一株溶藻/脱氮/除磷三效工程菌及其在处理含铜绿微囊藻污染水中的应用

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株溶藻/脱氮/除磷三效工程菌及其在处理含铜绿微囊藻污染水中的应用。

背景技术：

近年来，随着工业的迅速发展与人类活动区域的不断扩大，我国一些地区水体因工农业废水和生活污水排放引起富营养化。富营养化的水体伴随以铜绿微囊藻为主的蓝藻水华，造成水体污染，水生生物死亡，散发出腥臭味。如何解决每年因氮、磷过量而爆发的蓝藻水华是环保工作者一直努力期望解决而又没有解决的难题。在利用物理、化学仍至生物（鱼类、水生动植物）等常规方法治理蓝藻水华存在诸多限制的情况下，利用微生物法控藻是国内外众多学者一直努力攻克的研究方向。

利用溶藻微生物控藻国内外学者有众多研究报告，然而现阶段分离筛选溶藻菌的方法，主要是利用存活于蓝藻水域的植物、动物经筛选出的溶藻菌。该方法往往只能让菌株只具备溶藻特性，而通过溶藻菌去处理蓝藻问题往往伴随氮、磷的释放，使原本富营养化的环境水体程度加重，因此寻找一种既具有溶藻功效又能同步脱氮、除磷的菌株成为溶藻微生物控藻问题之关键。

目前，原生质体融合在微生物领域已有诸多报道，《中国生物防治学报》第4期537-544页报道了赵晓燕等通过苏云金芽胞杆菌b7、枯草芽胞杆菌tl2原生质体融合使融合菌株具备双亲的防虫及防病双优势。《湖北农业科学》第6期1033-1036页报道了张安妮等通过溶藻细菌f8与藻毒素降解菌t1原生质体融合使得融合菌株具备双亲的溶藻及降解藻毒素功效。利用原生质体融合将亲本优势基因发生重组使获得兼备双亲优良性状的融合菌株成为可能，不仅克服传统育菌方法中的单一特性障碍，还具有传递亲本优势传递完整性。使用微生物控藻是一个相对生态环保的方法，借助本实验原有的溶藻细菌jz-4与脱氮除磷菌b8进行原生质体融合，既有了高效溶藻，又能针对营养化水体问题，从根源处理蓝藻问题，这也为微生物治理蓝藻方面提供了一种新思路。

技术实现要素：

解决的技术问题：针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出一株溶藻/脱氮/除磷三效工程菌及其在处理含铜绿微囊藻污染水中的应用，得到的溶藻/脱氮/除磷三效工程菌hl既能溶藻又具备脱氮、除磷作用，能够在去除富营养化水体中的氮、磷的同时，实现微生物控藻。

技术方案：一株溶藻/脱氮/除磷三效工程菌芽孢杆菌（bacilliussp.）hl，其保藏编号为：cgmccno.21172。

上述芽孢杆菌hl在处理含铜绿微囊藻污染水中的应用。

上述应用，步骤如下：

步骤一.活化菌株：将上述菌株芽孢杆菌hl从斜面上接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，25℃、150r·min^-1恒温振荡培养12h至菌株生长对数期，得菌液待用；

步骤二.菌株溶藻：取上述菌液加入到100ml铜绿微囊藻液中，以菌藻比1:10（v:v）接种，温度为25℃，光照强度为3200lux，光暗比12h:12h，光照培养7d即可。

作为优选，所述步骤一中牛肉膏蛋白胨液体培养基制备过程如下：称取nacl1g、鱼粉蛋白胨2g、牛肉膏1g，加入200ml蒸馏水，调节ph至7.0-7.2，高温灭菌后待用。固体培养基加4g琼脂粉。

作为优选，所述铜绿微囊藻液的培养基成分为：称取nano31.5g、k2hpo40.04g、mgso4·7h2o0.075g、cacl2·2h2o0.036g、柠檬酸0.006g、柠檬酸铁铵0.006g、edta-na20.02g，加入微量元素溶液1ml、蒸馏水1000ml，调节ph至7.0~7.5，高温灭菌后待用。

有益效果：

（1）本发明提供了一种新的思路寻找治理蓝藻水华的菌株。本发明利用原生质体融合出的菌株hl7d溶藻率、脱氮率、除磷率分别为81.61±1.94%、58.64±1.07%、61.78±1.32%。菌株hl既高效溶藻，又兼备脱氮除磷效果，其环境适应性好，生态安全性高。

