基于关键指标提高准确性的单细胞测序方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基因测序技术，更具体涉及单细胞测序方法。

背景技术：

自1665年roberthooke第一次使用“细胞”形容机体结构以来，细胞一直都是人类密切研究的对象，尽管其种类繁多，但细胞仍是所有生命的基本单位，在生物体中起着极为重要的作用。与此同时随着计算机信息化以及测序技术的出现，特别是高通量测序技术水平的改进，测序成本的下降更是快于摩尔定律，实现了快速、高效、低成本的测序方式(xuanetal.,2013；ozsolak,2012)。基于大量细胞或组织进行分析的组学研究蓬勃发展，基因组、转录组(wangetal.,2009)、蛋白组、表型组(shendureandji,2008)等组学相继出现，慢慢展现了生命体的内在机理，从整体上初步揭示了生物体中各组织器官以及系统的内在联系。

但是人类目前对组学分析、调控的理解几乎都来自于群体层面上进行的研究，需要从大量细胞中提取足够的dna或者rna得到的结果只是一群细胞信号的平均值，或者只代表其中占大多数比例的细胞信息，很多低丰度的信息会在整体表征中丢失(shiraietal.,2014)，例如实体瘤样本中提取的总dna，50％以上来源于非癌性成纤维细胞、内皮细胞、淋巴细胞或巨噬细胞，使得癌细胞的信号可能被隐藏(navinandhicks,2011)。同时忽略了单个细胞独有的特性以及细胞间的异质性(cellheterogeneity)(kaliskyetal.,2011)，并且看似同质的细胞之间基因表达也可存在很大差异，这部分源自基因表达内在的随机性(stochastic)特征，可对细胞表型产生影响(huang,2009)，另外有些样品因为稀少或者无法再进行实验室培养，样品量不足以进行组学分析，传统的测序技术遇到了无法逾越的鸿沟。

为了解决传统测序技术的窘境，单细胞测序技术应运而生，它为辨别生物组织中各种细胞类型特征和全面揭示细胞之间基因表达的异质性提供了有力的工具(tangetal.,2011)，完美的解决了之前困扰科学研究的难题，是对传统组学研究的一次升级，从曾经的“宏观”分析进化到更精确的“微观”研究，可以比以往更全面、分辨率更高地阅读这些细胞功能蓝图。这项技术不仅有助于我们认识细胞之间的差异，还可以为我们提供一个新的比较层面，为更好地理解细胞功能和功能障碍提供了希望。但由于单个细胞中所包含的核酸信息仅仅是皮克级别，无法进行传统的测序分析，因此还需要对其中的dna或者rna进行扩增，而无论是细胞分离、核酸扩增还是数据分析这些过程中诸多因素都会导致单细胞测序结果的不准确、重复性差等问题，缺乏对测序结果进行有效评估验证的技术。因此，急需开展单细胞测序的计量技术探索研究，提高单细胞测序的稳定性，降低测序偏差，为单细胞测序的广泛应用和推广提供计量技术策略。

