一种利用匍匐翦股颖原生质体观察亚细胞定位和蛋白互作的方法

本发明涉及植物原生质体技术领域，具体涉及一种利用匍匐翦股颖原生质体观察亚细胞定位和蛋白互作的方法。

背景技术：

匍匐翦股颖(agrostisstoloniferal.)是单子叶植物，属于禾本科翦股颖属，是一种重要的冷季型草坪草，匍匐翦股颖生长迅速，耐践踏，耐低修剪，绿期长，广泛应用于高尔夫球场果岭、球道及发球台以及观赏草坪等。

植物原生质体是指去除细胞壁、由质膜包被、有生活力的植物细胞。原生质体能够高效摄取外源的dna、质粒，是进行遗传转化的理想受体，在遗传育种、基因瞬时表达及蛋白的亚细胞定位等研究中具有重要地位。

植物的遗传转化体系在研究基因功能中发挥着重要作用，农杆菌介导法，基因枪法均能建立有效的基因表达系统，但基因枪法效率低，虽然农杆菌介导法的效率较高，但是无法对进行高水平特异性自发荧光的研究。原生质体瞬时转化系统成本低、效率高，常用于研究蛋白质亚细胞定位和蛋白互作。

蛋白质亚细胞定位是研究功能组学的重要内容，通常是把目标基因与荧光蛋白的n端或c端融合，使该融合蛋白在受体材料细胞中表达，进而确定目标蛋白的亚细胞定位情况。双分子荧光互补技术是将荧光蛋白拆分成可独立折叠的n端和c端两个亚基，并分别与两个待研究的目标蛋白融合表达，用于体内和体外监测蛋白质相互作用。

技术实现要素：

现有技术中还未有匍匐翦股颖原生质体瞬时转化系统，仅有的原生质体制备方法不适于后续的转化实验，本发明成功建立起用匍匐翦股颖茎和叶鞘组织制备原生质体的方法，并摸索出匍匐翦股颖原生质体的转化方法，为蛋白质亚细胞定位、蛋白互作提供了有力的工具，本发明提供的方法也可用于匍匐翦股颖其它分子机制的研究，且本发明提供的原生质体制备及转化方法对其它单子叶植物同样适用。

匍匐翦股颖原生质体的完整性及活性高低，对亚细胞定位和蛋白互作研究的成败起决定性作用。现有技术常使用匍匐翦股颖幼嫩的叶片来制备原生质体，发明人在实际实践中发现，匍匐翦股颖茎和叶鞘组织用于制备原生质体更有优势，匍匐翦股颖幼嫩叶片虽能制备出大量的原生质体，但因为叶片组织所含的叶绿体细胞器较多，在后续转化过程中，原生质体膜易受细胞器挤压而破裂，导致原生质体完整性和活性一般，用于亚细胞定位的荧光观察时，常出现较多杂色团，影响目标蛋白的亚细胞定位情况的确定，也不利于研究蛋白互作机理。

本发明的目的是提供一种利用匍匐翦股颖原生质体高效观察亚细胞定位和蛋白互作的方法。

为了实现本发明的目的，本发明第一方面提供一种匍匐翦股颖茎原生质体的制备方法，所制得的原生质体完整性高、破损率低、活力强，且原料匍匐翦股颖无需无菌培养，无需特殊养护。

在制备匍匐翦股颖的原生质体中，现有技术为了得到高浓度的原生质体，常常舍弃匍匐翦股颖的茎组织，仅使用幼嫩叶片作为原料来制备原生质体。发明人在设置不同对照试验时，发现保留匍匐翦股颖茎组织制备得到的原生质体，在亚细胞定位的荧光观察中，得到更明显的荧光观察结果。

