水稻OsATL17基因在调控水稻抗性中的应用

水稻osatl17基因在调控水稻抗性中的应用
技术领域
1.本发明植物基因工程技术领域，具体涉及水稻osatl17基因在调控水稻抗性中的应用。


背景技术：

2.水稻是世界上重要的粮食作物，也是研究单子叶植物功能基因组学的模式植物。在自然生长条件下水稻经常会受到非生物逆境(干旱、低温)和生物逆境(稻瘟菌、白叶枯菌)的危害。
3.中国由于地形复杂，如四川等地区，造成了灌溉困难。广东、广西、海南地区由于处在单一气团的控制下，很容易造成春旱，而长江中下游、福建、江西等地，由于受到太平洋副热带气团的控制，易造成伏旱现象，而西北地区，由于地处大陆腹地受夏季风影响甚微，伏旱、秋旱多较为严重。旱灾容易造成水稻生长受到抑制，尤其是水稻孕穗期，如果遭遇干旱，很容易造成空粒，造成严重的减产。因而，选育一些耐干旱的品种就显得尤为重要。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于为改良水稻抗性提供一种新选择。
5.本发明的技术方案是水稻osatl17基因在调控水稻抗性中的应用。
6.具体的，所述水稻osatl17基因的核苷酸序列如seq id no.17所示。
7.其中，所述调控为正调控。
8.进一步，所述抗性为抗旱性。
9.具体的，所述调控为调控水稻脯氨酸含量、可溶性糖含量或/和干旱相关基因的表达水平。
10.优选的，干旱相关基因osap37、oszip23、ospp2c68、osrab21和oserd1。
11.本发明的有益效果：本发明通过实验验证了水稻osatl17基因的功能。实验证实本发明的基因osatl17的沉默植株对干旱的耐性显著降低，预示本发明的基因osatl17的实施将能创造新型耐干旱植物，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产具有重大意义。这表明了osatl17正向调控了水稻对干旱逆境的耐性。并进一步研究发现，该调控是通过调节脯氨酸含量、可溶性糖含量和干旱相关基因的表达水平。
附图说明
12.图1、干旱处理后，osatl17的表达模式，ck为对照，drought为干旱。
13.图2、bmv:osatl17植株，对干旱的耐性降低。(a)遭受干旱和复水后，bmv:osatl17沉默植株和对照植株的表型；bmv:00就是指对照植株，也就是该基因没有沉默的植株；bmv：osatl9指的是该基因沉默的植株；左图是bmv:osatl17沉默植株和对照植株在没有遭受干旱逆境时，无任何明显差异；右图表示在遭受干旱且复水后，bmv:osatl17沉默植株与对照植株相比，恢复率下降；即多数植株都死亡了；(b)bmv:osatl17沉默植株中，osatl17基因的
沉默效率；(c)干旱逆境下，bmv:osatl17沉默植株和对照植株的失水率；(d)干旱逆境下，bmv:osatl17沉默植株和对照植株的存活率。
14.图3、bmv:osatl17沉默植株通过调控脯氨酸含量和可溶性糖的含量降低对干旱的耐性。(a)正常(normal)和干旱(drought)逆境下，bmv:osatl17沉默植株和对照植株中脯氨酸的含量；(b)正常和干旱逆境下，bmv:osatl17沉默植株和对照植株中可溶性糖的含量。
15.图4、正常(nor)和干旱(dro)逆境条件下，bmv:osatl17和对照植株中，干旱相关基因的表达情况
具体实施方式
16.下述实施例中用到的主要实验材料与方法：
17.1、植物材料
18.所采用的水稻品种为原丰早和ir64，“原丰早”用于干旱逆境处理的表达分析；ir64用于病毒诱导的基因沉默(vigs)。
19.2、主要实验试剂
20.trizol试剂购买于thermofisher，实时荧光定量pcr(qrt
‑
pcr)相关的试剂购买于takara公司。其他常规的试剂购买于北京鼎国生物技术有限责任公司。
21.3、植物种植方法
