CsCRC蛋白及其编码基因在调控植物果实长度中的应用

cscrc蛋白及其编码基因在调控植物果实长度中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种cscrc蛋白及其编码基因在调控植物果实长度中的应用。


背景技术：

2.黄瓜(cucumis sativus l.)是世界十大蔬菜之一，也是广泛栽培的葫芦科蔬菜作物，具有重要的经济价值和生物学意义。近年来黄瓜产业以高产优质作为育种目标，而果实长是影响黄瓜外观品质和产量的重要农艺性状。野生型黄瓜具有小而圆的果实，经过漫长的驯化过程演变成现在的果实较大、形状丰富多样的栽培黄瓜。由于不同地域环境、气候条件和市场选择，黄瓜果长在不同品种间差异巨大，可以在5-60cm间变化(che and zhang.,2019)。
3.黄瓜果实大小直接影响果实产量和品质，并在驯化期间作为目标品质而进行了大量选择育种改良。黄瓜的果形根据不同品种而有巨大的差异，可生长圆形到长柱形的果实(bo et al.,2015)。在黄瓜中，果实大小由果实长度(l)，直径(d)或l/d比率决定(naegele and wehner,2017)。野生黄瓜c.sativus l.var.hardwickii的果实长度只有3-5厘米，而栽培黄瓜的果实长度从5到60厘米不等。目前研究发现十余个共有数量性状位点(qtl)(fs1.1、fs1.2、fs2.1、fs2.2、fs3.1、fs3.2、fs3.3、fs4.1、fs5.1、fs6.1、fs6.2和fs7.1)与果实大小有关(weng et al.,2015)：其中fs1.2、fs2.1和fs2.2参与黄瓜径向生长；fs3.2和fs3.3调节果实伸长；fs5.2对黄瓜的圆形果实形状影响最大(pan et al.,2017a)；fs1.2由番茄果实形状控制基因sun(命名为cssun)的同源基因控制，调节圆形果实形状(pan et al.,2017b)。虽然已知10余个调控黄瓜果长的qtl，但其具体的候选基因和调控机理知之甚少。
4.转录因子crabs claw(crc)基因在植物生长发育和形态建成上发挥作用。crabs claw(crc)基因在拟南芥上属于yabby基因家族的成员，具有该家族典型的n端c2c2型锌指结构域和c端yabby(螺旋-环-螺旋)结构域(alvarez and smyth,1999；bowman and smyth,1999；eshed et al.,1999；yamaguchi et al.,2004)。yabby基因家族在高等植物的生长发育以及形态建成方面发挥着重要的生物学功能(eckardt,2010；finet et al.,2016)。有研究表明，crc在拟南芥上作用于心皮纵向和横向发育、蜜腺的形成、花柱和柱头的发育以及花分生组织的有限性生长。在水稻上crc同源基因drooping leaf参与并调控叶片结构发育和花器官的有限性生长。在加州罂粟(已知的双子叶植物中具有代表性的最古老的物种)中的eccrc的表达下调，产生额外的器官发生于雌蕊内，导致第四轮花器官的重复；心皮极性和胚珠起始缺陷明显，观察到的表型仅限于雌蕊上，从而推断出crc在植物上最原始的作用是心皮发育调控功能(orashakova et al.,2009)，而对于蜜腺发育的调控是根据蜜腺与生殖器官的关联相伴而衍生出来的功能(lee et al.,2005)。综上所述，crc类基因在不同植物中演变出了植物特异性的功能，并无法预知其在其他尚未研究过的植物中的功能。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种可有效调控植物果实长度的方法。
6.具体地，本发明的技术方案如下：
7.第一方面，本发明提供cscrc蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在调控植物果实长度中的应用。
8.第二方面，本发明提供cscrc蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在选育果实伸长的转基因植物中的应用。
9.第三方面，本发明提供cscrc蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在植物果实伸长种质资源改良中的应用。
10.本发明从黄瓜自交系r1461中分别克隆得到黄瓜cscrc基因，成功构建了cscrc-oe过表达载体与cscrc-rnai干扰载体，并分别转化短果型wi7237_fs5.2(nil)黄瓜与长果型r1461黄瓜，获得cscrc基因过表达及rnai干扰黄瓜阳性植株。与短果型黄瓜(nil)植株相比，过表达cscrc基因的转基因植株中果实长度显著增加。相反，与长果型黄瓜(r1461)植株相比，cscrc基因的rnai干扰转基因植株果实长度显著下降。从而发现，黄瓜cscrc蛋白及其编码基因可调控植物果实的长度，进而提出本发明。