为了进一步得到数量更多、质量更好的匍匐翦股颖茎原生质体，本发明依据积累的实验经验及匍匐翦股颖茎组织的结构特点，对匍匐翦股颖原生质体的制备方法进行优化。

具体地，一种匍匐翦股颖茎原生质体的制备方法包括以下步骤：

(1)将匍匐翦股颖茎及叶鞘组织切碎，转移到含有酶溶液的培养皿中，50-70rpm，在恒温摇床中进行避光酶解；

(2)在培养皿加入w5溶液轻摇，过滤离心得原生质体沉淀；

(3)用w5溶液清洗原生质体沉淀，得匍匐翦股颖茎原生质体。

在本发明所述的制备方法中，步骤(2)中所述离心的条件为1000-1600rpm离心2-5min。

本发明所提供的制备方法中，所述匍匐翦股颖茎及叶鞘组织来源于在营养土中生长一周的匍匐翦股颖植株。

第二方面，本发明提供目的基因转化匍匐翦股颖茎原生质体的方法，使用上述制备方法制备得到的匍匐翦股颖茎原生质体进行转化。

具体地，一种目的基因转化匍匐翦股颖茎原生质体的方法，包括以下步骤：

(1)用mmg溶液稀释匍匐翦股颖茎原生质体至2×10⁶-6×10⁶个/ml；

(2)质粒与茎原生质体混合后，立即加入40％(w/v)peg溶液混匀，暗培养；

(3)缓慢加入w5，轻柔旋转混匀，离心去除peg后，使用wi溶液重悬，在共聚焦培养皿中培养。

在本发明提供的方法中，为得到良好的转化效果，本发明所使用的wi溶液的配比为0.4-0.6m甘露醇，10-30mmkcl，2-54mmmes，ph至调节5.7-5.9，高温高压灭菌后保存备用。

在本发明提供的方法中，步骤(3)中共聚焦培养皿中培养的时间为6-16h。

在使用本发明提供的方法时，若进行亚细胞定位，需加入质粒为5-10μg；若进行双分子荧光互补，需加入质粒为10-15μg。

根据本领域技术人员的理解，本发明还要求保护上述制备方法或上述方法在研究匍匐翦股颖功能基因中的应用。

基于上述原生质体制备及转化的方法，匍匐翦股颖可以作为单子叶的模式植物，本发明提供的方法同样适用于其他植物的原生质体亚细胞定位，蛋白互作。

本发明的有益效果至少在于：

(1)本发明提供的原生质体制备方法在现有技术上进行了优化，耗时短，操作简单易行，育苗周期短，无需无菌条件，匍匐翦股颖生长1周左右即可用于原生质体制备；

(2)经fda染色验证，本发明提供的原生质体制备方法，能够获得大量高质量、高活性的匍匐翦股颖原生质体，能够满足后续转化、亚细胞定位、蛋白互作研究；

(3)本发明提供了高效、稳定的原生质体瞬时表达转化方法，首次利用匍匐翦股颖原生质体对拟南芥nyc1基因(at4g13250)和nac3(at3g29035)进行了亚细胞定位观察，验证了拟南芥nyc1和nol(at5g04900)蛋白间的互作；

(4)本发明提供的原生质体制备方法及转化方法，高效可靠，重复性好，可用于其它单子叶植物的亚细胞定位和蛋白互作研究；也为匍匐翦股颖基因功能的后续研究提供了技术支持，匍匐翦股颖可以作为单子叶的模式植物。

附图说明

图1本发明实施例1中用于原生质体制备的匍匐翦股颖植株图。

图2为本发明实施例1中切碎的匍匐翦股颖碎片图。

图3为本发明实施例1中制备得到的原生质体的显微图。

图4为本发明实施例2中利用匍匐翦股颖茎原生质体对nyc1和nac3基因进行定位的荧光显微图；其中a为定位在叶绿体上的基因nyc1的荧光显微图；b为定位在细胞核上的基因nac3的荧光显微图。

图5为本发明实施例3中，利用匍匐翦股颖茎原生质体对nyc1和nol基因互作分析的荧光显微图。

具体实施方式

以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明具体实施例中，所用质粒3302y3-nyc1,3302y3-nac3,psyne-nyc1和psyce-nol；双面刀片；培养皿；45μm尼龙滤网；)血球计数板；染料fda(sigma):5mg/ml；染料dapi(sigma):1μg/ml；50ml离心管及2ml离心管均为市售可得。

