一种基于RPA-LF对蜡样芽孢杆菌的快速检测方法

本发明涉及食品安全和家畜养殖领域，尤其涉及一种基于rpa-lf对蜡样芽孢杆菌的快速检测方法，也是一种rpa-lf在蜡样芽孢杆菌检测当中的应用。

背景技术：

蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus.bc)是芽孢杆菌属的一种成短链或长链的革兰阳性杆菌，存在于土壤、灰尘、污水、饲料、植物及各类生熟食品中，对高温、紫外线、电磁辐射和有害化学物质刺激等条件具有较强的抵抗力。该菌以引起人食物中毒最为常见，并且除感染人以外，还可引起奶牛乳房炎和子宫内膜炎、犬猫腹泻和罗非鱼死亡等，给食品安全和养殖业发展带来严重危害。

我国国家标准gb4789.14-2014规定蜡样芽孢杆菌主要靠传统的培养方法进行检测，是将送检的样品增菌后进行分离培养，随后对分离培养的可疑菌株进行形态学和生化鉴定，再对鉴定结果进行综合评价，确定可疑菌株是否为蜡样芽孢杆菌。该方法检测周期长，过程繁琐，对工作人员实验技能要求高，并且只能在实验室操作无法在现场进行检测，因此，不利于蜡样芽孢杆菌的快速检验，对于经济落后的地区，仍然不能满足其对于蜡样芽孢杆菌的检测需求。

重组酶聚合酶扩增技术（recombinasepolymeraseamplification，rpa）是一种新型的恒温扩增技术，该技术主要依赖重组酶、单链dna结合蛋白和链置换dna聚合酶这三种物质，即可在恒温条件下实现核酸的指数倍扩增，从而形成了反应灵敏快速的rpa检测方法。2014年，rpa技术用于侧流层析（lateralflow，lf）检测，建立了rpa-lf体系。该体系经过短时间的恒温扩增反应后，肉眼即可观察检测结果，无须贵重仪器，操作简单，适合现场快速检测。

可是，由于该技术的实施需要对被测微生物设计特定的引物和探针，并且采用一系列特定的方法及技术参数，难度很大。因而，目前还没有看到rpa-lf用于蜡样芽孢杆菌，特别是牛致病性蜡样芽孢杆菌检测的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能对蜡样芽孢杆菌进行实地快速检测，且操作简单，成本低廉的快速检测方法。

为了上述目的，本发明采用了如下技术方案：

提供一种基于rpa-lf对蜡样芽孢杆菌的快速检测方法，其特点是：以蜡样芽孢杆菌保守毒力基因nhe为靶序列设计引物和探针：引物长度达到30~35bp，gc含量占比40%~60%，引物内部不含重复序列，扩增片段长度不超500bp，下游引物的5´末端标记生物素；探针长度至少达到42bp，5´末端用荧光基团（fam）进行标记，3´末端引入中断聚合酶扩增反应基团（3c-spacer）进行末端封闭，在探针中间引入thf，即无嘌呤无嘧啶位点(ap位点)，ap位点前至少要保留25bp的碱基，ap位点之后至少有15bp的碱基。

所述引物扩增段长度为100~200bp。

所述引物和探针设计为：

（1）引物：

上游引物：5´-ctagttatgagacatggttaaaatccacaacggc-3´

下游引物：5´-biton-cccaaagtcaagctgaagaggacattgatctgcc-3´

（2）探针：

fam-cataacttgaagaaagacgtattaacgatt(thf)acagctccgaatgaat-c3spacers

所述蜡样芽孢杆菌的检测温度为36~40℃。

所述蜡样芽孢杆菌的检测时间≤15min。

所述蜡样芽孢杆菌的检测浓度底限值为1.0×10²cfu·ml^-1。

有益效果：将rpa技术和lf技术相结合，构建了rpa-lf现场快速检测蜡样芽孢杆菌的方法，该方法不需要借助实验室的仪器设施，不依赖高素质技术人员，养殖户人员在养殖场内即可通过显色反应完成蜡样芽孢杆菌的检测，从而为防治蜡样杆菌病，特别是防止蜡样杆菌对牛的危害提供了条件。

附图说明

图1为rpa-lf特异性检测的试纸条形态图；

图2为rpa-lf灵敏性检测的试纸条形态图。

具体实施方式

一种蜡样芽孢杆菌rpa-lf快速检测方法，主要内容为：

1、引物设计及筛选：

引物在设计时要遵循长度达到30~35bp，gc含量占比40%~60%，引物内部不含重复序列，也要遵循所扩增片段长度不超500bp，其中以100~200bp为最佳扩增长度，下游引物的5´末端标记生物素；