22.水稻(oryza sativa)品种原丰早经过催芽后种植在塑料营养钵(直径8cm，高10cm，每盆播种10株)，置于培养箱中培养。幼苗的生长条件是：28℃，16h光照/8h黑暗。一周龄的水稻幼苗用干旱处理。
23.水稻品种ir64将水稻种子播种于塑料营养钵中，每钵播种5株，生长温度控制在22～24℃，光周期为14h/10h。待植株生长10～14天时，用于vigs侵染实验。
24.4、实施例中用到的引物见表1。
25.表1实施例中用到的引物
26.[0027][0028]
实施例1基因的表达模式分析
[0029]
干旱胁迫采用三周龄左右的“原丰早”水稻放于空气中自然干燥，干旱处理后0、0.5、1和2h取样，液氮速冻后于
‑
80℃保存备用。
[0030]
总rna的提取采用trizol的方法，具体操作如下：取叶片在液氮中充分研(研磨要迅速，最好不要超过1分钟)；然后将研磨号的粉末装入离心管中；每使用1ml trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟；4℃，10000rpm离心10～15分钟；把水相转移到新管中并加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20～30分钟；4℃，10000rpm离心10分钟，去上清；加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀(每使用1ml至少用1ml 75％乙醇对沉淀进行洗涤)；4℃，5000rpm离心3分钟，倒出液体；室温放置晾干，根据实验需要，加入30～100μl无rnase水，溶解rna。按照takara反转录试剂盒说明先去除rna中dna的污染。然后按照试剂盒说明书进行反转录，获得相应的cdna。qrt
‑
pcr反应采用sybr green i作为反应荧光染料。反应在cfx96tm real
‑
time system(bio
‑
rad,hercules,ca,usa)仪器中进行。以水稻actin基因作为内参基因，检测osatl17基因的表达量。扩增actin基因的引物为表1中seq id no.1和seq id no.2，扩增osatl17基因的引物为表1中seq id no.3和seq id no.4。扩增体系：fast essential dna green master(2
×
)12.5μl，引物1(10μm)0.5μl，引物2(10μm)0.5μl，cdna模板0.5μl，ddh2o(双蒸水)补足至25μl。扩增程序：反应程序为95℃10min；95℃20s，60℃20s，72℃延伸20s，进行40个循环。
[0031]
osatl17基因的表达受到了干旱逆境的诱导：干旱逆境下，osatl17基因的表达受到了强烈的诱导。干旱0.5h后，osatl17基因的表达量显著增加，在干旱1h后达到了最大值，随后稍微有所下降(图1)。
[0032]
实施例2基因沉默vigs载体的构建
[0033]
水稻osatl17基因的系统座位标识码为os06g34390(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。该基因的核苷酸序列如seq id no.17所示，其编码蛋白的氨基酸序列seq id no.18所示。基因沉默表达载体bmv载体由浙江大学农业与生物技术学院宋凤鸣课题组提供。
[0034]
采用表1中seq id no.15和seq id no.16为引物，以水稻基因组dna为模板，扩增osatl17基因，并将其连接到t/a克隆载体pmd19上。经测序验证正确后，以pmd19
‑
osatl17质
