高效合成麦角硫因的工程菌的构建方法与应用

本发明涉及高效合成麦角硫因的工程菌的构建方法与应用，属于代谢工程领域。
背景技术：
：麦角硫因(ergothioneine，erg)是一种由组氨酸衍生而来的天然氨基酸衍生物，是一种硫醇化合物。麦角硫因作为一种天然抗氧化剂被广泛应用于食品、医药以及化妆品等领域。目前，麦角硫因的生产方法主要有，提取法：从含有麦角硫因的植物、微生物中分离提取，但由于其中麦角硫因的含量较低，利用此方法制备得到的麦角硫因杂质多、成本高、产出比低，难实现工业化生产；化学合成法：原料2-巯基咪唑很难制备，合成过程中易发生外消旋作用，且由于安全性难以保证，不能在食品、医药以及化妆品等领域实现广泛的应用；传统微生物合成法：利用自身能合成麦角硫因的微生物，如分枝杆菌、放线菌、蓝细菌和裂殖酵母等，直接进行发酵培养，但此方法得到的麦角硫因浓度很低。于是通过在常用改造工程菌株中异源表达麦角硫因合成途径，并通过代谢途径改造来获得高效合成麦角硫因的工程菌，极具发展前景。但是，现有的生物法也仍存在一定的缺陷，例如，文献“heterologousandhighproductionofergothioneineinescherichiacoli”中，ryoosawa等人构建了一株可产麦角硫因的重组大肠杆菌，将此重组大肠杆菌摇瓶发酵72h，仅可使发酵液中麦角硫因的含量达24mg/l，产量过低；文献“gram-scalefermentativeproductionofergothioneinedrivenbyoverproductionofcysteineinescherichiacoli”中，naoyukitanaka等人在引进麦角硫因合成途径的基础上，改造部分代谢途径后，使菌株麦角硫因的产量提高到98mg/l，产量仍然偏低，不足以大规模生产。因此，如何利用代谢工程手段调节大肠杆菌中的代谢流，提高麦角硫因的产量，实现麦角硫因的高效合成，仍是本领域亟待解决的问题。技术实现要素：[技术问题]为了提高麦角硫因的产量、实现麦角硫因的高效生产，使其适用于工业化生产。[技术方案]麦角硫因合成过程中，需要用到三种氨基酸前体，分别是组氨酸(his)、甲硫氨酸(met)、半胱氨酸(cys)，为了提高这三种前体氨基酸的积累，本发明对大肠杆菌进行代谢工程改造，用质粒pcdfduet-1来过表达大肠杆菌基因组中原有的基因或突变基因，或者异源表达其他来源的基因。本发明选择了与组氨酸积累相关的谷氨酸棒杆菌来源的基因hisg以及它的突变体hisgg233h，t235q，与甲硫氨酸积累相关的大肠杆菌基因组上的基因meta、thra，与半胱氨酸积累相关的大肠杆菌基因组上的基因nrdh、cysk和突变基因cyset167a，以及谷氨酸棒杆菌来源的截短基因serat410stop。本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，所述的基因工程菌以大肠杆菌为宿主，表达了麦角硫因合成基因簇egtbcde(γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸s-氧化物合酶、γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸s-氧化物水解酶、l-组氨酸-α-甲基转移酶和炔基半胱氨酸s-氧化物裂解酶)、麦角硫因生物合成蛋白1(egt1)的编码基因和/或谷氨酸-半胱氨酸连接酶(egta)的编码基因，并表达一种或多种与组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸代谢相关的基因。在一种实施方式中，所述与组氨酸代谢相关基因包括表达atp磷酸核糖基转移酶hisg的基因hisg以及突变体hisgg233h,t235q，与甲硫氨酸代谢相关基因包括高丝氨酸酰基转移酶meta的编码基因meta、天冬氨酸激酶thra的编码基因thra、与半胱氨酸代谢相关基因包括半胱氨酸合酶的编码基因nrdh和cysk、丝氨酸乙酰转移酶cyse的突变基因cyset167a、磷酸甘油酸脱氢酶sera的截短基因serat410stop。在一种实施方式中，所述麦角硫因合成基因簇egtbcde来源于mycolicibacteriumsmegmatis。在一种实施方式中，所述麦角硫因合成基因簇egtbcde由egtb、egtc、egtd、egte组成，所述egtb的geneid:4533015，egtc的geneid：4532675，egtd的geneid：4537704，egte的geneid：4531386。在一种实施方式中，将编码所述基因簇egtbcde的核苷酸连接至载体prsfduet-1上进行表达。在一种实施方式中，利用载体pcdfduet-1表达编码麦角硫因生物合成蛋白1(egt1)的基因、编码谷氨酸-半胱氨酸连接酶(egta)的基因、以及与组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸代谢相关的基因。在一种实施方式中，所述编码麦角硫因生物合成蛋白1的基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，编码谷氨酸-半胱氨酸连接酶的基因的核苷酸序列如seqidno.2所示，在一种实施方式中，所述hisg的geneid：1019477，所述hisgg233h,t235q的核苷酸序列如seqidno.3所示。