1990年，normaniscove课题组首次证实对单细胞进行转录组分析是可行的，他们用pcr技术实现了对cdna分子的指数级扩增。发展至今，单细胞测序技术主要流程包括单细胞分离、细胞溶解与核酸扩增、测序与数据分析这3个方面。从测序技术兴起开始，人类一直向往着对单个细胞进行深入的研究，而直到2005年才出现对单细胞进行扩增的方法。二十一世纪初期高通量测序技术崭露头角，随着2008年rna测序技术出现后，不少实验室将高通量与核酸扩增技术结合起来，对单细胞测序进行了更加精细的研究。2009年，在剑桥大学gurdon研究所工作的汤富酬就首先在《naturemethods》上发表，通过对单个小鼠卵裂球细胞转录组的分析发现了数千个基因的表达(tangetal.,2009)。2011年，通过将单细胞基因组扩增技术与高通量测序技术结合起来，单细胞全基因组测序(singlecellwholegenomesequencing,wgs)应运而生(navinetal.,2011)。期间单细胞测序技术不断开发。自2013年以来，单细胞测序技术突飞猛进，并得到认可和重视。《science》将该项技术列为最值得关注的六大领域榜首。2014年1月份，《naturemethods》将单细胞测序的应用列为2013年度最重要的方法学。随后2015年，单细胞测序技术再度登上《science》，同时单细胞组学被单独列为一个单元。同年3月，华中农业大学发表玉米单细胞基因测序文章，成为国际首篇植物单细胞全基因组测序文章(lietal.,2015)。2016年，“国际人类细胞图谱计划(humancellatlas)”被推出，成为历史上最重要的生命科学项目之一。2017年7月，《nature》特刊发布单细胞测序进入生物学时代；10月，《science》杂志特刊聚焦单细胞基因组学。各种单细胞测序技术在这一年如雨后春笋般涌现，如sci-seq单细胞组合标记测序技术、lianti单细胞全基因组线性扩增技术、dronc-seq单细胞表达谱分析技术、tscs空间单细胞测序技术、sccool-seq单细胞染色质全基因组测序等。2019年，2月《plantphysiology》杂志在线发表了来自美国密歇根大学对拟南芥根组织原生质体进行了高通量单细胞转录组测序，证实高通量单细胞测序在植物中的可行性和有效性(ryuetal.,2019)。3月，德国蒂宾根大学在《developmentcell》发表文章，绘制了单细胞精度的根细胞时空发育轨迹图谱(denyeretal.,2019)。单细胞测序技术正以其无法替代的视角在生物学领域上展露锋芒。至此单细胞测序技术从动物到植物、从单个细胞到高通量多细胞迈向了新的篇章。

与此同时各国政府对单细胞测序的关注和投入也在逐年提高。我国的nsfc、“863计划”及国家重点研发计划目前累计在单细胞测序领域资助经费约1亿元，重点资助的是单细胞测序技术的改进及其在微生物、肿瘤和生殖医学等领域的应用。英国研究理事会(rcuk)目前资助的单细胞测序相关项目共88项，经费共计4298万英镑。截至2016财年,美国联邦机构在单细胞测序相关领域共资助915个项目,累计经费5.39亿美元，重点研究单细胞测序相关工具、方法的建立,试剂与仪器设备的开发。bbcresearch有分析报告指出，2014年全球单细胞市场达5.4亿美金，预测到2020年可以增长16亿美金，复合增长率高达21％。单细胞测序从技术水平的发展到科研资金的投入都达到了十分重要的地步，因此对单细胞测序技术的评价也显得尤为重要。

随着各种各样单细胞转录组测序方法的不断涌现，方法的侧重点也各不一样，例如发现对于测序深度较低的大量细胞的转录组drop-seq表现较好，对于较少细胞的转录组scrb-seq和mars-seq较好，smart-seq2在注释或者量化较少细胞的转录组时更可取(ziegenhainetal.,2017)(图6)。同时单细胞转录组测序也暴露出了很多问题，扩增存在偏倚性，非特异性扩增，导致最终发现的基因数目偏少；建库过程中存在污染，检测灵敏度不高，技术噪音高，操作失误率高，重复性差；除mrna以外的非编码rna难以检测；由于测序分析的复杂性和繁琐性，目前很少有专门针对单细胞测序数据分析的软件和工具；而面对单细胞测序检测中噪音和不完全覆盖时，要分析细胞之间的异质性，只能通过检测更多的细胞来弥补。这大大的限制了单细胞测序的发展和医疗产业的使用。

由于单细胞测序技术操作过程相对复杂，仍有很大的提升空间，包括检测方法的灵敏度和精确性，分析内容的广泛性，分析的通量和自动化程度，以及分析软件的开发等。针对现有技术的局限性，为了更好支撑单细胞测序技术在基础科研、医疗健康以及社会经济方面越来越多的应用，因此通过计量技术研究来提高单细胞测序准确度、一致性是十分迫切且必要的。

技术实现要素：

本发明针对不同平台、测序技术缺少统一的标准、缺乏溯源性，其产生的数据质量、结果缺少有力的评价方法。因此本发明人通过研究，建立单细胞转录组测序的评价技术，并基于研究结果完成基于关键指标提高准确性的单细胞测序方法。

针对生物科学领域肿瘤细胞和干细胞等细胞异质性的单细胞转录组测序技术存在可比性和重复性差、缺乏质量控制标准的问题。首次开展单细胞转录组测序计量技术中的关键指标研究。对高通量技术、平台测序结果进行一系列指标评价，可以为单细胞转录组测序的发展提供支持和帮助。