粒为模板，用特异性引物seq id no.15和seq id no.16进行pcr扩增。pcr产物经l％琼脂糖胶电泳后，采用dna gel purification kit(sangon,shanghai,china)回收目标条带，用ncoi和avrⅱ(购于neb公司)双酶切目标片段和沉默载体bmv，在37℃温浴4h，酶切的体系为：4μl buffer，1.5μl ncoi，1.5μl avrⅱ，10μl bmv载体质粒或者目标片段，添加水补充至40μl。酶切后回收bmv载体质粒或者目标片段，16度t4(takara)连接酶过夜连接，连接体系为：1μl连接缓冲液，1μl t4连接酶，2μl酶切后回收的bmv载体质粒，6μl酶切后回收的目标片段。42℃热击转化大肠杆菌jm109(含50mg/l的卡那霉素的lb平板筛选)，挑取单菌落进行菌落pcr鉴定进行初筛，最终提取质粒进行测序验证，并命名为bmv:osatl17。经电击法将所述沉默表达载体bmv:osatl17转入农杆菌。挑取单菌落进行菌落pcr鉴定，选取阳性菌斑，在液体培养基中培养，获得农杆菌菌液，
‑
80℃保存备用。
[0035]
实施例3vigs沉默植株的获得
[0036]
取实施例2获得载体于
‑
80℃保存的菌株，在含有50mg/l kan的yep固体养基上28℃划线培养2～3d；挑取单克隆于含抗生素的50ml yep培养基中，250rpm，28℃培养，使菌液浓度达到od
595
为1.0，将分别含有bmv:osatl17和病毒粒子p1300m/rna1+2(该病毒粒子可帮助携带基因的病毒载体在植物体内的移动，由浙江大学农业与生物技术学院宋凤鸣课题组提供)农杆菌液等体积混合。对照组使用分别含bmv和p1300m/rna1+2的农杆菌混合液。混合后农杆菌菌液4000rpm离心10min，去上清，并用等体积的诱导缓冲液重悬，28℃培养3h后，添加100μm乙酰丁香酮(as)，0.4g/l l
‑
半胱氨酸，0.15g/l二巯基苏糖醇(dtt)，0.75mg/l硝酸银。诱导缓冲液配方：10mm 2
‑
吗啉乙磺酸(mes)，10mm mgcl2，200μm乙酰丁香酮(as)。
[0037]
将生长两周的幼苗倒置于农杆菌浸入缓冲液中，进行抽真空处理。真空压力为
‑
4000pa，侵染时间为7min。侵染完后，将缓冲液叶面喷施于幼苗，将幼苗置于24/22℃(白天/黑夜)，14h光照/10h黑暗的培养箱内培养。
[0038]
参照实施例1中的方法提取总rna样品。按照takara反转录试剂盒说明先去除rna中dna的污染。然后按照试剂盒说明书进行反转录，获得相应的cdna。qrt
‑
pcr反应采用sybr green i作为反应荧光染料。反应在cfx96tm real
‑
time system(bio
‑
rad,hercules,ca,usa)仪器中进行。用qrt
‑
pcr检测基因的沉默效率。以水稻actin基因作为内参基因，检测osatl17基因的表达量。扩增actin基因的引物为表1中seq id no.1和seq id no.2，扩增osatl17基因的引物为表1中seq id no.3和seq id no.4。扩增体系：fast essential dna green master(2
×
)12.5μl，引物1(10μm)0.5μl，引物2(10μm)0.5μl，cdna模板0.5μl，ddh2o(双蒸水)补足至25μl。扩增程序：反应程序为95℃10min；95℃20s，60℃20s，72℃延伸20s，进行40个循环。
[0039]
结果见图2b。从图中可以看出osatl17基因在bmv:osatl17沉默植株中的沉默效率约为62％。
[0040]
实施例4水稻osatl17基因在调控水稻抗性中应用
[0041]
将30天苗龄的沉默植株和对照植株同时转移到同一个容器，容器的一侧种上沉默植株，另一侧则种上对照植株，每侧至少有10个植株，设3次重复。恢复生长10天后停止浇水，10天后复水，复水后12天统计植株的存活率，生物量，脯氨酸含量和可溶性糖含量等指标。
[0042]
失水率测定：将三个月大的水稻植株充分吸水过夜，每个株系取三株水稻，每株取
5张叶片，失水前称量每张叶片的质量，然后在室温条件下放置2h、4h、7h、10h后分别称重记录，最后将所有叶片在80℃烘箱中过夜烘干；失水率为失水质量占鲜重的百分比。
[0043]
