降低环形RNA免疫原性的方法

降低环形rna免疫原性的方法
技术领域
1.本发明属于rna体外合成领域，具体涉及降低环形rna免疫原性的合成方法及其应用。


背景技术：

2.环形rna是自2012年以来被广泛发现的一类数目众多的生物大分子，其研究历史较短，在其加工、代谢、功能发挥、调控网络、临床应用等方面还存在大量亟待探索的未知内容。
3.通过研究环形rna生成、结构、降解等方面，申请人团队揭示了环形rna家族在调控免疫稳态过程中扮演重要角色，并发现pkr等抗病毒活性核酸受体结合环形rna具有结构依赖而非序列依赖的特性(mol cell 2017；cell 2019)。细胞内的环形rna形成分子内16bp-33bp的双链rna茎环结构抑制pkr激活，避免不必要的自身免疫反应(cell 2019)。该发现具有重要的生理意义：在自身免疫疾病系统性红斑狼疮(sle)病人来源的外周血单核细胞(pbmc)内，过表达具有长度为16bp-33bp的不完整双链结构的环形rna能够有效缓解pkr的异常激活及表征疾病相关基因的异常激活(cell 2019)，提示具有长度为16bp-33bp的不完整双链结构的环形rna有望成为一种全新分子用于自身免疫疾病诊断和治疗。探索合成无免疫源性环形rna用于治疗自身免疫疾病，发展其在基因治疗和分子疫苗领域的应用以及pkr过度激活自身免疫疾病诊疗中的应用，将对未来我国在基于rna的疾病诊断和创新药物研发领域占有一席之地具有重要的战略意义。
4.上述环形rna均为体内合成，产量低且不稳定。本领域尚无对体外合成环形rna的抑制效果以及是否会发生免疫原性等问题的研究。


技术实现要素：

5.发明人发现，不同的体外环形rna制备方法获得的产物的免疫原性和功能显著不同。通过降低环形rna中外源序列比例可以降低免疫原性并改善环形rna的抑制功能。
6.本发明提供一种体外降低环形rna免疫原性的方法，包括降低环形rna中外源序列比例。
7.在一个或多个实施方案中，所述外源序列能形成双链结构，例如茎环结构。
8.在一个或多个实施方案中，降低环形rna中外源序列比例包括使用rna连接酶法制备环形rna。
9.在一个或多个实施方案中，所述rna连接酶是t4 rna连接酶。
10.在一个或多个实施方案中，rna连接酶法包括以下步骤：
11.(1)合成在5'端和3'端具有不互补碱基序列的线性形式的环形rna；
12.(2)通过rna连接酶连接所述5'端以及3'端。
13.在一个或多个实施方案中，步骤(1)所得的线性形式的环形rna在连接前经处理以促进5'端和3'端的连接。在一个或多个实施方案中，所述处理包括5'端和3'端的末端去磷
酸化处理及5'端磷酸化处理。
14.在一个或多个实施方案中，所述rna连接酶法还包括步骤(3)纯化得到的环形rna。
15.在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括由rna聚合酶以dna为模板转录合成该线性形式的环形rna。
16.在一个或多个实施方案中，rna聚合酶选自t7 rna聚合酶、t3 rna聚合酶、sp6 rna聚合酶、syn5 rna聚合酶。
17.在一个或多个实施方案中，所述环形rna长度为200-1000bp。
18.在一个或多个实施方案中，所述环形rna是具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形rna。
19.在一个或多个实施方案中，所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形rna具有选自circarid1b、circcamsap1、circccnb1、circcnn2、circdhx34、circephb4、circezh2、circfcho2、circfgfr1、circfkbp8、circkiaa0368、circmboat2、circpip5k1c、circpolr2a、circppp1cb、circprosc、circptk2、circpvt1、circrell1、circsdhaf2、circslc22a23、circsnhg4、circtbcd、circtmem181、circuimc1、circvapb中的一个或多个的序列。
20.在一个或多个实施方案中，所述环形rna是circpolr2a。所述circpolr2a具有图4，a所示的结构。
21.本发明还提供降低环形rna中外源序列比例的方法在降低环形rna的免疫原性中的用途。
22.在一个或多个实施方案中，所述外源序列能形成双链结构，例如茎环结构。
23.在一个或多个实施方案中，降低环形rna中外源序列比例包括使用rna连接酶法制备环形rna。
24.在一个或多个实施方案中，所述rna连接酶是t4 rna连接酶。
25.在一个或多个实施方案中，rna连接酶法包括以下步骤：