实施例1原生质体制备

1、植物材料的培养

植物材料:匍匐翦股颖品种‘penn-a-4’播种在德国klasmannts1泥炭土中，培养条件为20/18℃(昼/夜)，光照16h/d，光照强度为400μmolm-2s-1。每周浇一次水，植株生长1周后即可进行原生质体制备。

2、制备原生质体所用试剂的配制

(1)酶溶液:1.5％cellulasers(sigma)，0.5％macerozymer-10(sigma)(离析酶),0.4m甘露醇(sigma)，10mmmes(sigma),ph5.7,10mmcacl2(sigma)和0.1％bsa(sigma)，无需涡旋/加热/抽滤，酶即可完全溶解，现用现配。

(2)w5溶液:154mmnacl,125mmcacl2,5mmkcl(sigma)和2mmmes，ph5.7，高温高压灭菌后，4℃保存。

3、匍匐翦股颖茎及叶鞘组织原生质体制备

(1)使用双面刀片将匍匐翦股颖茎及叶鞘组织(见图1)切成0.5mm细条(见图2)，转移到含10ml酶溶液的培养皿中，25℃，60rpm，避光酶解3h；

(2)在培养皿加入10mlw5溶液，轻摇后，使用45μm尼龙滤网将培养皿中溶液过滤在50ml离心管中，1000-1600rpm离心2-53min，得原生质体沉淀；

(3)用500μlw5溶液清洗(2)中所得原生质体沉淀2次，得匍匐翦股颖茎原生质体。

取100μl原生质体溶液加入1μl5mg/mlfda染液，室温黑暗培养10min，显微观察原生质体的密度以及活性，结果如图3。

图3结果显示，10-20株匍匐翦股颖材料(约为0.5g)，10ml酶溶液，酶解3h，能制备出大约6.25×10⁷个原生质体。原生质体显微观察发现，97％的原生质体均形状完好，无破损，fda染色后呈绿色荧光。

实验结果表明，茎和叶鞘以及完全伸展的叶片均能够有效制备原生质体。若要对预测定位在细胞核上的基因进行亚细胞定位验证，选择匍匐翦股颖的茎和叶鞘组织更为合适。

同时，本发明提供的方法制备过程操作简单，制得的原生质体的质量和活性均显著提高；并且，与现有技术相比，本发明无需无菌培养，无需特殊养护，缩短了育苗周期，进一步缩短了实验的周期。

实施例2亚细胞定位观察

本实施例使用实施例1制备得到的匍匐翦股颖茎原生质体进行亚细胞定位观察。

1、亚细胞定位观察所用试剂的配制

(1)40％(w/v)peg溶液:称取4gpeg4000(sigma),0.36g甘露醇，0.11gcacl2，定容到10ml。现用现配。

(2)mmg溶液:0.4mmannitol,15mmmgcl2(sigma),4mmmes,ph5.7，抽滤灭菌，4℃保存。

(3)wi溶液:0.5m甘露醇,20mmkcl,4mmmes,调节ph至5.7，高温高压灭菌后，4℃保存。

2、目的基因转化原生质体

(1)用mmg溶液将匍匐翦股颖茎原生质体稀释成2×10⁶个原生质体/ml；

(2)取质粒3302y3-nyc120μl于2ml离心管中，加入200μl原生质体后，立即加入220μl40％(w/v)peg溶液，轻弹离心管底部混匀，室温暗培养10-20min；质粒3302y3-nac3操作步骤同上；

(3)缓慢加入800μlw5solution，轻柔旋转混匀，100g离心3min，用1mlwi溶液重悬，转移到共聚焦培养皿培养16h；

(4)激光共聚焦观察，结果如图4。

经多次重复实验表明，原生质体转化率可达65％。图4结果显示nyc1基因位于匍匐翦股颖叶绿体中，nac3基因位于匍匐翦股颖细胞核中。证实依据本发明提供的原生质体制备及瞬时转化方法，成功利用匍匐翦股颖茎原生质体对nyc1和nac3基因进行定位。这也是首次利用匍匐翦股颖茎原生质体进行亚细胞定位观察，为匍匐翦股颖后续基因功能研究提供了技术支持。