在一种实施方式中，所述meta的geneid：948513，所述thra的geneid：945803。在一种实施方式中，所述serat410stop的核苷酸序列如seqidno.4所示，nrdh的geneid：947161，cysk的geneid：946877，cyset167a的核苷酸序列如seqidno.5所示。在一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌bl21(de3)。本发明的第二个目的是提供一种所述高效合成麦角硫因的工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)质粒prsf-egtbcde，pcdf-egta+1-gene构建：首先酶切载体获得载体片段，通过pcr扩增得到线性片段egtb，采用一步克隆法将线性片段egtb与线性载体连接，获得质粒prsf-egtb；通过多次相同步骤，逐次将基因连接上去，从而获得质粒prsf-egtbcde，pcdf-egta+1-gene；(2)工程菌构建：将质粒prsf-egtbcde，pcdf-egta+1-gene导入大肠杆菌宿主中，得到所述的工程菌。本发明的第三个目的是提供一种合成麦角硫因的方法，所述方法是利用所述基因工程菌发酵生产麦角硫因。在一种实施方式中，所述方法将基因工程菌接种至摇瓶培养基中，在25-35℃下培养1-2h，加入0.1-0.5mmiptg进行诱导；或将工程菌接种至发酵培养基中，在25-35℃，1-5vvm通气量，30％溶氧，ph在6-7之间培养5-6小时，加入0.1-0.5mmiptg进行诱导培养。在一种实施方式中，将所述基因工程菌加入反应体系中，在25-35℃、ph在6～7下培养，培养1-6h加入iptg诱导，总共培养不少于48h。在一种实施方式中，培养时间不少于72h。在一种实施方式中，所述摇瓶培养基为15-20g/lna2hpo4·12h2o，1-5g/lkh2po4，15-20g/l(nh4)2so4，3-7mmmgso4，0.1-0.2mmcacl2，1-5g/l酵母粉，15-20g/l葡萄糖。在一种实施方式中，所述发酵培养基为5-10g/l酵母粉，1-5g/l胰蛋白胨，20-30g/lna2hpo4·12h2o，5-10g/l(nh4)2so4，1-5g/lkh2po4，1-3g/l柠檬酸，0.1-0.2mg/lvh，1-5ml微量元素，15-20g/l葡萄糖。在一种实施方式中，发酵10-12小时后流加葡萄糖溶液。本发明提供了所述合成麦角硫因的工程菌在制备麦角硫因、含有麦角硫因的产品及麦角硫因衍生物中的应用。[有益效果]本发明将麦角硫因合成基因egtbcde与异源的麦角硫因合成途径酶egt1组合，同时表达大肠杆菌基因gsha的同工酶egta，获得工程菌e1-a1，使麦角硫因产量由70.87mg/l提高至125.8mg/l。在工程菌e1-a1的基础上，进一步对宿主的组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸代谢改造，构建得到基因工程菌在摇瓶条件下，发酵72h，发酵液中麦角硫因的产量可提高至244.97mg/l。在3l发酵罐条件下麦角硫因产量可达1102.96mg/l，有助于麦角硫因、或麦角硫因衍生物的工业化生产。附图说明图1为重组质粒prsf-egtbcde的质粒图谱。图2为重组质粒pcdf-egta+1-gene的质粒图谱。图3为标样(i)和工程菌发酵获得的发酵液(ii)的lc-ms分析结果比对图。图4为摇瓶条件下不同大肠杆菌工程菌发酵获得的发酵液中麦角硫因的含量图。图5为大肠杆菌工程菌3l发酵罐分批补料发酵图。具体实施方式(一)菌株及质粒大肠杆菌(escherichiacoli)jm109、大肠杆菌(escherichiacoli)bl21(de3)、粟酒裂殖酵母、谷氨酸棒杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；下述实施例中涉及的prsfduet-1质粒和pcdfduet-1质粒购自普如汀生物技术(北京)有限公司。(二)培养基lb液体培养基：蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、nacl10g/l。lb固体培养基：蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、nacl10g/l、琼脂15g/l。摇瓶培养基：16g/lna2hpo4·12h2o，3g/lkh2po4，16g/l(nh4)2so4，5mmmgso4，0.1mmcacl2，2g/l酵母粉，20g/l葡萄糖。3l发酵罐培养基：6g/l酵母粉，4g/l胰蛋白胨，25g/lna2hpo4·12h2o，6g/l(nh4)2so4，4g/lkh2po4，2g/l柠檬酸，0.1mg/lvh，1ml微量元素，20g/l葡萄糖。