一种狂犬病毒的重组基因、重组假病毒及其构建方法和应用与流程

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种狂犬病毒的重组基因、重组假病毒及其构建方法和应用。

背景技术：

狂犬病(rabies)是一种由狂犬病病毒(rabiesvirus，rabv)侵犯中枢神经系统引起的传染性人畜共患疾病，主要由感染动物通过唾液以咬伤的途径来传播。在亚洲和非洲的大多数国家中，狂犬病依然是一个严重的公共卫生问题。

狂犬病主要通过接种狂犬病疫苗来进行预防干预，目前国内生产的疫苗主要来源于vero细胞培养的狂犬病病毒灭活疫苗，其次为人二倍体细胞和地鼠肾细胞来源的灭活病毒疫苗，并未有其它类型的狂犬病疫苗获批使用。狂犬病病毒灭活疫苗在细胞中的生产需要不断复制病毒以达到高滴度，在疫苗贮存和运输中都需要保持低温，这使得灭活病毒疫苗生产成本较高。使用灭活病毒疫苗用于病毒暴露后的接种，仍需要较多的接种次数及免疫剂量才能诱导机体产生足量的保护性抗体，通常使用五针法，在亚洲及非洲的不少地区，灭活病毒疫苗和免疫球蛋白的高昂费用使得病人在病毒暴露后无法及时接种或得不到适当的治疗导致死亡，其中大部分都是儿童。目前市场上的灭活病毒疫苗由于质量不一、产生中和抗体时间较长，在暴露后预防中并不能产生100％保护，接种后仍需要至少10天才能达到足够的中和抗体保护水平，在发生高度暴露后，狂犬病病毒在人体产生足量中和抗体之前仍可能进入中枢神经系统，导致病人发病死亡。

随着生物技术、基因工程等高新技术的进步，研究人员发现慢病毒载体系统可携带大片段的外源基因，感染分裂及非分裂细胞，并且人体已有的免疫抗性与其不冲突，通过纯化可以获得的滴度较高，生产安全便捷，这使得慢病毒载体在病毒载体疫苗的研发中受到广泛关注，目前已有基于慢病毒载体的hiv疫苗开展了临床试验研究。在抵抗狂犬病病毒的攻击中，早期的免疫反应和保护性对机体来说非常重要，慢病毒载体系统已被证实可以通过单次注射诱导早期且持久体液免疫应答。

但是，由于狂犬病毒传染性高，难以获得病原体，从而阻碍了对rabv的生物学研究，包括抗病毒药物研究和疫苗开发。假型病毒作为替代方法已经广泛应用于病原体的生物学特征研究，特别是对于难以在体外培养或需要较高生物安全等级设施的病毒。自1996年首次报道慢病毒载体系统以来，基于慢病毒的假型病毒已广泛用于许多鉴定病毒入胞的研究，中和抗体测定，筛选新型宿主细胞受体和抗病毒药物，以及疫苗的开发。

rabv基因组可编码5种结构蛋白(n、p、m、g、l)，n蛋白是病毒核心蛋白质，具有一定感染性。g蛋白是一种跨膜蛋白，是唯一经糖基化修饰的结构蛋白，存在于病毒囊膜的两侧，包含胞内区、跨膜区域和胞外区，在病毒表面表现为三聚体结构，是狂犬病病毒唯一暴露在病毒表面的蛋白质，也是目前发现的唯一可以刺激机体产生保护性中和抗体的表面抗原。

在疫苗研发中，如何获得具有正确空间结构的g蛋白以诱导足量保护性免疫反应是关键所在。寻找研发成本更低、注射次数更少、产生中和抗体更快、免疫原性更强的新型狂犬病疫苗是研究的热点和难点。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种狂犬病毒的重组基因、重组假病毒及其构建方法和应用，本发明的重组基因具有与天然狂犬病毒的生物学特性，可以提高假病毒免疫原性，并且制备的重组假病毒包装滴度高，可以替代天然狂犬病毒进行血清中和抗体滴度的评价。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种狂犬病毒的重组基因，所述重组基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。

本发明人在rabv-g-n基因序列(kt221113.1)g基因的基础上进行序列表达设计，将g-n基因替换慢病毒包膜载体的vsv-g基因，在表达框的起始密码子之前和终止密码子之后加入nhei和mlui酶切位点，得到如seqidno:1所示的核苷酸序列，其重组基因的氨基酸序列如seqidno:2所示。