本发明人通过研究确定了单细胞测序样本制备关键指标，包括活细胞率、细胞浓度、细胞结团率，发现细胞活性>80％，细胞浓度700-1200cells/ul，细胞直径5-40um。可继续进行后续实验。

其中，使用aopi荧光染色法检测样本，除了可以直观观察并且有荧光区分。数量、活细胞数更接近单细胞转录组测序获得的细胞数值，并且结团率数值的提供可以进一步解释单细胞测序双细胞率的问题。

因此，本发明提供一种基于关键指标提高准确性的单细胞测序方法，其特征在于，单细胞测序的样本满足下述标准：细胞活性>80％，细胞浓度700-1200cells/ul，细胞直径5-40um。

优选地，其是采用aopi荧光染色法检测样本的细胞数量和活细胞数量。

进一步，本发明人通过实验确定单细胞测序上机样本指标：cdna产量大于150ng；片段长度范围200bp～9000bp；主峰值在1000-2000之间；cdna浓度1～60ng/ul。

因而，本发明进一步优选地，上述的基于关键指标提高准确性的单细胞测序方法，其特征在于，单细胞测序上机样本满足下述标准：cdna产量大于150ng；片段长度范围200bp～9000bp；主峰值在1000-2000之间；cdna浓度1～60ng/ul。

在具体测试平台方面，本发明确定的关键指标后，其单细胞测序平台可以是10xgenomics，或bdrhapsody平台。

本发明通过研究确定单细胞转录组测序技术样本的关键指标，而通过建立细胞系对不同单细胞转录组测序平台的结果分析,进而解决单细胞转录组测序技术存在可比性和重复性差、缺乏质量控制标准的问题。因此，本发明的具有非常大的应用价值。

附图说明

图1.台盼蓝对a549染色情况。

图2.台盼蓝对nih3t3染色情况。

图3.nih3t3双荧光流式细胞分析。

图4.aopi染色对a549染色情况。

图5.a549直径分布图。

图6.aopi染色对nih3t3染色情况。

图7.nih3t3直径分布图。

图8.a549cdna扩增峰图。

图9.nih3t3cdna扩增峰图。

图10.10xgenomics单细胞cdna峰型检测。

图11.bdrhapsody单细胞cdna峰型检测。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进行详细描述以进一步阐述本发明，但并不构成对本发明的限制。

实施例1

为了确保进行单细胞转录组测序样本的一致性，首先保证单细胞转录组测序技术样本细胞的状态，利用台盼蓝、ao/pi双荧光、rnaselect绿色荧光染料和显微观察对单细胞转录组测序样本进行活细胞计数、浓度以及结团率等相关检测。随后通过单细胞测序技术smart-seq2、单细胞测序平台10xgenomics、bdrhapsody以及bulk-seq进行单细胞测序技术的研究。

1.实验方法

1.1细胞培养

向国家实验细胞资源共享服务平台(http://www.cellresource.cn/index.aspx)，中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心购买所需细胞系a549、nih3t3。将培养瓶灌满培养基，喷洒酒精用封口膜封口处理；取得细胞系后，吸取多余培养基，留5～8ml(t25培养瓶)，37℃，5％co2孵箱培养(暂时不要更换培养基)。再按下述方法进行细胞传代。

1)培养3～5天(细胞生长密度大于等于80％就可以传代培养)；

2)将培养皿中的培养液吸出(吸尽)，加3ml左右pbs冲洗细胞两次(注意不要将细胞吹打下来。用pbs洗的目的：传代细胞所用的培养基一般含有血清，而血清能影响胰酶的活性，使其失效，因此一般在加胰酶之前会用pbs洗一下，避免胰酶活性降低)；

3)加入1ml的0.25％trypsin/edta，37℃，消化3～5min(时间可以浮动，视消化效果定，在显微镜下观察,当少量细胞漂浮,贴壁的细胞层出现裂隙时，细胞变圆，没有连成一片且开始慢慢脱落下来即可终止反应)；

4)终止消化：培养瓶中加入2mldmem终止消化，用枪头冲洗培养面并反复吹吸，使细胞离散成为单细胞悬液(注意四个角落细胞)。一共3ml悬液，将细胞悬液吸到1.5ml离心管中(三管，每管1ml)，1200rpm离心5min。弃去上清液，弹一弹管壁，在离心管中加入1ml培养基；

