膜之间，加入混合好的ecl溶液充分反应，1
‑
2min后，去尽残液，盖上层薄膜开始压胶片。压完的胶片用显影、定影试剂进行显影和定影。根据不同的发光强度调整曝光条件。
103.6.8凝胶图像分析
104.将胶片进行扫描存档，photoshop整理去色，alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。
105.7.数据统计
106.实验数据采用spss(22.0版)进行分析。所有数据都以平均值
±
标准误(sem)表示。组间差异用单因素方差分析或t检验。组间差异的显著平准确定为p<0.05。
107.8实验结果
108.8.1mir
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5p转染效率
109.为深入探究mir
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5p在卵巢颗粒细胞发育过程中的作用，对卵巢颗粒细胞转染mir
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5p的过表达模拟物(mimics)、抑制剂(inhibitor)及阴性对照观察对卵巢颗粒细胞增殖状况的影响。过表达模拟物及抑制剂的转染显著提高或降低了mir
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5p在卵巢颗粒细胞中的表达量。
110.8.2mir
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5p对卵巢颗粒细胞增殖的影响
111.通过cck
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8细胞增殖检测试剂盒检测过表达及抑制mir
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5p对卵巢颗粒细胞增殖的影响，与对照组相比转染mir
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5p过表达显著促进细胞的增殖，抑制剂处理组则相反。
112.8.3mir
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5p对增殖标志基因的影响
113.与上述结果一致，几个细胞周期相关激酶cycline以及cyclind的表达量也随mir
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5p的表达量降低而呈现显著上调的趋势。以上结果表明，mir
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5p可能通过调控细胞周期蛋白激酶相关基因从而促进卵巢颗粒细胞增殖。
114.8.4mir
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5p靶基因的筛选
115.通过对mir
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5p在不同物种间的序列比对发现，其在人、小鼠等哺乳动物中高度保守。为更深入了解mir
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5p对卵巢颗粒细胞分化的分子调控机制，通过pictar、mirbase、targetscan三个常用靶基因预测数据库对mir
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5p的靶基因进行预测，预测结果显示mir
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5p种子序列可完全靶向结合pak7的3’utr区。
116.8.5mir
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5p与靶基因靶标关系验证
117.进一步验证pak7与mir
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5p之间的结合关系，进行了荧光素酶报告实验。如实验结果所示，mir
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5p的模拟物与wt
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pak7结合荧光素酶活性显著下降，而在mut
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pak7组中则荧光素酶活性无显著变化，进一步证明了mir
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5p与pak7的靶标关系。这些结果表
明mir
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5p通过靶向调控pak7从而促进卵巢颗粒细胞分化。
118.8.6pak7对卵巢颗粒细胞增殖的影响
119.本实验使用sirna将靶基因表达量干扰掉，使用荧光定量的方法检测干扰靶基因后对卵巢颗粒细胞增殖的影响，结果表明，干扰掉靶基因后显著促进卵巢颗粒细胞增殖,并且在蛋白质水平的到相同结果。