一种重组杆状病毒及其制备方法和应用与流程

文档序号:26176650发布日期:2021-08-06 18:22阅读:424来源:国知局
一种重组杆状病毒及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种病毒及其制备方法和应用,更具体一点说,涉及一种重组杆状病毒及其制备方法和应用,涉及生物技术制药工程中的基因工程生产多肽类药物技术领域。



背景技术:

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod),别名肝蛋白,简称sod,sod是一种源于生命体的活性物质,能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质,如果人体不断地补充sod将具有抗衰老的特殊效果。超氧化物歧化酶是1938年首次从牛红血球中分离得到,至今对sod的研究己有多年历史,1969年正式命名为超氧化物歧化酶,sod作为一种人体内最重要的酶之一,它所起的作用是不可小视的。临床上可用sod治疗和预防急性炎症和水肿、氧中毒(预防措施,进入高压氧舱的工作人员,可预先注射sod、氧中毒治疗、自身免疫性疾病(早期治疗)、肺气肿、辐射病及辐射防护、老年性白内障等,同时还具有抗衰老的功能。nampt即烟酰胺磷酸核糖转移酶,又被成为内脏脂肪素,在体内广泛地存在于脂肪组织、肝脏、脾、肾脏等组织中,是一种多功能蛋白,参与机体内多种生理过程的调控,同时也参与调控心肌细胞的nad水平。相关实验表明,心肌细胞的nad水平随nampt的表达量而改变,nampt是心肌细胞合成nad过程的一种重要物质,它可以保护心脏避免自噬,防止动脉粥样硬化,还可抑制血管紧张素ⅱ诱导心肌肥厚。关于nampt的研究国际上目前处于初生状态,研发出高效健康安全的nampt药物,可以在心脏病等领域得到很好的应用。联合表达sod和nampt是必然趋势,也是一条可行的通路,能够用于制备有效抗衰老的药物。



技术实现要素:

本发明目的在于将nampt的目的基因与耐高温的sod目的基因共同导入家蚕杆状病毒上,用家蚕杆状病毒转染家蚕和其幼虫,将二者的目的基因在家蚕中联合表达生成新型联合蛋白,实现生产sod和nampt的新型途径。

为了实现上述目的,本发明是通过以下技术方案实现的:

一种重组超氧化物岐化酶基因的杆状病毒,杆状病毒包括超氧化物歧化酶sod基因和烟酰胺磷酸核糖转移酶nampt基因,sod基因为嗜高温菌超氧化物歧化酶sod基因。

优选的,所述sod基因的ofr序列为seqidno.1,所述seqidno.1为

atgccatttgaattgccagcattgccgtatccgtatgatgcgcttgagccgcacatcgacaaagaaacgatgaacattcaccacacgaagcaccataacacatacgttacaaatttgaatgcggcgcttgaagggcatccggatttgcaaaacaaatcgctcgaagaattgctcagcaatttggaagcccttccggaaagcattcgcacggcggtgcgcaacaacggcggcggtcatgcaaaccactcgcttttctggacgattttgtcgccaaatggcggcggtgagccgacgggtgagctggctgaggcgatcaacaaaaaattcggcagcttcaccgcgtttaaagacgagttttcgaaagcagcggccggccgtttcggttctggctgggcatggcttgtcgtgaacaacggcgagctggaaattacgagcacgccgaaccaagactcgccgatcatggaaggcaaaacgccgattctcggcttggacgtttgggagcatgcgtactacttgaaataccaaaaccgccgtccggaatacattgccgcattctggaacattgtcaactgggacgaagtggcgaaacggtacagcgaagcgaaagcgaagtaa。