(三)检测方法(1)麦角硫因的测定方法：高效液相色谱(hplc)检测法:agilent1200，uv检测器，c18柱(250×4.6mm，5μm)，流动相比例：水:甲醇＝99:1，流速0.7ml/min，柱温30℃，紫外吸收：257nm，进样体积为5μl，检测时长：20min。(2)葡萄糖浓度的测定：用葡萄糖分析仪检测。实施例1：工程菌e1的构建化学合成(金唯智公司)麦角硫因合成基因簇egtbcde(egtb的geneid:4533015，egtc的geneid：4532675，egtd的geneid：4537704，egte的geneid：4531386)，以egtb-f、egtb-r为引物，对基因egtb进行pcr扩增，得到egtb的扩增片段；用dna内切酶noci和hindiii对质粒prsfduet-1进行酶切，获得载体线性片段，采用一步克隆法将扩增片段与线性载体连接，化转进大肠杆菌jm109感受态中；将转化产物涂布于含有50μg.ml-1卡那霉素的lb固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子；挑取转化子进行菌落pcr验证，将验证正确的转化子接种至lb液体培养基中，过夜培养后，提取质粒测序进一步验证，验证正确即获得重组质粒prsf-egtb；将获得的重组质粒prsf-egtb作为载体，重复上述实验操作，进一步连接基因egtc，以获得重组质粒prsf-egtbc；以此类推，获得重组质粒prsf-egtbcde(质粒图谱见图1)。将重组质粒prsf-egtbcde化转进大肠杆菌bl21(de3)感受态中，将转化产物涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子，该转化子即为工程菌株e1。(该实施例中用到的引物见表1)表1引物的核苷酸序列名称序列egtb-ftgtttaactttaataaggagatataccatgatcgcacgcgagacaegtb-racttaagcattatgcggccgcaagctttcagacgtcccaggccagegtc-fttaagtataagaaggagatatacatatgatgtgccggcatgtggcegtc-rgcggtggcagcagcctaggttaattaatcacaggggtgtcacgacegtd-fcgcctggcctgggacgtctgagaaggagatataccatgacgctctcactggccaaegtd-rggcgcgccgagctcgaattctcaccgcaccgccagegte-fccacgtcgtcgtgacacccctgtgagaaggagatataccatgctcgcgcagcagtegte-rcagcagcctaggttaattaatcagggcgcctcacg实施例2：工程菌e1-1、e1-a、e1-a1的构建化合合成(金唯智公司)谷氨酸-半胱氨酸连接酶egta(其编码基因的核苷酸序列如seqidno.2所示)，以egta-f、egta-r为引物，对基因egta进行pcr扩增，得到egta的扩增片段；用dna内切酶noci和hindiii对质粒pcdfduet-1进行酶切，获得载体线性片段，采用一步克隆法将扩增片段与线性载体连接，化转进大肠杆菌jm109感受态中；将转化产物涂布于含有50μg/ml链霉素的lb固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子；挑取转化子进行菌落pcr验证，将验证正确的转化子接种至lb液体培养基中，过夜培养后，提取质粒测序进一步验证，验证正确即获得重组质粒pcdf-egta；以粟酒裂殖酵母基因组为模板，以egt1-f、egt1-r为引物，对基因egt1进行pcr扩增，得到egt1的扩增片段(核苷酸序列如seqidno.1所示)；用dna内切酶noci和hindiii对质粒pcdfduet-1进行酶切，用dna内切酶hindiii对质粒pcdf-egta进行酶切，分别获得载体线性片段，采用一步克隆法将egt1的扩增片段分别与线性载体pcdfduet-1、pcdf-egta连接，分别化转进大肠杆菌jm109感受态中；将转化产物涂布于含有50μg/ml链霉素的lb固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子；挑取转化子进行菌落pcr验证，将验证正确的转化子接种至lb液体培养基中，过夜培养后，提取质粒测序进一步验证，验证正确即获得重组质粒pcdf-egt1、pcdf-egta+1；将重组质粒prsf-egtbcde分别和pcdf-egt1、pcdf-egta、pcdf-egta+1共转化进bl21(de3)感受态中，将转化产物涂布于含有50μg.ml-1卡那霉素和50μg.ml-1链霉素的lb固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子，该转化子即为工程菌株e1-1(含有prsf-egtbcde和pcdf-egt1)、e1-a(含有prsf-egtbcde和pcdf-egta)、e1-a1(含有prsf-egtbcde和pcdf-egta+1)，(本实施例中用到的引物见表2)。