26.(1)合成在5'端和3'端具有不互补碱基序列的线性形式的环形rna；
27.(2)通过rna连接酶连接所述5'端以及3'端。
28.在一个或多个实施方案中，步骤(1)所得的线性形式的环形rna在连接前经处理以促进5'端和3'端的连接。在一个或多个实施方案中，所述处理包括5'端和3'端的末端去磷酸化处理及5'端磷酸化处理。
29.在一个或多个实施方案中，所述方法还包括步骤(3)纯化得到的环形rna。
30.在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括由rna聚合酶以dna为模板转录合成该线性形式的环形rna。
31.在一个或多个实施方案中，rna聚合酶选自t7 rna聚合酶、t3 rna聚合酶、sp6 rna聚合酶、syn5 rna聚合酶。
32.在一个或多个实施方案中，所述环形rna长度为200-1000bp。
33.在一个或多个实施方案中，所述环形rna是具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形rna。
34.在一个或多个实施方案中，所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形rna具有选自circarid1b、circcamsap1、circccnb1、circcnn2、circdhx34、circephb4、
circezh2、circfcho2、circfgfr1、circfkbp8、circkiaa0368、circmboat2、circpip5k1c、circpolr2a、circppp1cb、circprosc、circptk2、circpvt1、circrell1、circsdhaf2、circslc22a23、circsnhg4、circtbcd、circtmem181、circuimc1、circvapb中的一个或多个的序列。
35.在一个或多个实施方案中，所述环形rna是circpolr2a。所述circpolr2a具有图4，a所示的结构。
36.本发明还提供rna连接酶在降低环形rna免疫原性中的用途或在制备用于治疗受益于pkr磷酸化降低的疾病的免疫原性降低的药物中的用途
37.在一个或多个实施方案中，降低环形rna免疫原性包括使用rna连接酶法制备环形rna。
38.在一个或多个实施方案中，所述rna连接酶是t4 rna连接酶。
39.在一个或多个实施方案中，rna连接酶法包括以下步骤：
40.(1)合成在5'端和3'端具有不互补碱基序列的线性形式的环形rna；
41.(2)通过rna连接酶连接所述5'端以及3'端。
42.在一个或多个实施方案中，步骤(1)所得的线性形式的环形rna在连接前经处理以促进5'端和3'端的连接。在一个或多个实施方案中，所述处理包括5'端和3'端的末端去磷酸化处理及5'端磷酸化处理。
43.在一个或多个实施方案中，所述方法还包括步骤(3)纯化得到的环形rna。
44.在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括由rna聚合酶以dna为模板转录合成该线性形式的环形rna。
45.在一个或多个实施方案中，rna聚合酶选自t7 rna聚合酶、t3 rna聚合酶、sp6 rna聚合酶、syn5 rna聚合酶。
46.在一个或多个实施方案中，所述环形rna长度为200-1000bp。
47.在一个或多个实施方案中，所述环形rna是具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形rna。
48.在一个或多个实施方案中，所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形rna具有选自circarid1b、circcamsap1、circccnb1、circcnn2、circdhx34、circephb4、circezh2、circfcho2、circfgfr1、circfkbp8、circkiaa0368、circmboat2、circpip5k1c、circpolr2a、circppp1cb、circprosc、circptk2、circpvt1、circrell1、circsdhaf2、circslc22a23、circsnhg4、circtbcd、circtmem181、circuimc1、circvapb中的一个或多个的序列。
49.在一个或多个实施方案中，所述环形rna是circpolr2a。所述circpolr2a具有图4，a所示的结构。
50.本发明第二方面提供本文第一方面任一实施方案所述的方法制备的免疫原性降低的环形rna。
51.在一个或多个实施方案中，所述环形rna长度为200-1000bp。
52.在一个或多个实施方案中，所述环形rna是具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形rna。