优选的,所述nampt基因的ofr序列为seqidno.2,所述seqidno.2为

atgaatcctgcggcagaagccgagttcaacatcctcctggccaccgactcctacaaggttactcactataaacaatatccacccaacacaagcaaagtttattcctactttgaatgccgtgaaaagaagacagaaaactccaaattaaggaaggtgaaatatgaggaaacagtattttatgggttgcagtacattcttaataagtacttaaaaggtaaagtagtaaccaaagagaaaatccaggaagccaaagatgtctacaaagaacatttccaagatgatgtctttaatgaaaagggatggaactacattcttgagaagtatgatgggcatcttccaatagaaataaaagctgttcctgagggctttgtcattcccagaggaaatgttctcttcacggtggaaaacacagatccagagtgttactggcttacaaattggattgagactattcttgttcagtcctggtatccaatcacagtggccacaaattctagagagcagaagaaaatattggccaaatatttgttagaaacttctggtaacttagatggtctggaatacaagttacatgattttggctacagaggagtctcttcccaagagactgctggcataggagcatctgctcacttggttaacttcaaaggaacagatacagtagcaggacttgctctaattaaaaaatattatggaacgaaagatcctgttccaggctattctgttccagcagcagaacacagtaccataacagcttgggggaaagaccatgaaaaagatgcttttgaacatattgtaacacagttttcatcagtgcctgtatctgtggtcagcgatagctatgacatttataatgcgtgtgagaaaatatggggtgaagatctaagacatttaatagtatcaagaagtacacaggcaccactaataatcagacctgattctggaaaccctcttgacactgtgttaaaggttttggagattttaggtaagaagtttcctgttactgagaactcaaagggttacaagttgctgccaccttatcttagagttattcaaggggatggagtagatattaataccttacaagagattgtagaaggcatgaaacaaaaaatgtggagtattgaaaatattgccttcggttctggtggaggtttgctacagaagttgacaagagatctcttgaattgttccttcaagtgtagctatgttgtaactaatggccttgggattaacgtcttcaaggacccagttgctgatcccaacaaaaggtccaaaaagggccgattatctttacataggacgccagcagggaattttgttacactggaggaaggaaaaggagaccttgaggaatatggtcaggatcttctccatactgtcttcaagaatggcaaggtgacaaaaagctattcatttgatgaaataagaaaaaatgcacagctgaatattgaactggaagcagcacatcattag。

一种重组超氧化物岐化酶基因的杆状病毒的制备方法,通过以下方法获得:分别根据seqidno.1的ofr以及seqidno.2的ofr设计对应的引物,利用双酶切、分子克隆的方法,将sod和nampt的orf连接至同一杆状病毒载体上,构建重组载体,杆状病毒载体为pfastbacdual,杆状病毒为家蚕杆状病毒。

优选的,所述seqidno.1的引物包括上游引物seqidno.3以及下游引物seqidno.4;所述seqidno.2包括上游引物seqidno.5以及下游引物seqidno.6。

一种重组超氧化物岐化酶基因的杆状病毒感染家蚕蛹或蚕或家蚕细胞获得的重组蛋白。

一种药物,其特征在于,药物活性成分为权利要求6所述的重组蛋白。

一种蚕蛹粉,其特征在,蚕蛹粉活性成分为权利要求6所述的重组蛋白。

一种所述蚕蛹粉的制备方法,其特征在于包含以下步骤:

步骤1):将杆状病毒感染家蚕细胞,得到病毒粒子;

步骤2):将步骤1)所述的病毒粒子接种家蚕蛹,5-6天后榨汁,8000rpm离心后取上清冻干,获得蚕蛹冻干粉。

一种重组超氧化物岐化酶基因的杆状病毒以及其表达的重组蛋白在抗衰老药物方面的应用。

有益效果:联合表达sod和nampt蛋白,接种病毒感染发病的蚕蛹所表达的sod蛋白和nampt蛋白酶活比未接种病毒的蚕蛹体内所含蛋白酶活高,由此证明用家蚕联合表达sod和nampt是一条可行的通路,能够用于制备有效抗衰老的药物;抗衰老药物,以蚕蛹粉包裹,口服效果更好,无需添加其它辅料,制作工艺简单;

