一种抗肿瘤的白桦醇衍生物、制备方法及其应用与流程

本发明属于化学药物合成技术领域，涉及一种抗肿瘤的白桦醇衍生物、制备方法及其应用。

背景技术：

白桦醇又名白桦醇酯、桦木醇，属于羽扇豆烷类五环三萜，是一种广泛存在于各种植物中的天然产物。具有广泛的生物活性，尤其对肿瘤细胞的增殖具有优良的抑制活性，以此得到了相关技术领域人员的更多的青睐，但由于白桦醇的选择性低，生物利用度不高，溶解性也达不到临床应用的需求。为使天然产物发挥理想的功效，人们尝试对其结构经行改性，以完善其性质。为此，人们做了这方面的大量研究，例如，chrobak等(molecules，2016，21(9):1123－1135)在白桦醇结构中引入磷酸酯，获得一系列具有磷酸酯结构的白桦醇，虽然这些类化合物具有较好的抗肿瘤活性，但是分子中含有过多的酯基，使化合物在水中的溶解性下降，未达到白桦醇结构改性的主要目的；bebenek等(medicinalchemistryresearch，2017，26(1):1－8)等在白桦醇28位羟基上连接一些列长短、饱和程度不同的烃基链，但是这些化合物在杀死肿瘤细胞的同时，对正常结肠细胞造成一定的损伤，因此此方法得到的白桦醇衍生物存在缺陷。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种抗肿瘤的白桦醇衍生物，其衍生物具有式(i)分子结构：

本发明的一个目的在于提供抗肿瘤的白桦醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)以白桦醇为原料，在室温条件下加入有机溶剂a充分溶解，在温度为-10～0℃下缓慢加入草酰氯，加入2～3滴dmf(n,n-二甲基甲酰胺)，升温至室温反应2～5h，反应结束，去除多余的氯化亚砜，得到化合物1；

(2)将化合物1溶解在有机溶剂b中，加入吲哚乙酸，室温下搅拌反应4～8h，薄层色谱显示反应无进展。在反应液中加入碳酸氢钠溶液，再用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，有机相先后用饱和食盐水、5％盐酸溶液洗涤，干燥、浓缩，粗产物用硅胶柱分离纯化得目标产物粗品，将目标产物粗品经高效液相色谱分离纯化，即得目标产物；

上述制备方法，步骤(1)中，所述有机溶剂a为二氯甲烷、丙酮、乙腈、四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺或乙醚；

所述白桦醇与所述草酰氯的投料摩尔比为1:2.0～4.0；

上述制备方法，步骤(2)中，所述有机溶剂b为二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿、二甲基亚砜或丙酮；

所述吲哚乙酸与化合物2的投料摩尔比为1.2:1.8～2.5:3.0；

所述硅胶柱洗脱液采用石油醚和丙酮的混合液体系，所述石油醚和丙酮的体积比为10～20:1；

所述高效液相色谱分离纯化条件如下：

色谱柱：c18柱或c8柱；流动相：甲醇-水溶液，甲醇与水的体积比为68:36；检测波长为278～320nm；柱温：25～40℃；每次进样量为0.5～1.2ml；流速为10～15ml/min，收集40～55min的色谱峰，多次累计后干燥即得目标产物。

根据上述制备方法的一种优选，包括如下步骤：

(1)以15g白桦醇为原料，在室温条件下加入丙酮，充分溶解，在温度为-5～0℃下缓慢加入4.5g草酰氯，加入2～3滴dmf(n,n-二甲基甲酰胺)，升高温度反应5h，反应结束，去除多余的氯化亚砜，得到化合物1；

(2)将7.5g化合物1溶解在二氯甲烷中，加入6.4g吲哚乙酸，室温下搅拌反应6h，薄层色谱显示反应无进展。在反应液中加入碳酸氢钠溶液，再用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，有机相先后用饱和食盐水、5％盐酸溶液洗涤，干燥、浓缩成浸膏，将浸膏经硅胶柱层析洗脱，以体积为15:1的石油醚和丙酮混合液进行梯度洗脱，收集洗脱液浓缩，得目标产物粗品；将上述目标产物粗品使用高效液相色谱进行分离，色谱条件为：以甲醇-水溶液为流动相，c18柱为固定相，流动相流速为15ml/min，紫外检测波长为285～290nm，柱温为25℃，每次进样量为1.0～1.2ml，收集停留时间为44.5min的色谱峰，多次累计后，用无水硫酸钠干燥，即得目标产物。

本发明衍生物用于治疗人卵巢癌、人白血病和人黑色素瘤。

本发明衍生物用于制备抗人黑色素瘤药物。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的白桦醇衍生物对人卵巢癌细胞(skov3)、人白血病细胞(k562)、人黑色素瘤细胞(a875)具有显著的抑制活性，其中，白桦醇衍生物对人黑色素瘤细胞(a875)的半数抑制浓度(ic50)为12.39μg/ml，其效果略与阳性药物顺铂(ic50＝10.67μg/ml)相当，说明本发明的化合物可用于制备抗人黑色素瘤的药物。

附图说明

图1：实施例1为抗肿瘤白桦醇衍生物核磁共振氢谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

实施例1

(1)以15g白桦醇为原料，在室温条件下加入丙酮，充分溶解，在温度为-5～0℃下缓慢加入4.5g草酰氯，加入2～3滴dmf(n,n-二甲基甲酰胺)，升高温度反应5h，反应结束，去除多余的氯化亚砜，得到化合物1；