表2引物的核苷酸序列名称序列egta-ftgtttaactttaataaggagatataccatggctcttcctgctcgcegta-rcgacttaagcattatgcggccgctcaaagttcgcctttagcaagtegt1-ftaaaggcgaactttgaaaggagatataccatgatgacagaaatagaaaacattggegt1-rcttaagcattatgcggccgcttagtttttgactagtctagctcca实施例3：代谢途径的改造在大肠杆菌中异源表达谷氨酸棒杆菌来源的基因hisg以及它的突变体hisgg233h,t235q，大肠杆菌基因组上的基因meta、thra，nrdh、cysk和突变基因cyset167a，谷氨酸棒杆菌来源的截短基因serat410stop。用相应引物(见表3)去扩增上述基因片段，用dna内切酶ndei和paci对质粒pcdf-egta+1进行酶切，获得载体线性片段，采用一步克隆法将扩增片段hisg、hisgg233h，t235q(核苷酸序列如seqidno.3所示)、meta、thra、nrdh、cysk、cyset167a(核苷酸序列如seqidno.5所示)、serat410stop(核苷酸序列如seqidno.4所示)，分别与得到的线性化的pcdf-egta+1载体连接，分别得到重组质粒，将重组质粒分别化转进大肠杆菌jm109感受态中；将转化产物涂布于含有50μg/ml链霉素的lb固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子；挑取转化子进行菌落pcr验证，将验证正确的转化子接种至lb液体培养基中，过夜培养后，提取质粒测序进一步验证，验证正确即获得相关重组质粒(质粒图谱见图2)；将获得重组质粒prsf-egtbcde分别和pcdf-egta+1-hisg、pcdf-egta+1-hisgg233h，t235q、pcdf-egta+1-meta、pcdf-egta+1-thra、pcdf-egta+1-nrdh、pcdf-egta+1-cysk、pcdf-egta+1-cyset167a、pcdf-egta+1-serat410stop、pcdf-egta+1-thra+serat410stop共转化进bl21(de3)感受态中，将转化产物涂布于含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml链霉素的lb固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，得到转化子，该转化子即为工程菌株e1-a1-hisg、e1-a1-hisgg233h,t235q、e1-a1-meta、e1-a1-thra、e1-a1-nrdh、e1-a1-cysk、e1-a1-cyset167a、e1-a1-serat410stop、e1-a1-thra+serat410stop。表3引物的核苷酸序列名称序列hisg-ftataagaaggagatatacatatgttgaaaatcgctgtcccaaacahisg-rgcggtggcagcagcctaggttaattaactagatgcgggcgatgcghisgg233h,t235q-ftataagaaggagatatacatatgttgaaaatcgctgtcccaaacahisgg233h,t235q-rgcggtggcagcagcctaggttaattaactagatgcgggcgatgcgmeta-fttaagtataagaaggagatatacatatgatgccgattcgtgtgccmeta-rcagcagcctaggttaattaattaatccagcgttggattcatgtgcthra-fagtataagaaggagatatacatatgatgcgagtgttgaagttcggthra-rcagcagcctaggttaattaatcagactcctaacttccatgagaggnrdh-fgaaggagatatacatatgatgcgcattactatttacactcgtaacnrdh-ragcggtggcagcagcctaggttaattaatcatgcactggccgcgtcysk-fgaaggagatatacatatgatgagtaagatttttgaagataactcgctgaccysk-rcagcagcctaggttaattaattactgttgcaattctttctcagtgaagagcyset167a-fgtataagaaggagatatacatatgatgtcgtgtgaagaactggaaattgtcyset167a-rcagcagcctaggttaattaattagatcccatccccatactcaaatgtatgserat410stop-faagtataagaaggagatatacatatgatgagccagaatggccgtcserat410stop-rggcagcagcctaggttaattaattaaacagactcagagttggtcttcacg实施例4：工程菌的摇瓶培养将实施例3构建得到的13株工程菌进行摇瓶培养，摇瓶培养基为：16g/lna2hpo4·12h2o，3g/lkh2po4，16g/l(nh4)2so4，5mmmgso4，0.1mmcacl2，2g/l酵母粉，20g/l葡萄糖。