5)将1ml细胞悬液加到培养瓶中(t25培养瓶中已经加了5ml培养基)轻摇(“8”字摇匀，摇不匀影响扩增效率。摇匀后，不要再大幅度移动培养皿)然后放37℃，5％co2培养箱中培养。

1.2细胞冻存、复苏

1)另外取一细胞悬液，1200rpm离心5min去上清，加入1ml的冻存液(20％dmso和80％pbs，现配现用)混匀；

2)先放4℃冰箱两小时，再放入-20℃冰箱两小时，然后放-80℃冰箱过夜，最后放入液氮中保存；

3)冻存复苏(应遵守慢冻快融的原则)：先将水浴锅调至37℃，将冻存的细胞从液氮中取出(盖子略微打开)，迅速放入后将细胞面浸至水面以下不断摇动至融化；

4)将解冻后的细胞液在常温条件下，1200rpm离心5min；

5)弃上清，用少量培养基将细胞悬起，将细胞悬液转移至事先加入5ml完全培养基的t-25培养瓶中。将细胞混匀后，置37℃培养箱中培养。

1.3细胞系样本处理

1.3.1细胞悬浮液制备

1)按照统一细胞代数，p5代。t75培养瓶细胞进行样本制备。待细胞生长密度达到80～90％时处理细胞。将细胞培养液吸净，用pbs冲洗细胞3次，向培养瓶中加入3ml0.05％0.25％trypsin/edta，37℃反应5min；

2)向反应结束后的培养瓶中加入6mlpbs进行终止反应，用枪吹打细胞，将细胞悬液移至15ml试管中，1200rpm离心5min；

3)弃上清，用pbs轻轻冲洗细胞2次，1200rpm离心5min；

4)弃上清，加入5ml新鲜的pbs溶液制备悬浮液，待后续细胞数量、活细胞数检测；

1.3.2台盼蓝染色检测细胞

1)取1.2.1.1制备的细胞悬液450ul加50ul新鲜配制的0.4％台盼蓝溶液，室温下染3～5min；

2)染色过的细胞材料，取一滴细胞悬液置玻片上，加盖玻片后放高倍镜下观察；

3)通过显微镜下直接计数或显微镜下拍照后计数，对细胞存活率进行比较精确的定量；

4)通过计算获得细胞活率(％)＝未染色的细胞数/观察的细胞总数×100％。

1.3.3calceinam和ethidiumhomodimer双染色流式分析法

1)componenta为4mmcalceinam溶解在dmso中；componentb为200μl体积的2mmethidiumhomodimer-1indmso/h2o1:4(v/v)中；μ