具体做法是：以genbank公布的蜡样芽孢杆菌非溶血性肠毒素基因jq039111的保守序列为模板，用ncbiprimer-blast进行引物设计,再以该毒力基因dna为模板进行rpa扩增后，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并筛选出扩增效果最佳的引物。rpa-lf引物需将生物素（biotin）标记于5´端。即可设计出以下引物：

上游引物：5´-ctagttatgagacatggttaaaatccacaacggc-3´

下游引物：5´-biton-cccaaagtcaagctgaagaggacattgatctgcc-3´

2、探针设计及筛选：

根据筛选出的扩增效果最佳，种间特异性较好的引物，利用primer5.0软件进行探针的设计，探针位置在上游引物和下游引物之间。探针设计原则为：

（1）探针长度至少达到46bp；

（2）5´末端用羧基荧光素（fam）进行标记，3´末端引入3c-spacer进行末端封闭，在探针中间引入四氢呋喃脱碱基位点（thf），即无嘌呤无嘧啶位点(ap位点)；

（3）ap位点前至少要保留30bp的碱基，ap位点之后至少有15bp的碱基，下游引物的5´末端标记生物素。如此一来，探针和下游引物扩增产物的一端带有fam，另一端带有生物素（biotin），因此可以用lf检测。将设计好的探针送至生工生物工程有限责任公司合成，探针序列如下。

fam-cataacttgaagaaagacgtattaacgatt(thf)acagctccgaatgaat-c3spacers。

通过上述过程，设计了含有thf位点与荧光基团（fam）的nfo探针，同时将引物用生物素（biotin）进行标记，得到了既带有探针荧光集团标记物又带有引物标记物的双标记扩增子。这种双标记扩增子即可用于制备侧流层析试纸条。具体做法是：

首先制备免疫胶体金溶液并对其质量进行鉴定，再将制备好的胶体金溶液以30ml/cm均匀涂在金标垫上，置于37℃真空干燥箱过夜。其次将链酶亲和素和抗羧基荧光素抗体（fam）的二抗分别以1pl/cm喷涂至nc膜上作为检测线（ｔ线）与质控线（ｃ线），37℃干燥过夜。最后按样品垫、结合垫、nc膜、背板和吸水纸顺序,从左到右依次重叠连接,将这五个部分组装好，并切割成6cm×4mm的试纸条密封保存，便可制成市场上售卖的侧向层流试纸条。为方便应用和提高检测的准确性，以上所述试纸条可通过直接购买获得。其中，样品垫包含标记fam抗体的胶体金颗粒，和过滤特定样品成分的功能，结合垫可作为标记物附着载体。当检测结果为阳性时，含有fam和生物素双标记的扩增子在侧流层析过程中分别与胶体金颗粒偶联的fam抗体和t线上的链霉亲和素结合，导致t线显色，同时，胶体金颗粒偶联的fam抗体与c线处的抗fam的二抗结合，导致c线显色。若结果为阴性，则只有c线显色，t线不显色。rpa-lf的优点是经过短时间的恒温扩增反应后，肉眼即可观察检测结果。

为证明上述技术方案的效果，探索其最佳使用方法，进行了大量的实验。下面仅例举一个有代表性的实验：

（1）菌株及实验动物：蜡样芽孢杆菌来自某牛场猝死牛的脾脏；产气荚膜梭菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌均由内蒙古民族大学动物科技学院兽医病理学实验室提供。

（2）主要试剂及仪器：氯化钠、营养琼脂、葡萄糖等购自北京化工厂；酵母浸粉与蛋白胨由奥博星公司提供；细菌基因组dna提取试剂盒购自takara公司、电热恒温培养箱、恒温水浴锅、5424r台式高速离心机、全自动凝胶成像分析系统zf-258、电泳仪、电子天平、超净工作台等。

（3）rpa-lf特异性的测定

参照dna提取说明书对细菌基因组dna进行提取，分别提取产气荚膜梭菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌3种芽孢杆菌的dna作为模板，同时设置生理盐水阴性对照组，进行rpa-lf检测。38℃反应15min后结果如图1，图中试纸由左至右依次为生理盐水对照组、产气荚膜梭菌组、巨大芽孢杆菌组、枯草芽孢杆菌组与蜡样芽孢杆菌组，可见蜡样芽孢杆菌检测组试纸条上出现清晰的检测带，检测结果显示为阳性，其余各试验组与生理盐水阴性对照组结果相同均无检测条带出现，结果显示为阴性。试验结果表明，该检测方法具有较高的特异性，也表明该引物和探针的种间特异性较好，因此，接下来可选用此对引物和探针进行反应条件的优化。