第二方面，本发明提供了一种重组包膜质粒，含有上述的狂犬病毒的重组基因。

作为本发明所述重组包膜质粒的优选实施方式，所述重组包膜质粒选自第二代慢病毒包装系统包膜质粒。

作为本发明所述重组包膜质粒的优选实施方式，所述重组包膜质粒的构建方法包括以下步骤：

s1、将含有上述的狂犬病毒的重组基因插入至puc57载体上构成载体i；

s2、将载体i进行分别进行nhei和mlui双酶切，慢病毒包膜质粒pcmv-vsv-g进行xhoi单酶切，琼脂糖凝胶电泳分别胶回收小片段和大片段；

s3、对慢病毒包膜质粒pcmv-vsv-g酶切回收的大片段进行补平及去磷获得片段i，对载体i酶切回收的小片段进行补平获得片段ii，将片段i和片段ii连接，得克隆载体，命名为pcmv-rabv-g-n。

第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述的重组包膜质粒。

第四方面，本发明提供了一种重组假病毒的构建方法，构建方法包括以下步骤：

将上述的重组包膜质粒、慢病毒辅助质粒pspax2和含绿色荧光蛋白报告基因的慢病毒包装核心载体质粒plv-egfp共转染宿主细胞，培养收集上清，离心去细胞碎片，得重组假病毒。

作为本发明所述重组假病毒的构建方法的优选实施方式，如上述的重组包膜质粒、慢病毒辅助质粒pspax2和含绿色荧光蛋白报告基因的慢病毒包装核心载体质粒plv-egfp的摩尔比为1:3:4。

第五方面，本发明提供了上述重组假病毒的构建方法制备的重组假病毒。

本发明制备的重组假病毒为复制缺陷型病毒颗粒，感染细胞后不能复制产生子代病毒，因此传染性显著降低，在bsl2实验室中操作相对安全。

将重组基因rabv-g-n置换慢病毒包膜质粒中的vsv-g，构建重组包膜质粒，然后将重组包膜质粒与含绿色荧光蛋白报告基因的plv-egfp和pspax2共转染人胚胎肾细胞hek-293t即得到重组假病毒。本发明的重组假病毒携带rabv病毒的g-n蛋白，g蛋白是目前发现的唯一可以刺激机体产生保护性中和抗体的表面抗原，n蛋白是病毒核心蛋白质，可以提高假病毒免疫原性，该重组假病毒可以替代天然狂犬病毒进行血清中和抗体滴度的评价，并且重组假病毒包装病毒滴度高，可达3.5×10⁸tu/ml。

第六方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括上述的重组假病毒和佐剂。

本发明将重组假病毒和佐剂复合使用作用于免疫小鼠，可以使得免疫小鼠产生很高的中和抗体，可显著增强狂犬病毒疫苗的免疫原性。

作为本发明所述组合物的优选实施方式，所述佐剂为cpg-odn佐剂。

通过小鼠血清中和抗体实验，可知，本发明的重组假病毒和佐剂可以提高血清中和抗体滴度，血清中和抗体滴度在10周内都维持较高的水平。

更优选地，共转染采用磷酸钙转染法。

更优选地，磷酸钙转染法包括以下步骤：

1)将5μgplv-egfp、3.75μgpspax2、1.25μgpcmv-rabv-g-n和氯化钙共同混合均匀形成a液；500μl1×bbs形成b液；

2)将a液室温静置10min，将a液加入到b液中，轻柔颠倒混匀，室温静置20min；

3)静置后将混合液缓慢地滴加到10cm²细胞培养皿中，轻晃培养皿使其混匀，孵箱中37℃，5％co²及饱和湿度条件下继续培养。

在本发明的技术方案中，注意不能将b液加入到a液，加入的顺序错误会使溶液中的颗粒不能均匀分散，影响转染效率。

与现有技术相比，本发明具有以下的有益效果：

本发明的重组基因具有与天然狂犬病毒类型的生物学特性，可以提高重组假病毒的免疫原性，并且制备的重组假病毒包装滴度高，可以替代天然狂犬病毒进行血清中和抗体评价；同时重组假病毒加入佐剂，可使免疫小鼠产生更高的中和抗体，显著增强狂犬假病毒疫苗的免疫原性。

附图说明

图1为重组包膜质粒pcmv-rabv-g-n的构建示意图；

图2为重组包膜质粒pcmv-rabv-g-n的酶切鉴定结果图；

图3为不同质粒共转染293t细胞24h、48h的荧光图；

图4为重组假病毒免疫原性实验结果图(***：p<0.001，**：p<0.01，*：p<0.05)。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

在本发明中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、狂犬病毒的重组基因的设计与合成

在rabv-g基因序列(kt221113.1)的基础上进行g-n序列表达设计，在表达框的起始密码子之前和终止密码子之后加入nhei和mlui酶切位点，得到如seqidno:1所示的核苷酸序列。

按seqidno:1所示的核苷酸序列委托安徽通用生物技术有限公司采用基因合成仪人工合成，得到本发明狂犬病毒的重组基因，重组基因的氨基酸序列如seqidno:2所示。