2)让所有试剂达到室温。配置一个80倍稀释的钙黄绿素母液在dmso，使用50μm工作体系(即在158uldmso中加入2ul的母液a)，工作溶液应在一天内使用；

3)取1.3.1制备的细胞悬液50ul，其中细胞数为0.1～5x10⁶个/ml。细胞可能在培养基或缓冲液中；

4)添加2μl50μm钙黄绿素和4μl2mmethidiumhomodimer-1染色剂，混合样品；

5)室温孵育15～20分钟，避光；

6)用488nm激发流式细胞术分析染色细胞，测量calcein的绿色荧光发射(1～2小时内用完)，圈门上的细胞，以排除碎片。活细胞呈绿色荧光，死细胞呈红色荧光。

7)通过计算获得活细胞比例和总细胞数量。

1.3.4aopi荧光染色检测细胞

1)取1.3.1制备的细胞悬液50ul加50ulaopi细胞活率染色液混合，轻吹打5次以上至混合均匀；

2)移液器吸取20ul染色样品匀速加入板中；

3)将样品板插入细胞荧光分析仪中；

4)在“实验”界面中点击“aopiviability”进行测量；输入实验名称(允许为空)、样品id(允许为空)、稀释比例和细胞类型；

5)点击“开始”，rigel自动测量。

1.4单个细胞样本制备

为smart-seq2法扩增进行单个细胞样本的制备，需要获取单一完整的细胞进行实验扩增：

1)将裂解液从-80℃拿出，化冻之后置于冰上，分装到200ul干净的无核酸酶的pcr管中，转录组测序每管放入4ul裂解液，注意全程使用干净无酶的移液枪和枪头；

2)取生长状态良好的细胞a549和nih3t3；

3)用pbs冲洗两次，加入1ml0.05％的胰蛋白酶消化细胞，37℃反应15min；

4)向培养瓶中加入2ml培养基终止反应，吸取混合液离心，用pbs冲洗两次；

5)梯度稀释细胞：用10mlpbs溶细胞，在8孔培养皿进行梯度稀释，每次吸取1ml上一孔的细胞溶液加入9mlpbs中，直到细胞量达到10¹～10²；

6)在显微镜下挑选细胞，原则上选取细胞形态完整、活性好的单细胞，用枪头将目的细胞从悬液中吸出，转入新的缓冲液滴，清洗一到两次，然后将分离的细胞放入裂解液中，缓冲液不要超过1ul，超量会导致影响后续扩增体系，导致扩增失败；

7)单细胞放入裂解液后，稍离心，-80℃保存，干冰运输。运输的时候要将管子放到合适的管盒中，盖好盒盖、封好，放入干冰中，以防运输过程中管子损坏；

8)将取好的3个a549细胞和3个nih3t3细胞送至公司进行smart-seq2扩增测序。

1.5单细胞转录组测序

通过样本制备获得细胞系样本1(a549)，样本2(nih3t3)和样本3(a549：nih3t3＝1:1混合样本)。分别通过10xgenomics和bdrhapsody平台进行单细胞转录组测序。

1.5.110xgenomics平台实验流程

10xgenomicschromium^tm系统的是利用独特的barcode标记不同的样品(长链dna分子/单细胞)。首先，含有barcode序列的gelbeads与样品和酶的混合物混合，然后与油表面活性剂结合形成gems(gelbead-in-emulsions，意为包裹gelbeads，样品以及酶的混合物的油滴)。收集gems流到储液器，gelbeads溶解释放barcode序列，开始对样本进行标记。将每个液滴中含有barcode信息的产物混合，构建标准测序文库。

1.5.2bdrhapsody平台实验流程

bdrhapsody^tm系统利用刚性磁珠，在微孔中进行单细胞捕获，捕获过程中。随后进行标准的建库，类似于10xgenomics。其技术原理的关键是利用自然沉降的方法，在特制的u型槽中捕获单个细胞，辅助偶联celllabel以及umi序列的刚性磁珠标记不同的样品(celllabel标记单个细胞，umi标记每个细胞内不同的rna序列)：首先，细胞悬液中的单个细胞自然沉降至u型槽中的微孔内；随后装填上样过量磁珠，确保绝大多数微孔都落入了磁珠；冲洗过量的磁珠后，绝大部分微孔中均含有单个的磁珠；磁珠回收后进行反转录与cdna扩增，最终构建标准测序文库。

1.5.3qubit3.0cdna文库定量

1)取50ml离心管，按照1:200的比例混合qubitdsdnahsreagent和qubitdsdnahsbuffer，配制qubit工作液，混合均匀后避光备用。每个样本需要200ul工作液；

2)qubitassay管，每个样品管中加入199ul工作液，2个标准品管中加入190ul工作液；

3)向2个标准品管中分别加入10ulqubitdsdnahsstandard1和qubitdsdnahsstandard2，混匀后避光放置2min。；

4)依次加1ul样品到对应样品管中，混匀后避光放置2min。打开qubit3.0仪器，选择highsensitivedsdna。先测标准品，再测样本。样本加入体积选择1ul。记录每个样本的双链dna浓度。

2结果与讨论

2.1样本制备关键参数研究

由于单细胞转录组测序平台样本细胞捕获率低、样本细胞数、或细胞率等因素严重影响最终分析结果。通过三种细胞染色方法比较，研究单细胞测序样本制备关键参数。样本分为两个细胞系a549和nih3t3以及a549和nih3t3混合样本。每组实验采取4组样本，分别编号a549-1、a549-2、a549-3、a549-4、nih3t3-1、nih3t3-2、nih3t3-3、nih3t3-4和a549+nih3t3-1、a549+nih3t3-2、a549+nih3t3-3、a549+nih3t3-4。