摇瓶培养条件为：将培养了8～10h的菌株，以2ml/100ml的量添加至发酵体系中，在30℃下培养2小时，然后加入0.2mmiptg进行诱导培养，培养过程中，用2m氢氧化钠溶液调控ph在6.8～7.0之间。培养72h后，收集细胞内外的产物，并进行麦角硫因含量检测。如图3所示，(i)为麦角硫因标样的lc-ms检测结果图，(ii)为样品的lc-ms检测结果图，通过对比可知，构建的工程菌能合成麦角硫因。如图4所示，是各个工程菌的麦角硫因产量，只表达麦角硫因合成基因簇的工程菌麦角硫因产量为70.87mg/l，在只表达麦角硫因合成基因簇的基础上，再表达合成途径中的其他基因egt1、egta或egt1+egta，产量分别提高到90.74mg/l、104.55mg/l、125.8mg/l。在此基础上对前体氨基酸的代谢途径进行改造，由数据可知，表达hisgg233h,t235q、thra、cyset167a、serat410stop可使产量有所提高，分别提高到144.9mg/l、184.83mg/l、160.41mg/l、210.26mg/l。工程菌e1-a1-thra+serat410stop的产量提高至244.97mg/l。实施例5：工程菌株e1-a1-thra+serat410stop的3l发酵罐的分批补料发酵培养发酵培养基为：6g/l酵母粉，4g/l胰蛋白胨，25g/lna2hpo4·12h2o，6g/l(nh4)2so4，4g/lkh2po4，2g/l柠檬酸，0.1mg/lvh，1ml微量元素，20g/l葡萄糖。3l发酵罐中装液量为1.5l，将培养至了8～10h的菌株e1-a1-serat410stop-thra，以10ml/100ml的量添加至发酵体系中，培养条件为：在30℃，1-5vvm通气量，30％溶氧，ph在6～7下培养4小时，加入0.2mmiptg进行诱导培养。培养过程中，测定葡萄糖剩余量，计算出菌体消耗葡萄糖的速率，来确定流加葡萄糖溶液的量，以氨水调控ph保持在6.0～7.0之间，培养过程中，取样测定菌体生长情况、葡萄糖消耗情况及麦角硫因含量。结果如图5所示，培养84h、96h、108h，发酵液中麦角硫因的产量分别为1094.2mg/l、1100.88mg/l、1102.96mg/l。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。sequencelisting<110>江南大学<120>高效合成麦角硫因的工程菌的构建方法与应用<130>baa210260a<160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>2322<212>dna<213>schizosaccharomycespombe<400>1atgacagaaatagaaaacattggcgcattagaagttctcttctctcctgaatccatcgag60cagagcctcaaacggtgtcaactcccctccactttattatacgatgaaaaaggtttacga120ctgtttgatgagattacgaatttaaaagaatactacctgtatgaaagtgagcttgatatt180ctgaagaagttcagcgattccattgccaaccagttactgtctccagatcttcctaacacg240gttatagaattagggtgtggaaatatgcgcaaaacaaaacttcttttagatgcgtttgaa300aagaagggctgtgatgtgcatttttacgcccttgaccttaatgaagccgagttgcaaaaa360ggactgcaggagcttcgtcaaactaccaattatcagcatgttaaggtgtctggtatttgc420ggttgctttgaaagattgctacaatgtttggacaggtttcgtagtgagcccaatagtcga480attagcatgttgtacttgggtgcttcgattggtaattttgataggaaatccgcagcatca540tttttacgttcgtttgccagtcgtttgaatattcatgacaaccttttaatctccttcgat600catagaaacaaggctgagctagtccaactagcttacgatgatccttatcgtattactgaa660aagtttgaaaagaatattttggctagtgtcaatgcggtttttggtgaaaaccttttcgac720gaaaatgattgggaatataaaagtgtctacgatgaagatctcggtgttcatagggcctac780ttacaagccaaaaatgaagttactgttattaagggtccaatgttttttcaatttaaacct840agtcatttaattttgatcgaagaaagttggaagaatagcgatcaagaatgtcgtcaaatc900attgagaaaggtgattttaaattagtctctaagtatgaaagtacgattgcagattactcg960acctatgttattaccaaacaatttcctgctatgcttcaactccctcttcagccttgtcct1020tcgttagcagaatgggatgctctacgcaaagtatggctttttattacaaataaattgctt1080aacaaagataacatgtacaccgcatggattcctttgagacatcctccaattttttacatc1140ggacatgtccctgtttttaatgatatttatctcacaaagattgtcaaaaacaaagcaact1200gctaacaaaaaacatttttgggaatggtttcaacgtggtatagatccggacattgaagat1260ccctccaagtgccattggcattctgaagttcctgaaagctggccttctcctgaccaactt1320cgtgaatatgagaaagagtcttgggaatatcatattgtaaagttgtgcaaagcaatggat1380gaattgtctacttctgaaaagagaattctctggctttgttacgaacatgtagccatgcat1440gtggagacaactctttacatctacgtacagtcatttcaaaatgcaaaccagactgtatca1500atttgcggatcacttcctgaaccagctgaaaaacttacgaaagctccgttatgggtgaat1560gtacctgaaacggaaattgcagttggtatgcccttgacaacacaatacacgagtgttgga1620tcaaatttgcaatcatccgatcttagtgcccatgaaaatacagatgaacttttttatttt1680gcgtgggataatgagaaaccaatgaggaagaaactggtttctagcttttctattgccaat1740cgtccaatttctaacggtgaatatttagattttatcaataaaaagtcaaaaacagaaagg1800gtgtatccaaagcaatgggcggagattgatggaacgctttacatacgaaccatgtacggc1860ttattaccccttgacgactacttgggttggcctgttatgacttcatacgacgatctaaac1920aattatgcgagctcccaaggatgcagactaccaactgaggatgaactgaactgtttttac1980gatcgggttctcgagagaactgatgagccttatgttagtaccgaaggaaaggcaactggt2040tttcaacaattgcaccctttagccctaagtgataattcaagtaatcaaatattcacagga2100gcatgggaatggacaagtacagttctggagaagcacgaggattttgaacctgaagagctt2160tatccagattatacacgagatttctttgatggaaagcataatgtcgttttgggtggtagc2220tttgctacggctacgcgcatttcaaatagaagaagcttcaggaacttttaccaagctggc2280tataaatatgcatggattggagctagactagtcaaaaactaa2322<210>2<211>1272<212>dna<213>人工序列<400>2atggctcttcctgctcgctcagattcaggctgtgccgtacccgtagagttcacatcagct60gaacaggctgctgctcatattggcgctaactcacttcaggatggccctattggccgcgtt120ggccttgaaattgaagctcattgtttcgacctctcaaacccgacccgacgaccgtcctgg180gatgaactttcagctgttattgctgatgttcctcctcttcctggcggctcacgcattaca240gttgaacctggcggcgctgttgaactttcaggccctccttatgatggccctcttgctgct300gttgctgctcttcaggctgatcgggcagtactaagagccgaatttgctcgccgcaacctt360ggccttgttcttcttggcacagatcctcttcgcccaactcgaagagtgaatcctggcgct420cgctattcagctatggaacagttcttcactgcatcaggcacagctgaagctggcgctgct480atgatgacagctacagcttcagttcaggttaaccttgatgctggccctcgcgatggctgg540gctgaacgcgtgcgattggcgcacgcgcttggccctacaatgattgctattacagctaac600tcacctatgcttggcggccagtttacaggctggtgttcaacacgccagcgcgtttggggt660caacttgattcagctcgctgtggcccggtcttaggtgtagacggcgatgatcctgcttca720gaatgggctcgctatgctcttcgcgctcctgttatgcttgttaactcacctgatgcggtc780cctgtcaccaattgggttcctttcgcggactgggctgatggccgggccgtcctaggtggg840cgtcgccctacagaagctgatcttgattatcatttaacgactctgttcccgcccgttcgc900cctcgccgctggcttgaaattcgctatcttgattcagttcctgatgctctttggcctgct960gctgtgttcactttgacgactttgttggacgatcctgttgctgctgaatcagctgctgaa1020gctacacgccctgttgctacagcttgggatcgcgctgctcgcatgggccttacagatcgc1080catcttcatacagctgctcttacatgtgtgagattagcagccgagcgcgctcctgctgaa1140cttgaagaatcaatgacacttcttatgcgctcagttcagcagcgccgctcacctgctgat1200gatttcagcgaccgcgttgttgctcgcggcattgctgctgctgttcgcgaacttgctaaa1260ggcgaactttga1272<210>3<211>846<212>dna<213>corynebacteriumglutamicum<400>3atgttgaaaatcgctgtcccaaacaaaggctcgctgtccgagcgcgccatggaaatcctc60gccgaagcaggctacgcaggccgtggagattccaaatccctcaacgtttttgatgaagca120aacaacgttgaattcttcttccttcgccctaaagatatcgccatctacgttgctggtggc180cagctcgatttgggtatcaccggccgcgaccttgctcgcgattcccaggctgatgtccac240gaagttctttccctcggcttcggttcctccactttccgttacgcagcaccagctgatgaa300gagtggagcatcgaaaagctcgacggcaagcgcatcgctacctcttaccccaaccttgtt360cgcgatgacctcgcagcacgtgggctttccgctgaggtgctccgcctcgacggtgcagta420gaggtatccatcaagcttggtgtcgcagatgccatcgccgatgttgtatccaccggccgc480acgctgcgtcagcaaggtcttgcacctttcggcgaggttctgtgcacctctgaggctgtc540attgttggccgcaaggatgaaaaggtcaccccagagcagcagatcctgcttcgccgcatc600cagggaattttgcacgcgcagaacttcctcatgctggattacaacgtcgaccgcgacaac660ctggacgctgccactgcagtaaccccaggcttatcccatccacaggtatccccactggca720cgcgacaactgggttgctgtacgcgccatggtgccacgcaggtcagctaacgccatcatg780gataagcttgctggactcggcgctgaagccatcctggcttctgaaatccgcatcgcccgc840atctag846<210>4<211>1227<212>dna<213>corynebacteriumglutamicum<400>4atgagccagaatggccgtccggtagtcctcatcgccgataagcttgcgcagtccactgtt60gacgcgcttggagatgcagtagaagtccgttgggttgacggacctaaccgcccagaactg120cttgatgcagttaaggaagcggacgcactgctcgtgcgttctgctaccactgtcgatgct180gaagtcatcgccgctgcccctaacttgaagatcgtcggtcgtgccggcgtgggcttggac240aacgttgacatccctgctgccactgaagctggcgtcatggttgctaacgcaccgacctct300aatattcactccgcttgtgagcacgcaatttctttgctgctgtctactgctcgccagatc360cctgctgctgatgcgacgctgcgtgagggcgagtggaagcggtcttctttcaacggtgtg420gaaattttcggaaaaactgtcggtatcgtcggttttggccacattggtcagttgtttgct480cagcgtcttgctgcgtttgagaccaccattgttgcttacgatccttacgctaaccctgct540cgtgcggctcagctgaacgttgagttggttgagttggatgagctgatgagccgttctgac600tttgtcaccattcaccttcctaagaccaaggaaactgctggcatgtt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