53.在一个或多个实施方案中，所述具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形
rna具有选自circarid1b、circcamsap1、circccnb1、circcnn2、circdhx34、circephb4、circezh2、circfcho2、circfgfr1、circfkbp8、circkiaa0368、circmboat2、circpip5k1c、circpolr2a、circppp1cb、circprosc、circptk2、circpvt1、circrell1、circsdhaf2、circslc22a23、circsnhg4、circtbcd、circtmem181、circuimc1、circvapb中的一个或多个的序列。
54.在一个或多个实施方案中，所述环形rna是circpolr2a。所述circpolr2a具有图4，a所示的结构。
55.本发明还提供本文第二方面中任一实施方案所述的免疫原性降低的环形rna在制备用于治疗受益于pkr磷酸化降低的疾病的免疫原性降低的药物中的用途。
56.在一个或多个实施方案中，所述受益于pkr磷酸化降低的疾病选自以下的一种或多种：系统性红斑狼疮、牛皮藓、和阿尔茨海默病。
57.在一个或多个实施方案中，所述环形rna是pkr抑制剂。所述pkr抑制剂降低pkr的磷酸化水平。
58.本发明还提供一种于体外降低pkr的磷酸化水平的方法，包括：使本文第二方面中任一实施方案所述的免疫原性降低的环形rna与pkr接触，使pkr的磷酸化水平降低。
59.本发明还提供一种药物组合物，包含本文第二方面中任一实施方案所述的免疫原性降低的环形rna和药学上可接受的辅料。
附图说明
60.图1显示circpolr2a在染色体上的位置。
61.图2显示三种体外制备环形rna的方法。
62.图3显示三种方法制备的环形rna转染细胞后的细胞因子表达量比较。
63.图4显示三种方法制备的环形rna具有16bp-33bp的不完整双链结构及其二级结构示意图。a，方法一；b，方法二；c，方法三。
64.图5显示三种方法制备的环形rna对于pkr磷酸化激活水平的调控作用比较。
65.图6显示rna连接酶制备的环形rna与小分子抑制剂在pkr磷酸化激活水平的调控作用中的比较。
具体实施方式
66.发明人发现，当环形rna中含有双链结构的外源序列时，即使其中蛋白识别或结合位点较多，环形rna对蛋白的作用效果也会显著降低。而且，含有外源序列的rna具有显著的免疫原性，而采用不产生外源序列的制备方法获得环形rna无免疫原性。
67.环形rna(circrna)是一类新近发现的非编码rna分子。区别于传统线性rna，环形rna不具有5’末端帽子和3’末端poly(a)尾巴，并以共价键形成闭合环形结构。最新研究表明环形rna主要是通过反向剪切(back-splicing)产生，广泛存在于各种生物细胞中，具有极高的结构稳定性，难以被外切核酸酶(exonuclease)降解，表达具有组织及时空特异性等特征。这些特征使得circrna在疾病诊断与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。
68.本文提供的环形rna是具有长度16bp-33bp的不完整双链结构的环形rna。其中不完整双链结构的定义为rna形成的一个或多个茎环双链结构中，存在完美的互补配对碱基
也存在非配对碱基形成的bulge(突起)或internal loop(内环)，如图4所示。不完整双链结构以互补配对的碱基数目进行不完整双链结构长度计算，如果其中出现bulge(突起)或internal loop(内环)但其中bulge(突起)或internal loop(内环)的非配对碱基数目小于或等于4个，即认为其仍然是一个不完整双链结构而非多个。在一些优选实施方案中，本文方法制备的无免疫原性的环形rna的长度为100-1000bp，例如200-800bp、200-1000bp、200-500bp、200-400bp、300-400bp。
69.本发明实施例中的示例性的具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构的环形rna具有circpolr2a的序列(如seq id no:1所示)，但本发明并不限于该序列。例如，专利申请cn201910138059x中公开的环形rna的序列均适用于本发明，该文献通过引用全文纳入本文。这些环形rna包括但不限于：circarid1b、circcamsap1、circccnb1、circcnn2、circdhx34、circephb4、circezh2、circfcho2、circfgfr1、circfkbp8、circkiaa0368、circmboat2、circpip5k1c、circppp1cb、circprosc、circptk2、circpvt1、circrell1、circsdhaf2、circslc22a23、circsnhg4、circtbcd、circtmem181、circuimc1、circvapb。使用本发明方法制备的上述环形rna相对其他体外方法均具有更好的蛋白作用效果(例如抑制活性或表达)和更低的免疫原性。
