一种解有机磷细菌PR47及其应用

本发明涉及菌株的筛选和应用的技术领域，尤其涉及一种解有机磷细菌pr47及其应用。

背景技术：

据报道，我国有2/3的土壤缺磷，缺磷的主要原因是由于土壤有效磷含量不足，施入土壤的磷肥，只是部分被农作物吸收利用，而相当一部分与土壤胶体或金属离子发生反应形成难以被植物利用的形态，从而降低了磷的利用率。

土壤中存在着许多具有不同解磷能力的微生物，微生物通过自身作用以及与其他生物协同作用将难溶性的磷元素转化为可溶性的，供自身或其他生物利用。一般将具有溶解有机磷酸盐能力的微生物称作解有机磷微生物，它们能够促进植酸钙等难溶的有机磷释放出可溶性磷，提高土壤中可溶性磷的含量，从而可明显地促进农作物的生长，使其根系发达，增强农作物的抗病能力。目前报道的解磷细菌有芽孢杆菌属(bacillussp.)、沙雷氏菌属(serratiasp.)、假单胞菌属(pseudomonassp.)、变形杆菌属(proteussp.)等。因此，对解磷微生物菌剂及其应用的研究，已经成为当前土壤微生物修复研究的热点，对提高土壤肥力和促进农作物增产具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有降解有机磷能力的菌株。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种解有机磷细菌pr47，拉丁文为pseudomonasfrederiksbergensis。

本发明还提供了所述解有机磷细菌pr47降解有机磷的应用。

优选的，所述有机磷为植酸钙。

本发明还提供了一种降解有机磷的方法，包括如下步骤：

(1)将解有机磷细菌pr47进行扩大培养，制得种子液；

(2)取所述种子液中的菌体，用质量分数为0.8～0.9％的氯化钠溶液定容至15～20ml，得到菌液；

(3)将所述菌液接种到有机磷液体培养基中降解有机磷。

优选的，所述扩大培养用的培养基为lb液体培养基。

优选的，所述扩大培养的条件为36～38℃、150～200r/min振荡培养18～22h。

优选的，所述种子液的od值为0.5～0.8。

优选的，步骤(2)中所述菌体通过将所述种子液离心得到，所述离心是在4800～5200r/min下离心2～5min。

优选的，所述菌液与有机磷液体培养基的体积比为1～5:50，所述菌液的浓度为10⁶～10⁸cfu/ml。

优选的，所述降解有机磷的条件为36～38℃、150～200r/min振荡培养8～15h。

本发明提供了一种具有降解有机磷作用的菌株pr47，该菌株具有较强的降解有机磷的能力。其溶磷圈直径和菌落直径的比值(d/d)达到2.7，从植酸钙中活化出来的速效磷含量达到0.48mg/l，活化率达到91.22％。

附图说明

图1为解有机磷细菌pr47在有机磷固体培养基上形成的溶磷圈。

具体实施方式

本发明提供了一种降解有机磷的方法，包括如下步骤：

(1)将解有机磷细菌pr47进行扩大培养，制得种子液；

(2)取所述种子液中的菌体，用质量分数为0.8～0.9％的氯化钠溶液定容至15～20ml，得到菌液；

(3)将所述菌液接种到有机磷液体培养基中降解有机磷。

本发明是利用解有机磷细菌pr47对有机磷进行降解，首先将解有机磷菌pr47进行扩大培养，制得种子液。

在本发明中，所述扩大培养用的培养基优选为lb液体培养基。所述lb液体培养基的配方优选为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，加蒸馏水至1000ml，ph7.0～7.2。

在本发明中，所述扩大培养的温度优选为36～38℃，进一步优选为37℃。

在本发明中，所述扩大培养优选为振荡培养，所述振荡的转速优选为150～200r/min，进一步优选为180r/min。

在本发明中，所述扩大培养的时间优选为18～22h，进一步优选为20h。

在本发明中，所述种子液的od值优选为0.5～0.8，进一步优选为0.6。

培养得到种子液后，取所述种子液中的菌体，用质量分数为0.8～0.9％的氯化钠溶液定容至15～20ml，得到菌液。

在本发明中，从所述种子液中得到菌体的方法优选为离心。

在本发明中，所述离心的转速优选为4800～5200r/min，进一步优选为5000r/min。

在本发明中，所述离心的时间优选为2～5min，进一步优选为3min。

在本发明中，获得菌体后，还优选用0.85％的氯化钠溶液清洗菌体3次。

在本发明中，进一步优选用0.85％的氯化钠溶液将菌体定容至15ml。

在本发明中，所述菌液的浓度优选为10⁶～10⁸cfu/ml，进一步优选为10⁷cfu/ml。

将所述菌液接种到有机磷液体培养基中降解有机磷。

在本发明中，所述有机磷液体培养基的配方优选为：葡萄糖10g/l、植酸钙2g/l、六水氯化镁5g/l、七水硫酸镁0.25g/l、氯化钾0.2g/l、硫酸铵0.1g/l，加蒸馏水至1000ml，ph7.0。

在本发明中，所述菌液与有机磷液体培养基的体积比优选为1～5:50，进一步优选为2:50。

在本发明中，所述降解有机磷的温度优选为36～38℃，进一步优选为37℃；优选振荡培养的转速为150～200r/min，进一步优选为180r/min；时间优选为8～15h，进一步优选为12h。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1样品的采集、菌株的分离和纯化