通过台盼蓝染色细胞结果(表1，图1、图2)，a549细胞活率99.36％，细胞浓度4.20e+05个/ml；nih3t3细胞活率99.58％，6.30e+05个/ml，部分细胞染色不明显，无法精确判断是否是死活细胞。

表1台盼蓝染色检测细胞

calceinam和ethd-1流式细胞检测细胞结果(表2，图3)，a549细胞活率99.60％，细胞浓度4.72e+05个/ml；nih3t3细胞活率99.20％，6.70e+05个/ml。

表2calceinam和ethd-1双荧光染色检测细胞

aopi荧光染色结果(表3，图4-7)，a549细胞活率97.66％，细胞浓度6.64e+05个/ml；nih3t3细胞活率95.24％，6.94e+05个/ml。细胞直径均一，集中在17～18um之间，细胞圆润。

表3aopi荧光染色检测细胞：

表4a549测序分析结果与染色结果比较

相同样本经过台盼蓝、calceinamethd-1和aopi检测后进行10xgenomic测序。结果发现a549细胞系，台盼蓝染色结果，细胞活率99.36％，理论检测活细胞数为8942；calceinamethd-1检测结果，细胞活率99.60％，理论检测活细胞数为8964。aopi染色检测结果，细胞活率97.66％，理论检测活细胞数为8789。最终10xgenomic测序分析得到细胞数量为7900。结论，台盼蓝染色，由于是人工进行细胞死活判断，部分细胞染色不明显不容易区分，导致已经死亡或者rna降解的细胞依然计做活细胞，最终转录组测序结果不一致。而使用aopi荧光染色法检测样本，除了可以直观观察并且有荧光区分。数量、活细胞数更接近单细胞转录组测序获得的细胞数值，并且结团率数值的提供可以进一步解释单细胞测序双细胞率的问题。

通过实验确立单细胞测序样本制备关键指标，包括活细胞率、细胞浓度、细胞结团率。发现细胞活性>80％，细胞浓度700-1200cells/ul，细胞直径5-40um。可继续进行后续实验。

2.2上机测序关键参数的确立

10xgenomics和bdrhapsody单细胞转录组文库，采用illuminahiseqpe150或novaseqpe150测序策略，推荐每个细胞测50,000-100,000条reads，即每个细胞测15-30m数据量。测序存在一定饱和性，适当加大测序数据量可提高基因的检出率。其中cdna质量要求(illumina测序仪)：

1)产量大于150ng；

2)片段长度范围200bp～9000bp；

3)主峰值在1000-2000之间；

4)cdna浓度1～60ng/ul。

文库要求：

1)片段大小位于400-500bp；

2)文库峰位于250bp-1500bp之间；

3)qubit浓度>＝4ng/ul。

2.2.1单细胞测序smart-seq2上机测序文库分析

取a549细胞系单细胞3个，nih3t3细胞系单细胞3个，分别进行单细胞测序(smart-seq2)。要求扩增产物片段分布在0.5kb-3.0kb之间，片段主峰分布在1.0kb-1.5kb之间(见图8.a549cdna扩增峰图；图9.nih3t3cdna扩增峰图)。

表5单细胞转录组扩增质检结果：

2.2.210xgenomics上机测序样本分析

三个样本进行10xgenomics单细胞转录组分析，cdna样本结果如表6及图10(图10.10xgenomics单细胞cdna峰型检测)。

表610xgenomicscdna样品结果

2.2.3bdrhapsody上机测序样本分析

三个样本进行bdrhapsody单细胞转录组分析，cdna样本结果表7及图11(图11.bdrhapsody单细胞cdna峰型检测)。

表7bdrhapsodycdna样品结果

目前smart-seq2样品产物片段分布弥散、主峰片段分布偏小，提示样品发生部分降解。10xgenomics和bdrhapsody扩增产物，bd平台得到的cdna活性较高，产量大，结合后续结果分析，降解比较大的单细胞转录组测序样本10xgenomics平台最终获得基因数较少，每个细胞检出基因数平均为6631个；bdrhapsody每个细胞检出基因数平均7795。得出结论，bdrhapsody平台可以获得活性和质量浓度更高的cdna，进而提高bd平台检出基因数等。

确定单细胞测序上机样本指标，cdna产量大于150ng；片段长度范围200bp～9000bp；主峰值在1000-2000之间；cdna浓度1～60ng/ul。