本发明提供的抗衰老药物,活性成分含量不高,成本低廉,但效果显著。相比于现有研究技术中大鼠口服给予50000u/kgsod血液中sod活性无明显差异相比,本发明提供的药物sod给予量为8626u/kg时效果显著;

提供的杆状病毒,感染家蚕幼虫、蛹,sod比活提高显著,其中血淋巴中sod比活提高了14倍之多,远高于现有技术,相对于现有技术提高5倍之多;

sod和nampt在体内的作用机理以并不相关,但本申请提供的蚕蛹粉和药物试验结果表明,将两种蛋白共表达sod抗氧化活性具有显著提高,抗衰老效果显著。

附图说明

图1:sod的pcr扩增;

图2:nampt的pcr扩增;

图3:重组载体pfastbacdual-sod-nampt的酶切鉴定;

图4:重组载体pfastbacdual-sod-nampt的双酶切鉴定;

图5:重组载体pfastbacdual-sod-nampt的pcr鉴定;

图6:重组穿梭载体bacmid-sod-nampt交叉pcr结果;

图7:正常的家蚕bmn;

图8:发病的家蚕bmn;

图9:重组病毒粒子pcr鉴定。

具体实施方式

以下结合说明书附图,对本发明作进一步说明,但本发明并不局限于以下实施例。

本发明提供的重组杆状病毒制备的病毒粒子在家蚕幼虫和家蚕蛹中同时表达sod以及nampt蛋白,利用该杆状病毒制备的蚕蛹粉可显著提高老年大鼠血液中sod和gsh-px酶活水平,虽然所得蚕蛹粉中sod和nampt的蛋白含量有限,但是效果显著。

pet-28a-mnsod质粒(浙江理工大学家蚕生物反应器实验室提供)、bmdh10bac菌(浙江理工大学家蚕生物反应器实验室提供)、pfastbac-dual载体、xhoi、kpni、ecori、hindiii和bamhi、抗生素、转染试剂fugene6、血清。实验所需试剂、载体、菌种未做特殊说明均可通过市售获取。

实施例1

构建重组穿梭载体pfastbac-dual-mnsod

一、mnsod编码区引物的设计

1、选用耐高温mnsod为表达目的基因,其orf序列如下:

>mnsod

atgccatttgaattgccagcattgccgtatccgtatgatgcgcttgagccgcacatcgacaaagaaacgatgaacattcaccacacgaagcaccataacacatacgttacaaatttgaatgcggcgcttgaagggcatccggatttgcaaaacaaatcgctcgaagaattgctcagcaatttggaagcccttccggaaagcattcgcacggcggtgcgcaacaacggcggcggtcatgcaaaccactcgcttttctggacgattttgtcgccaaatggcggcggtgagccgacgggtgagctggctgaggcgatcaacaaaaaattcggcagcttcaccgcgtttaaagacgagttttcgaaagcagcggccggccgtttcggttctggctgggcatggcttgtcgtgaacaacggcgagctggaaattacgagcacgccgaaccaagactcgccgatcatggaaggcaaaacgccgattctcggcttggacgtttgggagcatgcgtactacttgaaataccaaaaccgccgtccggaatacattgccgcattctggaacattgtcaactgggacgaagtggcgaaacggtacagcgaagcgaaagcgaagtaa;

根据mnsod基因的orf设计引物,分别引入xhoi和kpni酶切位点,如下:

上游引物f(seqidno.3):cctcgagatgccatttgaattgccag(下划线为xhoi酶切位点);

下游引物r(seqidno.4):gggtaccttacttcgctttcgcttcgc(下划线为kpni酶切位点)。

2、表达的目的基因nampt的orf序列如下:

>nampt

atgaatcctgcggcagaagccgagttcaacatcctcctggccaccgactcctacaaggttactcactataaacaatatccacccaacacaagcaaagtttattcctactttgaatgccgtgaaaagaagacagaaaactccaaattaaggaaggtgaaatatgaggaaacagtattttatgggttgcagtacattcttaataagtacttaaaaggtaaagtagtaaccaaagagaaaatccaggaagccaaagatgtctacaaagaacatttccaagatgatgtctttaatgaaaagggatggaactacattcttgagaagtatgatgggcatcttccaatagaaataaaagctgttcctgagggctttgtcattcccagaggaaatgttctcttcacggtggaaaacacagatccagagtgttactggcttacaaattggattgagactattcttgttcagtcctggtatccaatcacagtggccacaaattctagagagcagaagaaaatattggccaaatatttgttagaaacttctggtaacttagatggtctggaatacaagttacatgattttggctacagaggagtctcttcccaagagactgctggcataggagcatctgctcacttggttaacttcaaaggaacagatacagtagcaggacttgctctaattaaaaaatattatggaacgaaagatcctgttccaggctattctgttccagcagcagaacacagtaccataacagcttgggggaaagaccatgaaaaagatgcttttgaacatattgtaacacagttttcatcagtgcctgtatctgtggtcagcgatagctatgacatttataatgcgtgtgagaaaatatggggtgaagatctaagacatttaatagtatcaagaagtacacaggcaccactaataatcagacctgattctggaaaccctcttgacactgtgttaaaggttttggagattttaggtaagaagtttcctgttactgagaactcaaagggttacaagttgctgccaccttatcttagagttattcaaggggatggagtagatattaataccttacaagagattgtagaaggcatgaaacaaaaaatgtggagtattgaaaatattgccttcggttctggtggaggtttgctacagaagttgacaagagatctcttgaattgttccttcaagtgtagctatgttgtaactaatggccttgggattaacgtcttcaaggacccagttgctgatcccaacaaaaggtccaaaaagggccgattatctttacataggacgccagcagggaattttgttacactggaggaaggaaaaggagaccttgaggaatatggtcaggatcttctccatactgtcttcaagaatggcaaggtgacaaaaagctattcatttgatgaaataagaaaaaatgcacagctgaatattgaactggaagcagcacatcattag

根据目的基因nampt的orf设计引物,分别引入ecori和hindⅲ酶切位点,如下:

上游引物f(seqidno.5):ggaattcatgaatcctgcggcagaag(下划线标出为ecori位点);

下游引物r:(seqidno.6)ccaagcttctaatgatgtgctgcttccag(下划线标出为hindⅲ位点)。

3、重组载体pfastbacdual-sod-nampt的构建

用pcr技术从pet-28a-mnsod质粒(浙江理工大学家蚕生物反应器实验室提供)中扩增得到耐高温sod基因orf片段(如图1),片段末端分别引入xhoi和kpni酶切位点,双酶切连接杆状病毒穿梭载体pfastbacdual,构建重组载体pfastbacdual-sod。

用pcr技术从人体肝细胞cdna中扩增获得nampt酶目的基因orf片段,并在片段两端分别引入ecori和bamhi酶切位点,同样双酶切连接构建出重组载体pfastbacdual-sod-nampt。从图1、2可知,利用pcr技术成功扩增得到sod和nampt目的基因,将构建好的重组载体pfastbacdual-sod-nampt分别进行双酶切鉴定和pcr鉴定,如图3、4、5表明,已经成功构建重组载体pfastbacdual-sod-nampt。

4、重组杆状病毒穿梭载体bmbacmid-mnsod-nampt的构建及鉴定

将重组载体pfastbacdual-sod-nampt采用专利文献cn201210037290.8中家蚕杆状病毒穿梭载体bmbacmid构建重组病毒穿梭载体bmbacmid-mnsod-nampt(构建方法如cn201210037290.8中所示),进行交叉pcr验证,如图6所示,以提取重组病毒bmbacmid-mnsod-namptdna为模板,使用不同引物对(seqidno.3+seqidno.4和seqidno.5+seqidno.6)都得到了和预期结果相符片段,说明重组杆状病毒穿梭载体bmbacmid-mnsod-nampt构建成功。