实施例3双分子荧光互补实验

本实施例使用实施例1制备得到的匍匐翦股颖茎原生质体进行双分子荧光互补实验。

(1)用mmg溶液将匍匐翦股颖茎原生质体稀释成5×10⁶个原生质体/ml；

(2)取质粒3302y3-nyc120μl于2ml离心管中，加入200μl原生质体后，立即加入220μl40％(w/v)peg溶液，轻弹离心管底部混匀，室温暗培养10-20min；

(3)缓慢加入800μlw5solution，轻柔旋转混匀，100g离心3min，用1mlwi溶液重悬，转移到共聚焦培养皿培养13h；

(4)激光共聚焦观察，结果如图5。

图5结果显示，nyc1和nol基因在叶绿体中发生互作，证实本发明提供的原生质体制备与瞬时转化方法能够用于蛋白互作分析。这也是首次利用匍匐翦股颖茎原生质体进行蛋白互作分析，为匍匐翦股颖后续基因功能研究提供了技术支持。

对比例1匍匐翦股颖叶原生质体进行亚细胞定位观察

本对比例与实施例1的方法相同，不同在于，选用匍匐翦股颖幼嫩叶片进行原生质体制备，实验结果显示，幼嫩叶片能制备出约5.75×10⁶个原生质体/ml，但fda染色后发现原生质体的活性不足80％，不利于后续的转化研究。用与转化后发现，转化效率约为40％。转化效果低于茎和叶鞘组织制备的原生质体。

对比例2不同酶解条件制备所得茎原生质体的活性

本对比例与实施例1相同，使用匍匐翦股颖的茎及叶鞘组织进行原生质体制备，不同在于，本对比例在酶解时，设三个处理，处理1：真空处理30min后，室温静置酶解3-4h；处理2：真空处理30min后，30rpm酶解3-4h；处理3：不进行真空处理，60rpm酶解3-4h；酶解完成后，吸取10μl原生质体置于血球计数板上计数，处理1制备获得的原生质体量约为2.92×10⁶个原生质体/ml，处理2能制备出约5.75×10⁶个原生质体/ml，而处理3可制备出6.25×10⁷个原生质体/ml。实验结果显示，酶解过程中选用适宜的转速摇晃培养有利于原生质体的释放，而真空处理并不能有效提高原生质体的产量。

对比例3不同酶解浓度制备所得茎原生质体的活性

本对比例与实施例1相同，使用匍匐翦股颖的茎及叶鞘组织进行原生质体制备，不同在于，对两种酶设置不同的浓度梯度：纤维素酶(cellulasers)1.0％，1.5％，2.0％，2.5％；离析酶(macerozymer-10)0.25％，0.5％，0.75％，1.0％。综合比对原生质体的产量和活性，在酶配比为1.5％cellulasers和0.5％macerozymer-10时，原生质体的活性最高，约为97％，原生质体的产量能达到5.75×10⁷个原生质体/ml。若酶溶液中的酶配比低于此配比，不能有效制备原生质体，高于此配比，原生质体的活性降低。

对比例4不同原生质体浓度及活性茎原生质体的转化效率

本对比例与实施例2相同，利用匍匐翦股颖茎原生质体对nyc1和nac3基因进行定位，不同在于，本对比例中原生质体的浓度约为4×10⁵个原生质体/ml。结果显示，转化率为较低，无法观察到nyc1和nac3基因亚细胞定位的结果。

对比例5

本对比例与实施例2相同，利用匍匐翦股颖茎原生质体对nyc1和nac3基因进行定位，不同在于，原生质体制备完成后，在4℃冰箱保存24h，对原生质体进行fda染色，并进行转化。

fda染色后发现仅有45％的原生质体形状完好，呈强绿色荧光，原生质体转化率极低，并不能观察到nyc1和nac3基因亚细胞定位的结果。实验结果显示，原生质体最好现用现配，原生质体的活性影响着原生质体的转化效率。

综上所述，在匍匐翦股颖原生质体转化过程中，原生质体本身的状态(浓度、活性)发挥着关键的作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。