70.本发明还包括与上述各rna的序列具有至少90％序列相同性的变体，前提是改变体的结构与经本发明方法制备的上述各对应rna的结构相同或相似。例如circpolr2a的变体是与seq id no:1具有至少90％序列相同性的并具有类似于图4，a所示结构的变体。
71.在两种或多种核酸分子序列中，术语“相同性”或“相同性百分数”指在比较窗口或指定区域上，采用本领域已知方法如序列比较算法，通过手工比对和目测检查来比较和比对最大对应性时，两个或多个序列或子序列相同或其中在指定区域有一定百分数的核苷酸相同(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)。例如，适合测定序列相同性百分数和序列相似性百分数的优选算法是blast和blast 2.0算法，分别可参见altschul等(1977)nucleic acids res.25:3389和altschul等(1990)j.mol.biol.215:403。
72.使用本发明方法制备的上述环形rna相对其他体外方法均具有更好的蛋白作用效果和更低的免疫原性。因此，本发明提供一种体外降低环形rna免疫原性的方法，包括降低环形rna中外源序列比例。本文所述“外源序列”表示与体内有功能的环形rna的序列或片段不同的序列。优选地，所述外源序列能在体内或体外形成稳定的双链结构(例如茎环结构)。外源序列可以是体外合成环形rna过程中引入的，例如实施例2中所述的方法二和三。
73.降低环形rna中外源序列比例的方法可以是将已合成的rna中的外源序列移除的方法，或者是在制备过程中不引入外源序列或引入后移除该外源序列的方法。例如所述方法可以包含步骤：合成含外源序列的线性rna，移除该外源序列之前、同时或之后将线性的rna环化；或者，所述方法可以包含步骤：合成不含外源序列的线性rna，将线性的rna环化。上述环化线性rna可通过rna连接酶实现。示例性的rna连接酶法制备环化rna包括步骤：(1)合成在5'端和3'端具有不互补碱基序列的线性形式的环形rna；(2)通过rna连接酶连接所述5'端以及3'端。为了调节连接效率，5'端和3'端的不互补碱基序列可经处理，例如末端去磷酸化处理及5'端加单磷酸化处理。
74.步骤(1)的合成线性形式的环形rna可以使用本领域已知的任何方法进行，优选体外方法。一种示例性的体外合成方法式由rna聚合酶以dna为模板转录合成该线性形式的环形rna。适用于本文的rna聚合酶可以是t7 rna聚合酶、t3 rna聚合酶、sp6 rna聚合酶、syn5 rna聚合酶。dna模板通常以表达框的形式构建在载体中，载体上还可含有用于载体复制和转录的组件。
75.在知晓了环形rna的序列后，可以将环形rna的编码序列装载入表达载体(或转录载体)中，从而将环形rna与载体复制和转录组件例如启动子、终止子、增强子等可操作地连接，并在宿主细胞中转录，从而生产线性rna。表达载体或转录载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。本领域一般技术人员清楚如何选择适当的宿主细胞、载体以及转录组件。
76.适用于本文的rna连接酶可以是任何能将同一或不同rna的5’端与3’端连接的酶，包括但不限于t4 rna连接酶，例如t4 rna连接酶1或t4 rna连接酶2。
77.本文所述方法中获得的线性或环形rna可经纯化。纯化此类rna的方法本领域周知，例如page、色谱、hplc等。
78.相比其他体外方法制备的环形rna，本发明方法制备的环形rna至少具备如下特征：(1)二级和三级结构不同，(2)无免疫原性，(3)在16bp-33bp的不完整双链结构的数量相当或更少的情况下，仍具有更高的蛋白调控效果(例如抑制活性)。
79.具有这些特征的环形rna可用于药物。特别地，本文方法制备的免疫原性降低的circpolr2a作为pkr抑制剂可作为药物活性成分用于治疗受益于pkr磷酸化降低的疾病。其他环形rna可用于治疗与其相应蛋白的活性或含量相关的疾病，例如：circarid1b、circcamsap1、circccnb1、circcnn2、circdhx34、circephb4、circezh2、circfcho2、circfgfr1、circfkbp8、circkiaa0368、circmboat2、circpip5k1c、circppp1cb、circprosc、circptk2、circpvt1、circrell1、circsdhaf2、circslc22a23、circsnhg4、circtbcd、circtmem181、circuimc1、circvapb。所述受益于pkr磷酸化降低的疾病选自以下的一种或多种：系统性红斑狼疮、牛皮藓、和阿尔茨海默病。