(1)样品的采集本发明提供的解有机磷细菌pr47来自甘肃省农业技术推广总站的野生牡丹-紫斑牡丹根际土壤。采集方法如下：先将土壤表层可见杂物去除，根据五点采样法，在距离植株10cm处利用土钻收集根际土壤，装入无菌袋中，置于冰盒内保存。到达实验室后用毛刷将附着在根系上的土壤刷下来，收集后混匀，放于4℃冰箱中冷藏保存、备用。

(2)菌株的分离在超净工作台中，用毛刷将附着在根系上的土壤刷下，收集后混匀。然后称取5g土壤于无菌离心管中，用无菌水定容至50ml，振荡20min，然后按照10倍梯度依次用无菌水进行稀释，用移液枪吸取10^-6、10^-5、10^-4三个稀释度样品各0.1ml，均匀涂布于有机磷固体培养基中，每个梯度重复3次，最后在28℃恒温箱中倒置培养，并观察菌落生长状况及透明圈产生情况。

(3)菌株的纯化待有机磷固体培养基中产生溶磷圈后，用接种环挑取具有溶磷圈且未发生重叠的菌落，在新的有机磷固体培养基按z字形划线纯化，之后在28℃恒温箱中倒置培养，得到纯菌株pr47，将其保存在4℃冰箱中。

在本实施例中，所述有机磷固体培养基的配方为：葡萄糖10g/l、植酸钙2g/l、六水氯化镁5g/l、七水硫酸镁0.25g/l、氯化钾0.2g/l、硫酸铵0.1g/l、琼脂粉15g/l、蒸馏水1000ml，ph7.0。

实施例2菌株的鉴定

采用axyprep细菌基因组dna小量制备试剂盒(axygen，usa)提取菌株pr47的基因组dna，具体步骤按照操作说明进行。利用细菌通用引物27f(5’-agagtttgatcctggctcag-3’)和1492r(5’-ctacggctaccttgttacga-3’)对基因组dna进行扩增，得到pcr产物。pcr产物用axyprepdna凝胶回收试剂盒回收，具体步骤按照操作说明进行。取各个样品纯化后的pcr产物，在上海派森诺生物科技股份有限公司使用abi3730-xl测序仪进行双向测序。所得序列用chromaspro软件截去无效序列后，利用bioedit软件对双端有效序列进行拼接，得到有效序列(如序列表中seqidno.1所示)，然后将有效序列在ncbi数据库中利用blast程序，与ncbi数据库中的参考序列进行比对，发现菌株pr47为pseudomonasfrederiksbergensis。

实施例3菌株解有机磷实验

(1)菌株pr47解有机磷能力的定性分析将分离纯化的菌株pr47点接于有机磷固体培养基上，置于28℃恒温箱中倒置培养3d，观察溶磷圈产生情况，结果如图1。从图1可观察到菌株pr47产生了溶磷圈。选取两个或多个互相垂直的方向分别测量溶磷圈直径(d)和菌落直径(d)，根据d/d比值初步判断解磷细菌的解磷能力，经测量本发明提供的菌株pr47的d/d比值为2.7，具有较强的解有机磷能力。此外，根据菌株pr47产生的溶磷圈的大小也可以直观的判断出菌株对有机磷具有较强的降解能力。

(2)菌株pr47解有机磷能力的定量分析将分离纯化的菌株pr47接种于lb液体培养基中，于37℃、180r/min振荡培养20h，测量种子液的od值为0.6时，在5000r/min下离心3min，弃上清液，用0.85％的nacl溶液清洗菌体三次，再用0.85％的nacl溶液定容至15ml，制得浓度为10⁷cfu/ml的菌液。充分摇匀后用移液枪从中吸取1ml加到有机磷液体培养中，做三次重复，于37℃、180r/min振荡培养12h，随后摇匀并用移液枪吸取1.5ml培养液于无菌的1.5ml离心管中，12000×g离心2min，吸取1ml上清液作为待测液，采用钼锑抗比色法测定培养液中速效磷的含量。

在本实施例中，所述有机磷固体培养基的配方为：葡萄糖10g/l、植酸钙2g/l、六水氯化镁5g/l、七水硫酸镁0.25g/l、氯化钾0.2g/l、硫酸铵0.1g/l、琼脂粉15g/l、蒸馏水1000ml，ph7.0。

在本实施例中，所述lb液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，加蒸馏水至1000ml，ph7.0～7.2。

在本实施例中，所述有机磷液体培养的配方为：葡萄糖10g/l、植酸钙2g/l、六水氯化镁5g/l、七水硫酸镁0.25g/l、氯化钾0.2g/l、硫酸铵0.1g/l，加蒸馏水至1000ml，ph7.0。

经过测定，本发明提供的解磷菌株pr47从植酸钙中活化出来的速效磷含量为0.48±0.06mg/l，对植酸钙的活化率达到91.22±1.03％。活化率＝(接种菌株样品中的速效磷含量-不接种菌株样品中的速效磷含量)/接种菌株样品中的速效磷含量×100％。

由以上实施例可知，本发明提供了一种具有降解有机磷能力的菌株pr47，该菌株具有较强的降解有机磷的能力。其溶磷圈直径和菌落直径的比值(d/d)达到2.7，从植酸钙中活化出来的速效磷含量达到0.48mg/l，活化率达到91.22％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>河南科技大学

<120>一种解有机磷细菌pr47及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1442

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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gc1442