（2）本发明给出不同菌龄、铜绿微囊藻浓度对菌株溶藻效果的影响，并提供了三效工程菌7d的溶藻率、脱氮率、除磷率，可应用于富营养化水体中的铜绿微囊藻等藻类去除，实现在去除富营养化水体中的氮、磷的同时，实现微生物控藻。

保藏信息：本发明的菌株保藏日期为2020年11月13日，保藏编号为cgmccno.21172。分类命名为芽孢杆菌（bacilliussp.）hl，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。

本发明原生质体融合所用溶藻细菌jz-4，为沙门氏菌亚种沙门氏菌（aoromonassalmonicidasubsp.salmonicida.），现保藏于中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏时间为：2017年4月20日，其保藏编号为cgmccno.14051，该菌株筛选方法及结果已申请专利，专利申请号为2017108327180，发明名称为一种从太湖激浪鱼内脏中筛选藻毒素降解菌的方法。

本发明原生质体融合所用脱氮除磷菌b8，为恶臭假单胞菌（pseudomonasputida.），现保藏于中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏时间为：2014年5月16日，其保藏编号：cgmccno.9168。该菌株筛选方法及结果已申请专利，专利申请号为201410472759x，发明名称为一种反硝化聚磷菌（b8）菌剂种子液制备方法。

附图说明

图1为本发明所述三效工程菌hl生长曲线图；

图2为本发明所述三效工程菌7d溶藻效果图；

图3为本发明所述三效工程菌7d脱氮效果图；

图4为本发明所述三效工程菌7d除磷效果图；

图5为不同菌龄对本发明所述菌株hl溶藻、脱氮、除磷效果图；

图6为不同铜绿微囊藻浓度对本发明所述菌株hl溶藻、脱氮、除磷效果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

本说明书实施例中牛肉膏蛋白胨液体培养基制备过程如下：称取nacl1g、鱼粉蛋白胨2g、牛肉膏1g，加入200ml蒸馏水，调节ph至7.0-7.2，高温灭菌后待用。固体培养基加4g琼脂粉。

本说明书实施例中铜绿微囊藻液的培养过程如下：将铜绿微囊藻培养基以5:1(v:v)与铜绿微囊藻液进行混匀并置于恒温光照培养箱中(温度为25℃，光照强度为3200lux，光暗比12h:12h)，待用。其中所述铜绿微囊藻培养基成分为：称取nano31.5g、k2hpo40.04g、mgso4·7h2o0.075g、cacl2·2h2o0.036g、柠檬酸0.006g、柠檬酸铁铵0.006g、edta-na20.02g，加入微量元素溶液1ml、蒸馏水1000ml，调节ph至7.0~7.5，高温灭菌后待用。

实施例1

一、菌株的分离与筛选：

（1）重悬：分别取10ml的溶藻细菌jz-4和脱氮除磷菌b8发酵液于离心机4500r·min^-1离心10min。弃上清液，收集菌体。用无菌针筒吸取10mlsmm缓冲液洗涤菌体2次后，重悬于10mlsmm缓冲液中；酶解：用5mg·l^-1的溶菌酶对生长迟滞期b8菌和对数生长期jz-4菌于30℃下酶解45min，将制备的原生质体于45℃热灭活；重悬：经离心机3800r·min^-1离心10min后，用无菌针筒吸取高渗生理盐水洗涤原生质体2次后，重悬于10ml高渗生理盐水溶液中；融合：将处理后的两个原生质体各取1ml于离心管中，经离心机3800r·min^-1离心10min，弃上清液。加入0.2ml新生磷酸钙溶液、1.8ml30wt.%的peg4000。经30℃水浴保温40min后，3800r·min^-1离心10min，弃去上清液。用smm溶液定容至2ml，再以smm溶液梯度稀释到10^-3、10^-4、10^-5，吸取25μl涂布于高渗固体培养基，各梯度做3个平行，置于25℃恒温培养箱培养48h。

（2）用接种环挑取分离不同单菌落并培养2-3d，并5次平板划线得到纯化菌株。

（3）将纯化菌株发酵培养(以下皆称为发酵液)，以菌藻比1:10(v:v)接种，温度25℃，光照强度为3200lux，光暗比12h:12h，光照培养7d。每天测1chla、tn、tp含量并计算溶藻率、脱氮率、除磷率，设平行及空白对照3组。比较各组之间的溶藻、脱氮、除磷率，优选出5#菌株并命名为hl。（各组的数据详情如表1所示）