（4）rpa-lf反应温度优化

以蜡样芽孢杆菌非溶血性肠毒素基因jq039111的保守序列为模板，用筛选出的最佳引物、探针进行扩增后，设置不同温度梯度：10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，8个不同温度试验组。按表1进行添加后，分别于上述温度恒温反应20min，反应结束后用侧向横流试纸条进行检测，选出最佳反应温度区域。之后以2℃为组间距对该区域内各温度进行试验，记录试验结果并进行分析。

将rpa反应产物添加至侧向横流试纸条5min后可见，10℃、15℃、20℃、25℃、45℃组试纸条检测线无条带，30℃组检测线出现颜色较浅条带，35℃、40℃组检测线明显。10min后可见10℃、15℃、20℃组试纸条检测线无条带，25℃与45℃组检测线出现颜色较浅条带，30℃、35℃、40℃组检测线明显。此结果表明35~40℃为组内rpa最佳反应温度区间。为缩小最佳反应温度区间并确定最佳反应温度，根据35~40℃温度区间，设置34℃、36℃、38℃、40℃为反应温度，进行检测。结果可见36℃、38℃、40℃组较34℃组更迅速出现明显条带，表明该反应的最佳温度区间为36~40℃。本实验设定38℃为反应温度。

（5）rpa-lf反应时间优化

以蜡样芽孢杆菌非溶血性肠毒素基因jq039111的保守序列为模板，用筛选出的最佳引物、探针进行扩增。为探明该rpa实验的最佳反应时间，设置5min、10min、15min、20min、25min、30min，6个不同反应时间试验组。按表1进行添加后，于38℃恒温条件下进行反应，待反应结束后用侧向横流试纸条进行检测，选出最佳反应时间区域。将各反应时长下的rpa反应产物添加至侧向横流试纸条15min后可见，5min反应组未出现条带，10min和15min反应组检测试纸条均出现检测带，但10min组检测带较浅，其余各组检测线均十分明显。此结果表明，10~15min的反应时间为该试验的最低有效检测区域。

为确定该反应的最短有效反应时间，以2min为组间距测定该区域内最佳反应时间。设置rpa反应时间为12min、14min、16min，经侧向横流试纸条检测，各试验组均可见检测条带，但14min、16min组条带出现时间及清晰度均高于10min组，因此本实验设定15min为该反应的最佳反应时间。

（6）rpa-lf灵敏性的测定

将培养12h的菌液用显微镜计数法获取细菌数量并计算浓度，之后将菌液浓度调至1.0×10¹⁰cfu·ml^-1作为起始浓度，再经倍比稀释将菌液浓度依次稀释为1.0×10⁹cfu·ml^-1、1.0×10⁸cfu·ml^-1、1.0×10⁷cfu·ml^-1、1.0×10⁶cfu·ml^-1、1.0×10⁵cfu·ml^-1、1.0×10⁴cfu·ml^-1、1.0×10³cfu·ml^-1、1.0×10²cfu·ml^-1、1.0×10¹cfu·ml^-1。用相同的细菌基因组dna提取方法对上述各浓度菌液进行dna提取，再依照rpa-lf反应成分进行添加，涡旋振荡混匀，38℃恒温环境反应20min。最后取2μlrpa产物添加到98μl缓冲液中混匀，再滴加10μl混合液于侧向横流试纸条，设置反应时间为15min，反应温度为38℃，记录实验结果，并分析该反应的灵敏性。

反应结果如图2所示，图中检测试纸由左至右依次为生理盐水对照组、浓度为1.0×10¹cfu·ml^-1、1.0×10²cfu·ml^-1、1.0×10³cfu·ml^-1、1.0×10⁴cfu·ml^-1、1.0×10⁵cfu·ml^-1、1.0×10⁶cfu·ml^-1、1.0×10⁷cfu·ml^-1检测组。结果可见，生理盐水对照组与1.0×10¹cfu·ml^-1的检测试纸上未见检测线产生，1.0×10²cfu·ml^-1组可见不明显的检测线，1.0×10³cfu·ml^-1组可见较清晰的检测线，其余各浓度检测组均可见清晰检测线。该结果表明本试验可对浓度达1.0×10²cfu·ml^-1以上的细菌进行检测。

本发明中，基于重组聚合酶等温扩增技术(rpa)和侧向横流试纸条技术(lf)，建立一种便携、快速的蜡样芽孢杆菌核酸检测方法，此方法为家畜养殖提供参考依据。本发明是以蜡样芽孢杆菌的毒力基因nhe为靶序列进行引物的设计，通过筛选出最佳的引物和探针建立的rpa-lf快速检测方法，同时还对该方法的检测时间、温度、特异性以及灵敏度进行了评估。结果表明，该方法在36℃-40℃，15min内可以得到检测结果，与其它常见芽孢杆菌无交叉反应，具有高度的特异性，可对浓度达1.0×10²cfu·ml^-1以上的细菌进行检测，具有高度的灵敏性。

以上所述，仅为本发明较好的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。