可溶性糖的测定：水稻叶片可溶性糖选用蒽酮法进行测定。取水稻叶片0.5g，经液氮研磨充分，放于加有10ml无菌水的试管中，沸水浴煮沸20min，静置冷却后离心10min(4000rpm)，取1ml上清液加入含有5ml蒽酮试剂的洁净试管中，沸水浴煮沸10min，静置冷却，取上清在620nm波长处测定吸光值，并根据标准曲线算得可溶性糖数值(x)。水稻中可溶性糖含量(％)＝x
×
提取液体积(ml)
×
稀释倍数/[测定用样品液的体积(ml)
×
样品重量(g)
×
106]
×
100。
[0044]
脯氨酸含量的测定：称取水稻叶片组织0.5g，用液氮研磨至粉末状，然后将其转移到含5ml 3％的磺基水杨酸溶液向试管中，在沸水浴中煮沸10min(提取过程中注意要经常摇动试管)，冷却后离心10min(4000rpm)，取滤液于干净试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。吸取2ml提取液于另一干净试管中，向其中加入2ml冰醋酸和2ml 2.5％酸性茚三酮溶液，放入沸水中煮沸30min，溶液逐渐呈现红色。冷却后向其中加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置10min，取上层溶液与洁净试管中，离心5min(4000rpm)。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520nm波长处测定吸光度值。根据吸光度值从标准曲线中查的脯氨酸数值(x)，根据公式x
×
提取液总体积(ml)/样品鲜重(g)
×
测定时所用提取液体积(ml)算得水稻叶片中脯氨酸含量(μg
·
g
－1
fw)。
[0045]
bmv:osatl17沉默植株，与对照植株相比，对干旱的抗性降低：沉默植株和对照植株同时转移到同一个容器，容器的一侧种上沉默植株，另一侧则种上对照植株。恢复生长10天后停止浇水，10天后复水，观察现象。osatl17确实沉默的植株，与对照植株相比，对干旱的抗性降低。与对照植株相比，bmv:osatl17沉默植株的失水率增加，存活率下降(图2)，这些都表明osatl17正向调控对干旱的耐性。
[0046]
osatl17沉默调控了脯氨酸和可溶性糖的含量：干旱逆境下，检测bmv:osatl17沉默植株和对照植株体内的脯氨酸含量和可溶性糖含量。结果显示，干旱条件下，bmv:osatl17沉默植株体内的脯氨酸含量(图3a)和可溶性糖含量(图3b)比对照植株显著降低。这表明了osatl17沉默会降低植株体内脯氨酸含量和可溶性糖含量。
[0047]
参照实施例1中的方法提取总rna样品。按照takara反转录试剂盒说明先去除rna中dna的污染。然后按照试剂盒说明书进行反转录，获得相应的cdna。qrt
‑
pcr反应采用sybr green i作为反应荧光染料。反应在cfx96tm real
‑
time system(bio
‑
rad,hercules,ca,usa)仪器中进行。
[0048]
以水稻actin基因作为内参基因，对已报道的跟植物干旱耐受有关基因osap37、oszip23、ospp2c68、osrab21和oserd1的表达量进行检测。扩增actin的引物为表1中seq id no.1和seq id no.2，扩增osap37、oszip23、ospp2c68、osrab21和oserd1的引物为表1中seq id no.5～14。扩增体系：fast essential dna green master(2
×
)12.5μl，引物1(10μm)0.5μl，引物2(10μm)0.5μl，cdna模板0.5μl，ddh2o(双蒸水)补足至25μl。扩增程序：反应程序为95℃10min；95℃20s，60℃20s，72℃延伸20s，进行40个循环。
[0049]
如图4所示，干旱逆境条件下，bmv:osatl17沉默植株，与对照植株相比，抑制了干旱相关基因的表达情况。这些都表明了osatl17沉默降低对干旱逆境的耐性，可能是通过对干旱相关基因表达的调控来实现的。