表1原生质体融合菌群的形态与特征

二、菌株生长曲线测定：

三效工程菌hl生长曲线如图1所示，该生长曲线呈现出倒“v”型，菌株hl最大od600为1.522。2h后由生长迟缓期进入对数增长期，在对数增长期，充足的能量和原料使菌株代谢旺盛，增殖迅速。18h后，菌株进入稳定期，菌株自身大量繁殖和代谢，必需的生长物质逐渐消耗殆尽，细菌生长减慢。26h后，菌株进入衰亡期，消亡速度大于生长速度。

四、种子液制备：

将上述菌株从斜面上接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，25℃、150r·min^-1恒温振荡培养12h至菌株生长对数期，待用。

实施例2

为考察hl菌株溶藻效果，取实施例1中处于对数生长期的hl菌悬液(种子液)10ml以菌藻比1:10(v:v)接种于100mlchla浓度为1245μg·l^-1的铜绿微囊藻液中并于150r·min^-1、25℃振荡箱中培养7d，每24h测chla含量并计算溶藻率，同时将jz-4、b8作为对照组，参见图2，7d后jz-4、b8、hl溶藻率分别为71.87±0.45%、8.00±0.70%、81.61±1.94%。

实施例3

为考察hl菌株脱氮效果，取实施例1中处于对数生长期的hl菌悬液(种子液)10ml以菌藻比1:10(v:v)接种于100mltn浓度为5.45μg·l^-1的铜绿微囊藻液中并于150r·min^-1、25℃振荡箱培养7d，每24h测tn含量并计算脱氮率，同时将jz-4、b8作为对照组，参见图3，7d后jz-4、b8、hl脱氮率率分别为21.12±0.64%、75.89±1.50%、58.64±1.07%。

实施例4

为考察hl菌株除磷效果，取实施例1中处于对数生长期的hl菌悬液（种子液）10ml以菌藻比1:10（v:v）接种于100mltp浓度为0.83μg·l^-1的铜绿微囊藻液中并于150r·min^-1、25℃振荡箱培养7d，每24h测tp含量并计算除磷率，同时将jz-4、b8作为对照组，参见图4，7d后jz-4、b8、hl除磷率分别为5.49±0.25%、86.59±1.26%、61.78±1.32%。

实施例5

为考察不同菌龄对菌株hl溶藻、脱氮、除磷效果的影响，分别取实施例1中处于生长迟缓期、对数生长期、稳定期的hl菌悬液(种子液)10ml以菌藻比1:10(v:v)接种于100ml初始chla浓度为1245μg·l^-1，初始tn浓度为5.45μg·l^-1，初始tp浓度为0.83μg·l^-1的铜绿微囊藻液中并于150r·min^-1、25℃振荡箱中培养7d，每24h测各组chla、tn、tp含量并计算溶藻率、脱氮率、除磷率，参见图5，7d溶藻率分别为67.78±0.42%、81.61±1.94%、76.01±2.19%，7d脱氮率分别为42.34±1.87%、58.64±1.07%、54.11±0.56%，7d除磷率分别为48.92±1.15%、61.78±1.32%、57.45±1.11%。可以得出，处于对数增长期的菌株hl7d时溶藻、脱氮、除磷效能均高于其余菌龄组。

实施例6

为考察不同铜绿微囊藻浓度对菌株hl溶藻、脱氮、除磷效果的影响，取实施例1中对数生长期hl菌悬液10ml以菌藻比1:10(v:v)接种于100ml不同生长时期的铜绿微囊藻，其中生长迟缓期、对数生长期、稳定期初始chla浓度分别为635μg·l^-1、1245μg·l^-1、4115μg·l^-1，初始tn浓度分别为3.22μg·l^-1、5.45μg·l^-1、6.12μg·l^-1，初始tp浓度分别为0.57μg·l^-1、0.83μg·l^-1、1.07μg·l^-1的铜绿微囊藻液中并于150r·min^-1、25℃振荡箱中培养7d，每24h测各组chla、tn、tp含量并计算溶藻率、脱氮率、除磷率，参见图6，7d溶藻率分别为87.78±0.32%、81.61±1.94%、66.43±1.95%，7d脱氮率分别为43.56±1.51%、58.64±1.07%、66.39±0.76%，7d除磷率分别为55.42±1.08%、61.78±1.32%、67.68±1.09%。可以得出，菌株hl对于各个生长时期的铜绿微囊藻在溶藻、脱氮、除磷各方面均表现出良好效果。