实施例2、构建重组质粒和包装重组假病毒

1、重组质粒的构建：

s1、将实施例1制备的狂犬病毒的重组基因插入至puc57载体上构成载体i，将载体i命名为puc-rabv-g-n；

s2、将puc-rabv-g-n经nhei和mlui酶切后回收小片段；慢病毒包膜质粒pcmv-vsv-g(来源于赛默飞世尔科技(中国)有限公司)进行xhoi单酶切及2％琼脂糖凝胶电泳，胶回收大片段；

s3、对慢病毒包膜质粒pcmv-vsv-g酶切回收的大片段进行补平及去磷获得片段i，对puc-rabv-g-n酶切回收的小片段进行补平获得片段ii，再采用neb的t4连接酶将片段i和片段ii连接，构建重组包膜质粒，命名为pcmv-rabv-g-n(如图1所示)。将得到的克隆载体测序，其中，1-1585bp为rabv的g基因序列，2173-2262bp为rabv的n蛋白序列。其中pcmv-rabv-g-n的酶切鉴定结果如图2所示。

2、重组假病毒的包装

将pcmv-rabv-g-n、plv-egfp及pspax2(来源于赛默飞世尔科技(中国)有限公司公司生产)共转染人胚胎肾细胞hek-293t，细胞培养24h、48h后在荧光显微镜下观察可见明显绿色荧光(如图3所示)。48h后，收集细胞培养皿中的培养上清，rt-pcr测定重组假病毒滴度，pcmv-rabv-g-n组的重组假病毒滴度为3.5×10⁸tu/ml，pcmv-rabv-g组的重组假病毒滴度为4×10⁷tu/ml。

其中，共转染采用磷酸钙转染法。磷酸钙转染法包括以下步骤：

1)将5μgplv-egfp、3.75μgpspax2、1.25μgpcmv-rabv-g-n和氯化钙共同混合均匀形成a液；500μl1×bbs形成b液；

2)将a液室温静置10min，将a液加入到b液中，轻柔颠倒混匀，室温静置20min；

3)静置后将混合液缓慢地滴加到10cm²细胞培养皿中，轻晃培养皿使其混匀，孵箱中37℃，5％co²及饱和湿度条件下继续培养。

实施例3、一种组合物

一种组合物，包括上述实施例2制备的重组假病毒和佐剂，所述佐剂可以包括cpg-odn。

实施例4、重组假病毒免疫原性评价实验

本实验所用小鼠为4-6周龄spf级雌性balb/c小鼠，随机分为6组(每组6只)，注射所用的假病毒为实施例2中的重组假病毒及实验室保存的pcmv-rabv-g/plv-egfp/pspax2假病毒(三、四组)作为阳性对照，对照组的构建方法采用实施例2的构建方法。

第一组：肌肉注射pbs；

第二组：注射1×10⁷tupcmv-vsv-g/plv-egfp；

第三组：注射1×10⁷tupcmv-rabv-g/plv-egfp；

第四组：注射1×10⁷tupcmv-rabv-g/plv-egfp+cpg-odn；

第五组：注射1×10⁷tupcmv-rabv-g-n/plv-egfp；

第六组：注射1×10⁷tupcmv-rabv-g-n/plv-egfp+cpg-odn。

使用重组假病毒中和试验检测免疫后不同时期的小鼠血清中和抗体滴度，检测结果表明(如图4所示)，三、四、五组和第六组的混合物免疫后5天可检测到中和抗体水平上升，且都达到狂犬病疫苗保护单位0.5iu/ml；

第三组至第六组在免疫7天后血清中和抗体滴度上升至2iu/ml以上；pbs组及pcmv-vsv-g/plv-egfp组在各时间点中都未检测到中和抗体产生。第三组、第五组的中和抗体滴度分别在6周、10周时降至保护单位0.5iu/ml以下，而第四组和第六组的中和抗体滴度在10周时仍维持在较高水平，在实验过程中佐剂组血清中和抗体滴度显著高于无佐剂组，差异极显著；。

阳性对照组制备的重组假病毒包装滴度为4×10⁷tu/ml，而本发明的重组假病毒包装病毒滴度更高，可达3.5×10⁸，本发明的重组假病毒携带rabv病毒的g-n蛋白，g蛋白是目前发现的唯一可以刺激机体产生保护性中和抗体的表面抗原，n蛋白是病毒核心蛋白质，可以提高假病毒免疫原性，该重组假病毒可以替代天然狂犬病毒进行血清中和抗体滴度的评价，本发明的重组假病毒可用于替代商品化狂犬病毒灭活疫苗。

此外，将重组假病毒与佐剂(cpg-odn)配合使用，使得免疫小鼠可以产生更高的中和抗体，显著增强狂犬假病毒疫苗的免疫原性。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

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<110>华南生物医药研究院

<120>一种狂犬病毒的重组基因、重组假病毒及其构建方法和应用

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