80.含有本文方法制备的免疫原性降低的circpolr2a的药物或药物组合物还可含有药学上可接受的辅料。本发明中，“药学上可接受的辅料”是用于将本发明的环形rna传送给动物或人的药学上或食品上可接受的载体、溶剂、悬浮剂或赋形剂。本文中，药学上可接受的辅料在所采用的剂量和浓度对所述组合物的接受者是无毒的。可包括本领域周知的治疗中常用于递送rna的各种类型的载体或赋形剂。示例性的辅料可以是液体或固体，包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，碳水化合物，佐剂，抗氧化剂，螯合剂，离子强度增强剂、防腐剂、载剂、助流剂、甜味剂、染料/着色剂、增味剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。在一些实施方案中，药学上可接受的辅料可以包括一种或多种非活性成分，包括但不限于：稳定剂、防腐剂、添加剂、佐剂、喷雾剂、压缩空气或其它适宜的气体，或其它适宜的与药效化合物合用的非活性成分。更具体而言，合适的辅料可以是本领域常用于环形rna给药的辅料。辅料的示例包括各种乳糖、甘露醇，油类如玉米油，缓冲剂如piggybacs、盐水、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇、二甲亚砜，酰胺如二甲基乙酰胺，蛋白质如白蛋白，和去污剂如吐温80，单糖和低聚多糖如葡萄糖、乳糖、环糊精和淀粉。由于rna在自然条件下易降
解，优选本文的环形rna与抑制rna降解的稳定剂组合制备，或者以不易被降解的形式(例如载剂、脂质体包埋)存在于组合物中。这些稳定剂或形式为本领域技术人员熟知。
81.其它药物组合物将为本领域技术人员显而易见，包括在持续或控制释放递送配制物中包含本文所述环形rna。用于配制多种其它持续或可控传递方式的技术(诸如脂质体载剂、生物易蚀微粒或多孔珠粒和积存注射)也为本领域技术人员所知。
82.用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂的形式提供。通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。在组合物冻干时，可在冻干和复水之前或之后使用此方法进行灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中储存。肠胃外组合物通常放在具有无菌进入孔的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液带或小瓶。
83.通常，组合物中含有治疗有效量的本文环形rna。治疗有效量是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解疾病或病症的剂量。实现这些效果可以通过插入具有相应功能的外源基因实现的，所述相应功能的外源基因具有相应于具体用途的功能，例如治疗功能或者诱导功能。可根据患者年龄、性别、所患病症及其严重程度、患者的其它身体状况等因素确定治疗有效量。治疗有效量可作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案在多个剂量中给药。本文中，受试者或患者通常指哺乳动物，尤其指人。示例性地，所述组合物含有按照重量比例为例如0.001-50％，优选0.01-30％，更优选0.05-10％的本文所述的环形rna。
84.本文所述组合物可与具有所述环形rna所实现功能相似或相应的功能的其他试剂联用。例如与治疗所述环形rna所治疗的疾病或病症的试剂联用。本领域技术人员可确定其他试剂的给药剂量。
85.本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物机体的剂型都是可以的，可以被制成单位剂型的形式。剂型比如可选自：凝胶剂、气雾剂、片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆、溶液、悬浮液、注射剂、散剂、丸剂、控速释剂、输液剂、混悬剂等等。根据本文所述的环形rna所预防和治疗的疾病类型，本领域人员可以选择方便应用的剂型。从易于制备和储存的立场看，优选的组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。本文所述的环形rna或其组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。本文所述的环形rna或其组合物也可储存在适当的容器，并置于试剂盒或药盒中。