(2)将7.5g化合物1溶解在二氯甲烷中，加入6.4g吲哚乙酸，室温下搅拌反应6h，薄层色谱显示反应无进展。在反应液中加入碳酸氢钠溶液，再用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，有机相先后用饱和食盐水、5％盐酸溶液洗涤，干燥、浓缩成浸膏，将浸膏经硅胶柱层析洗脱，以体积为15:1的石油醚和丙酮混合液进行梯度洗脱，收集洗脱液浓缩，得目标产物粗品；将上述目标产物粗品使用高效液相色谱进行分离，色谱条件为：以甲醇-水溶液为流动相，c18柱为固定相，流动相流速为15ml/min，紫外检测波长为285～290nm，柱温为25℃，每次进样量为1.0～1.2ml，收集停留时间为44.5min的色谱峰，多次累计后，用无水硫酸钠干燥，即得目标产物。产率为79.09％。

核磁共振氢谱检测：

将样品放入样品管中，用注射器取0.5mlcdcl3(氘代氯仿)注入样品管，使样品充分溶解。要求样品与试剂充分混合，溶液澄清、透明、无悬浮物或其他杂质，经核磁共振鉴定，得到核磁共振氢谱图，结果见如图1。

实验例2本发明化合物的抗肿瘤药学研究

(1)体外试验：将白桦醇衍生物与白桦醇分别用二甲基亚砜(dmso)溶解，再用培养液(含10％胎牛血清的rpmi1640培养液)配制成浓度为2mg/ml的储备液置于-20℃保存。临用前，用培养液稀释白桦醇衍生物与白桦醇的终浓度分别为2.5μg/ml、5.0μg/ml、10μg/ml、25.0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml，且其中任意稀释供试液中dmso终浓度控制在0.01％以下。将人胃腺癌细胞株(bgc-823)、人卵巢癌细胞株(skov3)、人白血病细胞株(k562)、人食道癌细胞株(ec9706)、人黑色素瘤细胞株(a875)作为测试细胞株分别用0.25％的胰酶消化后，悬浮于含10％胎牛血清的rpmi1640培养液中，用玻璃滴管轻轻吹打成单细胞悬液进行细胞计数，之后用培养液稀释至浓度为20000个细胞/ml。取顺铂用dmso溶解，用培养液(10％胎牛血清的rpmi1640培养液)配制成顺铂浓度为1mg/ml的储备液置于-20℃保存。临用前，再用培养液稀释至终浓度分别为50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.12μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml和0.39μg/ml，且其中任一稀释供试品中dmso终浓度控制在0.01％以下，作为阳性对照药。在96孔培养板的每一个孔中加入100μl生长良好的肿瘤细胞(约2000个细胞/孔)，24小时培养待细胞完全贴壁后，每孔分别加入100μl供试液(白桦醇衍生物、白桦醇、顺铂)，每组平行设六个复孔，并设阴性对照(加培养基和癌细胞，不加药)和空白对照(只加培养基，不加癌细胞)。置于37℃、co2浓度为5％的条件下培养72h。然后，每孔加入mtt液20μl(5mg/l)，继续培养4h，弃去培养液，每孔加入100μldmso，待结晶完全溶解后，用酶标仪与490nm处侧吸光度值，即od值。计算细胞增殖抑制率。每组供试品重复实验3次，取平均值。

测试结果：阴性对照组，细胞生长良好，无生长抑制现象，说明试验方法可行。供试液组所测得的ic50值如表1所示。

表1本发明化合物对癌细胞的半数抑制浓度(ic50)

由表1的测试结果表明，本发明的白桦醇衍生物对人卵巢癌细胞(skov3)、人白血病细胞(k562)、人黑色素瘤细胞(a875)具有显著的抑制活性，其中，白桦醇衍生物对人黑色素瘤细胞(a875)的半数抑制浓度(ic50)为12.39μg/ml，其效果略与阳性药物顺铂(ic50＝10.67μg/ml)相当，说明本发明白桦醇衍生物在疗癌症方面显示了巨大的潜力。

(2)体内试验：本发明衍生物对裸鼠人黑色素瘤细胞影响

选取处于生长旺盛期的肿瘤组织，在无菌生理盐水溶液中剪成2mm³左右的小块，在无菌环境下接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠皮下移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100～200mm³后将动物随机分为空白对照组(对照组1)、阳性药对照组(对照组2)、白桦醇对照组(对照组3)、白桦醇衍生物(实验组)，除空白组外，其余每组小鼠的给药剂量为20mg/kg，每天1次，连续培养21天，阳性药物为顺铂，空白组给予等量的蒸馏水。在实验过程中，每周测量2次移植瘤直径，计算肿瘤体积、相对肿瘤体积和相对肿瘤增殖率，同时称量小鼠体重。肿瘤体积(tv)＝1/2×a×b²,其中a、b分别为长、宽；相对肿瘤体积(rtv)＝vt/vo，其中vt为每一次测量时肿瘤体积，vo为给药时测量的肿瘤体积。相对肿瘤增殖率t/c(％)＝(trtv/crtv)×100％，trtv是治疗组rtv，crtv是阴性对照组的rtv。结果见表2。

表2本发明化合物对人肝癌细胞抑制作用

由表2的测试结果表明，本发明的白桦醇衍生物可以显著抑制人黑色素瘤细胞的增长，相对肿瘤体积(rtv)为6.02±3.15、相对肿瘤增殖率t/c为29.40％，相比于顺铂，其抑制效果略微降低。