实施例2

重组bmbacmind-sod-nampt转染家蚕细胞得到病毒粒子及鉴定

将家蚕bmn细胞进行铺板培养(如图7所示)。将重组bmbacmind-sod-nampt通过fugene6转染家蚕bmn细胞家蚕bmn细胞中,5-7天后细胞漂浮,变得又大又圆(如图8所示),表明细胞发病,成功获得重组杆状病毒。离心取上清,上清为病毒液,添加mnsod和nampt的上下游引物f和r进行pcr鉴定,从图9所知,成功扩增出sod和nampt目的基因orf的条带,大小与理论一致,表明重组病毒vbmbacmind-mnsod-nampt构建成功。

实施例3

重组杆状病毒感染vbmbacmind-mnsod-nampt家蚕制备sod和nampt双联重组蛋白

1、病毒接种家蚕幼虫

将实施例2得到的重组杆状病毒液用针头蘸取接种于家蚕幼虫尾部第二节处,并每天记录接种病毒后蚕的状态,蚕刚接种病毒一天后体积变大且食量增大,随着时间的增长,蚕的食量减小,尾部变黄,变得“暴躁”且喜到处爬,显示病毒感染家蚕幼虫,幼虫发病三天后剪去前脚收集血淋巴。

2、病毒接种家蚕蛹

同样接种于蚕蛹尾部第二节处,并每天记录接种病毒后蚕蛹的状态。毒后,前两天无明显变化,第三天后随着时间的延长,蚕蛹逐渐变软,开始发病,将发病后三天(一般为接种后5-6天)蚕蛹研磨匀浆,8000rpm离心后取上清冻干,冻干粉为含有sod和nampt双联重组蛋白的蚕蛹冻干粉。

实施例4

家蚕幼虫表达双联重组蛋白sod和nampt比酶活检测

幼虫发病三天后剪去前脚收集血淋巴。用碧云天公司的bradford蛋白浓度试剂盒检测家蚕血淋巴中总蛋白浓度,根据实验方法绘制出标准曲线得到方程:y=0.4697x+0.1219,将需要检测蛋白浓度的血淋巴稀释500倍,在570nm波长下测量四组家蚕血淋巴中蛋白吸光值分别为:正常血淋巴1od值0.143、正常血淋巴2od值0.142、发脓病蚕血淋巴1od值0.261、发脓病蚕血淋巴2od值0.242,计算得出正常幼虫血淋巴蛋白浓度和发脓病幼虫血淋巴蛋白浓度。稀释500倍后根据总sod活性试剂检测盒(wst-8法)测定sod的活力单位,在450nm波长下测量吸光值如表1所示:

表1sod活性检测450nm波长吸光值

根据试剂盒公式计算方法a.抑制百分率=[(a空白对照1-a空白对照2)-(a样品-a空白对照3)]/(a空白对照1-a空白对照2)×100%;b.待测样品中sod酶活力单位=抑制百分率/(1-抑制百分率)units。计算得出正常蚕血淋巴酶活力单位:348.380u/ml,发脓病蚕血淋巴酶活力单位:808.929u/ml。正常蚕血淋巴比酶活:2.524u/mg,发脓病蚕血淋巴比酶活:36.77u/mg。结果表明,发脓病蚕的sod比酶活是正常蚕14倍。

根据人nampt酶联免疫分析试剂盒(酶免公司)检测家蚕血淋巴中的nampt比酶活,测得标准品吸光值如表2所示,其中空白孔的od值为0.055:

表2标准品测得标准品吸光值

分别以调零后标准品吸光值绘制标准品吸光度与浓度(u/l)的线性关系:y=234.96x+29.704;标准品吸光度与浓度(ng/ml)的线性关系:y=4.895x+0.6188。在450nm波长下测量家蚕血淋巴数据(如表3所示),其中空白孔od值为0.057:

表3家蚕血淋巴450nm波长吸光值

实施例5

表达双联重组蛋白sod和nampt蚕蛹冻干粉酶活检测

将发病后三天(一般为接种后5-6天)蚕蛹研磨匀浆,8000rpm离心后取上清冻干,溶解离心后以相同的方法测定上清总蛋白浓度和酶活,然后计算得出比酶活。测得正常蚕蛹样品上清总蛋白浓度:50.500mg/ml,发病蚕蛹蛋白浓度:26.500mg/ml。用相同方法测sod活力得出正常蚕蛹酶活力单位:0.677u,发病蚕蛹酶活力单位:2.286u,计算得出正常蚕蛹比酶活:6.703u/mg,发病蚕蛹比酶活:43.132u/mg。上述结果表明,发病蚕蛹的sod比酶活是正常蚕蛹比酶活的6.4倍,用蚕蛹做为生物反应器更加适合于sod的表达,以相同方法测定蚕蛹中nampt蛋白的比酶活如表4所示:

表4蚕蛹nampt蛋白的比酶活测定

由上述家蚕蚕蛹中nampt的酶活和浓度值可知,发病的家蚕蚕蛹表达的nampt的量较未发病的高。

vbmbacmid-mnsod-nampt病毒大批量接种蚕蛹,规模化表达mnsod-nampt双联蛋白。用针头蘸取病毒接种于蚕蛹尾部第二节处,并每天记录接种病毒后蚕蛹的状态。蚕蛹接种病毒后,前两天没有明显的变化,第三天后随着时间的延长,蚕蛹逐渐变软。其中有变黑的蚕蛹为细菌感染,被病毒感染不会变黑。细菌感染的发黑家蚕蛹及时清除,规模化接种蚕蛹冻干粉sod和nampt蛋白比酶活的检测。

家蚕蚕蛹规模化接种vbmbacmid-mnsod-nampt病毒经榨汁冻干成干粉后,将10mg蚕蛹冻干粉溶解在1mlpbs溶液中,用和以上相同的方法进行重组sod蛋白和nampt蛋白的比酶活测定,检测不同的蚕蛹个体重组蛋白表达的特异性。结果表明,不同批次的蚕蛹个体接种病毒相同的时间后,表达的蛋白比酶活相差不大。

实施例6

抗衰老实验

材料:实验动物22月雌性老年大鼠36只,体重400-480g;4月龄雌性大鼠12只,体重200-250g,动物饲养于哪里实验中心,实验期间自由进食进水,实验室温度为(25±4)℃。

药物与试剂:实施例3得到的含表达sod和nampt的双联蚕蛹粉(后文简称双联蚕蛹粉)、市售普通蚕蛹粉,使用时以生理盐水进行配置。超氧化物歧化酶sod试剂盒,谷胱甘肽过氧化物酶gsh-px试剂盒。

方法:将老年大鼠随机分为双联表达高剂量组、双联表达低剂量组及老年对照组,每组12只。另外选择4月大鼠作为青年对照组。大鼠灌胃按照人与动物体表面积计算,200、500mg/kg,每天灌胃一次,连续灌胃4周,对照组给予普通蚕蛹粉。在第4周末最后一次灌胃后禁食不禁水。10%乌拉坦麻醉后腹主动脉取血,在室温下静置4小时后使用4000转/分钟离心10分钟,分离血清进行sod和gsh-px的检测。

统计学分析实验数据使用spss17.0软件进行统计学分析,组间比较用单因素方差分析。

对老年大鼠血清sod和gsh-px活性的影响,老年大鼠血清的sod和gsh-px活性明显下降;4周灌胃治疗后,治疗组与老年对照组相比,大鼠血清中sod和gsh-px活性明显增强(p<0.05),见表5。

表5含重组sod和-nampt双联蚕蛹粉对老年大鼠血清sod和gsh-px活性的影响

本发明提供的重组杆状病毒制备的病毒粒子在家蚕幼虫和家蚕蛹中同时表达sod以及nampt蛋白。利用该杆状病毒制备的蚕蛹粉可显著提高老年大鼠血液中sod和gsh-px酶活水平,虽然相对于现有技术需给予的有效成分少,但抗衰老效果确显著提高。

最后,需要注意的是,本发明不限于以上实施例,还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。

发明名称:

一种重组杆状病毒及其制备方法和应用

申请人:浙江安各洛生物技术有限公司

seqidno.1为:

atgccatttgaattgccagcattgccgtatccgtatgatgcgcttgagccgcacatcgacaaagaaacgatgaacattcaccacacgaagcaccataacacatacgttacaaatttgaatgcggcgcttgaagggcatccggatttgcaaaacaaatcgctcgaagaattgctcagcaatttggaagcccttccggaaagcattcgcacggcggtgcgcaacaacggcggcggtcatgcaaaccactcgcttttctggacgattttgtcgccaaatggcggcggtgagccgacgggtgagctggctgaggcgatcaacaaaaaattcggcagcttcaccgcgtttaaagacgagttttcgaaagcagcggccggccgtttcggttctggctgggcatggcttgtcgtgaacaacggcgagctggaaattacgagcacgccgaaccaagactcgccgatcatggaaggcaaaacgccgattctcggcttggacgtttgggagcatgcgtactacttgaaataccaaaaccgccgtccggaatacattgccgcattctggaacattgtcaactgggacgaagtggcgaaacggtacagcgaagcgaaagcgaagtaa。

seqidno.2为:

atgaatcctgcggcagaagccgagttcaacatcctcctggccaccgactcctacaaggttactcactataaacaatatccacccaacacaagcaaagtttattcctactttgaatgccgtgaaaagaagacagaaaactccaaattaaggaaggtgaaatatgaggaaacagtattttatgggttgcagtacattcttaataagtacttaaaaggtaaagtagtaaccaaagagaaaatccaggaagccaaagatgtctacaaagaacatttccaagatgatgtctttaatgaaaagggatggaactacattcttgagaagtatgatgggcatcttccaatagaaataaaagctgttcctgagggctttgtcattcccagaggaaatgttctcttcacggtggaaaacacagatccagagtgttactggcttacaaattggattgagactattcttgttcagtcctggtatccaatcacagtggccacaaattctagagagcagaagaaaatattggccaaatatttgttagaaacttctggtaacttagatggtctggaatacaagttacatgattttggctacagaggagtctcttcccaagagactgctggcataggagcatctgctcacttggttaacttcaaaggaacagatacagtagcaggacttgctctaattaaaaaatattatggaacgaaagatcctgttccaggctattctgttccagcagcagaacacagtaccataacagcttgggggaaagaccatgaaaaagatgcttttgaacatattgtaacacagttttcatcagtgcctgtatctgtggtcagcgatagctatgacatttataatgcgtgtgagaaaatatggggtgaagatctaagacatttaatagtatcaagaagtacacaggcaccactaataatcagacctgattctggaaaccctcttgacactgtgttaaaggttttggagattttaggtaagaagtttcctgttactgagaactcaaagggttacaagttgctgccaccttatcttagagttattcaaggggatggagtagatattaataccttacaagagattgtagaaggcatgaaacaaaaaatgtggagtattgaaaatattgccttcggttctggtggaggtttgctacagaagttgacaagagatctcttgaattgttccttcaagtgtagctatgttgtaactaatggccttgggattaacgtcttcaaggacccagttgctgatcccaacaaaaggtccaaaaagggccgattatctttacataggacgccagcagggaattttgttacactggaggaaggaaaaggagaccttgaggaatatggtcaggatcttctccatactgtcttcaagaatggcaaggtgacaaaaagctattcatttgatgaaataagaaaaaatgcacagctgaatattgaactggaagcagcacatcattag。

上游引物f(seqidno.3):cctcgagatgccatttgaattgccag(下划线为xhoi酶切位点)。

下游引物r(seqidno.4):gggtaccttacttcgctttcgcttcgc(下划线为kpni酶切位点)。

上游引物f(seqidno.5):ggaattcatgaatcctgcggcagaag(下划线标出为ecori位点)。

下游引物r:(seqidno.6)ccaagcttctaatgatgtgctgcttccag(下划线标出为hindⅲ位点)。

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