86.在具体实施方案中，本发明所述体外合成具有长度为16bp-33bp的不完整双链结构的环形rna的方法，能够在体外高效合成环形rna，且合成的环形rna无免疫原性，具有长度是16bp-33bp的不完整双链结构，可作为天然免疫因子pkr的抑制剂，使抑制过度激活的天然免疫因子pkr更加准确、高效，效果远优于(10
3-106倍)已知的pkr小分子化合物抑制剂。所述环形rna可作为制备治疗天然免疫因子pkr过度激活的自身性免疫疾病，如系统性红斑狼疮、牛皮藓、阿尔茨海默病等的药物分子，为治疗天然免疫因子pkr过度激活的自身性免疫疾病提供了新的治疗途径。
87.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件进行，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法
及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
88.实施例
89.实施例1，circpolr2a在染色体上的位置图
90.circpolr2a在染色体上的位置如图1。其序列是在circexplorer数据库(http://yanglab.github.io/circexplorer/)中获得的，构建质粒相关引物由上海博尚生物有限公司合成，序列如seq id no:2和3所示。
91.实施例2，体外合成和纯化环形rna的方式
92.如图2所示，分别用三种方式在体外制备纯化环形rna。以环形rna circpolra为例，具体包括：
93.(1)方法一：通过rna体外转录实验及t4 rna连接酶体外分子内连接的方式成功制备环形rna，并用page纯化的方式进行了体外纯化得到高纯度的circpolr2a。具体有以下步骤：
94.1.质粒构建：circpolr2a成环区域由pcr方法获得，产物5’端带有t7启动子的线性全序列(circpolr2a序列见seq id no:1，构建质粒引物见seq id no:2-3)。通过多克隆位点插入到pzw1载体，重组质粒通过桑格测序进行验证。
95.2.体外转录：取1μg pcr扩增的5’端带有t7启动子的线性全序列,与2微升t7 rna体外转录酶、ratp、rctp、rutp和gmp(各5mm)以及rgtp(1mm)在37℃共孵育3.5小时，从而获得5'端和3'端具有不互补碱基序列的线性形式的circpolr2a的rna。
96.3.合成在5'端和3'端具有不互补碱基序列的线性形式的rna，
97.4.线性形式的rna进行5'端和3'端的不互补碱基序列末端去磷酸化处理及5'端加单磷酸化处理，
98.5.通过rna连接酶连接所述5'端以及3'端，得到环形rna，
99.6.将得到的环形rna进行page(polyacrylamide gel electrophoresis)纯化。
100.(2)方法二：通过rna体外转录实验(质粒构建和体外转录同方法一)及td group i内含子自剪切的方式环化(chen et al.,2017；wesselhoeft et al.,2018)的方式成功制备环形rna，并用page纯化的方式进行了体外纯化得到高纯度的circpolr2a。
101.(3)方法三：通过rna体外转录实验(质粒构建和体外转录同方法一)及anabeana group i内含子环化的方式(wesselhoeft et al.,2018)成功制备环形rna，并用page纯化的方式进行了体外纯化得到高纯度的circpolr2a。
102.实施例3，体外纯化circpolr2a后，转染人源a549细胞检测细胞因子ifn-beta，tnfα，il6和rig-i的表达量
103.通过上述三种环化的方式成功制备环形rna，并用page纯化的方式进行了体外纯化得到高纯度的circpolr2a。用脂质体转染的方法将上述体外三种环化方式制备并纯化的circpolr2a导入人源a549细胞，转染1小时或6小时后，收集细胞，进行q-pcr检测细胞因子ifn-beta，tnfα，il6和rig-i的表达量。
104.如图3所示，用方法一体外制备并纯化的circpolr2a导入人源a549细胞后，相对于转染双链rna底物poly(i:c)，未纯化的rna和线性的polr2a，体外制备并纯化的circpolr2a不会导致检测细胞因子ifn-beta，tnfα，il6和rig-i的表达量升高，充分说明方法一体外制备并纯化的circpolr2a并不会引起免疫反应。相对的，通过方法二和方法三体外制备并纯
化的circpolr2a导入人源a549细胞后，会导致检测细胞因子ifn-beta，tnfα，il6和rig-i的表达量升高，充分说明方法二和方法三体外制备并纯化的circpolr2a会引起免疫反应。以上实验结果说明，方法一体外制备并纯化的circpolr2a可作为作用靶点，且不会引起机体不必要的免疫反应。
105.实施例4，三种方法制备纯化的circpolr2a具有16bp-33bp的不完整双链结构及其二级结构示意图
106.步骤1：shape反应标记化合物nai对rna进行标记
107.通过上述三种环化的方式成功制备环形rna，加入shape反应标记化合物nai对rna进行标记，标记10分钟后，吸干液体。
108.步骤2：抽提和纯化已标记的rna
109.细胞置于冰上，加入trizol试剂(10cm培养皿加1ml；6cm培养皿加0.5ml；6孔板加0.2ml每空)。液体变粘稠，细胞脱壁，充分吹打至澄清。将细胞裂解液吸入depc处理后的ep管中，加入0.2倍体积的氯仿，震动15秒，颠倒数次，室温静置2-3分钟。4℃12000g离心15分钟，可见液体分层：底层-红色酚氯仿相；中间层-粉红色的交接相；上层-无色液相，rna全部在此相中。小心将上清转移至新的ep管中，切勿将中间层吸入，加入等体积的异丙醇，颠倒数次，室温静置10分钟。4℃12000g离心15分钟，弃上清，在ep管底部可见乳白色小沉淀物，即为rna。加入1ml 75％depc-乙醇洗2次。吸干上清，风干10分钟。加入depc水20-30μl，混匀，溶解rna。测浓度：a260/280 1.8-2.0之间，a260/230 2.0左右；a260 0.1-1之间，样品保存于-80℃。
110.步骤3：反转录获取cdna
111.(1)dnase处理rna，反应体系如下：
[0112][0113]
37℃反应30分钟，加入1μl stop buffer，65℃反应10分钟。
[0114]
(2)每个反应中加入0.5μg特定引物，72℃反应5分钟，冰上放置2分钟。
[0115]
(3)逆转录反应体系如下：
[0116][0117]
37℃反应60分钟，42℃反应180分钟。将反转录产物进行高通量测序rna-seq分析，并解析三种方式合成的circpolra rna的二级结构，绘制环形rna的二级结构图谱。如图4所示，包括三种方法制备纯化的circpolr2a均具有16bp-33bp的不完整双链结构。然而，方法2及方法3制备的环形rna相对于方法1制备的环形rna，其外源引入序列(红色部分)会形成稳定的双链茎环结构，推测该外源引入序列(红色部分)形成的稳定双链茎环结构引起了细胞内的天然免疫反应。
[0118]
实施例5，体外纯化circpolr2a及pkr蛋白质后，检测体外纯化circpolr2a对于pkr磷酸化激活水平的调控作用
[0119]
通过上述三种环化的方式成功制备环形rna，并用page纯化的方式进行了体外纯化得到高纯度的circpolr2a，通过his标签体外纯化的方式成功制备pkr蛋白质。用体外pkr磷酸化激活的实验方法将体外制备并纯化的circpolr2a与体外pkr磷酸化激活实验体系孵育，于37摄氏度反应30分钟后，变性收集蛋白质，进行同位素
32
p放射自显影实验检测体外pkr磷酸化激活的水平。
[0120]
如图5所示，体外制备并纯化的circpolr2a与体外pkr磷酸化激活实验体系孵育后，相对于方法二和三体外制备并纯化的circpolr2a，方法一制备的circpolr2a能够使体外pkr磷酸化激活水平显著下降。充分说明，并非所有体外制备方法都能获得能抑制pkr磷酸化的环状rna。。
[0121]
实施例6，方法一体外纯化circpolr2a及pkr蛋白质后，检测体外纯化circpolr2a对于pkr磷酸化激活水平相对于已知小分子抑制剂的调控作用
[0122]
通过上述三种环化的方式成功制备环形rna，并用page纯化的方式进行了体外纯化得到高纯度的circpolr2a，通过his标签体外纯化的方式成功制备pkr蛋白质。用体外pkr磷酸化激活的实验方法将体外制备并纯化的circpolr2a与体外pkr磷酸化激活实验体系孵育，并比较体外制备并纯化的circpolr2a与已知小分子抑制剂2-aminopurine(2-ap)(huang and schneider,1990)和c16(jammi et al.,2003)对于pkr磷酸化激活调控作用。于37摄氏度反应30分钟后，变性收集蛋白质，进行同位素
32
p放射自显影实验检测体外pkr磷酸化激活的水平。
[0123]
如图6所示，体外制备并纯化的circpolr2a与体外pkr磷酸化激活实验体系孵育后，相对于pkr小分子抑制剂2-ap和c16，circpolr2a能够使体外pkr磷酸化激活水平显著下降。充分说明，circpolr2a可作为作用靶点，体外制备并纯化的具有长度为16bp-33bp的不完整双链结构的环形rna及其表达产物可用于pkr抑制剂药物，且效果远优于(103～106倍)已知的pkr小分子抑制剂2-ap和c16。
[0124]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。