11.本发明中，所述cscrc蛋白具有以下任意一种氨基酸序列：
12.1)seq id no.2所示的氨基酸序列；或
13.2)seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。
14.所述cscrc蛋白的cdna具有以下任一种核苷酸序列：
15.(1)seq id no.1所示的核苷酸序列，或
16.(2)seq id no.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；
17.(3)在严格条件下可以与seq id no.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。
18.所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
19.所述植物为黄瓜。
20.第四方面，本发明提供一种改变植物果实长度的方法，其通过转基因、基因敲除、rna干扰、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，控制植物对cscrc基因的表达。
21.所述转基因包括利用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导的方法将包含所述cscrc基因的重组表达载体导入植物，获得转基因植物株系。
22.所述基因敲除包括利用dna同源重组技术、cre/loxp技术或crispr/cas9技术将所述cscrc基因敲除，获得转基因植物株系。
23.本发明的有益效果至少在于：
24.本发明发现黄瓜cscrc蛋白及其编码基因在调控植物果实发育中具有重要的理论意义和实用价值。为培育果实长度增加的新品种提供了新的基因资源。
附图说明
25.图1为cscrc基因全长克隆胶图。m为分子量标准。
between hd-zip iii and cswus transcription factors regulating anther and ovule development in cucumis sativus(cucumber).plant journal 94:535-547)，用于表达分析及遗传转化；wi7167、wi7200、wi7237及wi7237_fs5.2(nil)由美国威斯康辛大学翁益群教授惠赠(该材料公开于pan,y.,qu,s.,bo,k.,gao,m.,haider,k.r.,and weng,y.,2017a.qtl mapping of domestication and diversifying selection related traits in round-fruited semi-wild xishuangbanna cucumber(cucumis sativus l.var.xishuangbannanesis).theoretical and applied genetics 130:1531-1548.)，用于图位克隆、检测crc基因的snp位点以及遗传转化。黄瓜材料种植于中国农业大学日光温室中，标准水肥管理。黄瓜生长到开花期，取幼嫩果实，迅速放入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用。
37.2、rna的提取
38.采用华越洋公司rna提取试剂盒提取雌果总rna，用dnaseⅰ去除样品中残留的dna。
39.3、cdna的获得
40.已提取的rna为模板，利用艾德莱公司的反转录试剂盒将其反转录成cdna。反应程序为42℃50min，70℃5min。将反转录产物cdna溶液稀释到100ng/ul作为反应模板或储存于-20℃冰箱。
41.4、目的基因的扩增
42.以步骤3获得的cdna为模板，采用引物cscrc-oe-f和cscrc-oe-r进行pcr，得到pcr产物为cscrc基因的全长。引物序列如下：
43.cscrc-oe-f：gctctagagcatgagtaactccgaagacaaa(如seq id no.4所示)；
44.cscrc-oe-r：tcccccgggggatcattcattgttgttgtgag(如seq id no.5所示)。
45.以同样模板，采用引物cscrc-rnai-1 f、cscrc-rnai-1 r进行pcr扩增，得到pcr产物分别为rnai载体的正义片段。采用引物cscrc-rnai-2 f、cscrc-rnai-2 r进行pcr扩增，得到pcr产物分别为rnai载体的反义片段。引物序列如下：
46.cscrc-rnai-1-f：
47.ttggcgcgccaaatgagtaactccgaagacaaatc(如seq id no.6所示)；
48.cscrc-rnai-1-r：
49.gcgatttaaatcgggggggtttgacaacaaaatt(如seq id no.7所示)。
50.cscrc-rnai-2-f：
51.ggactagtccatgagtaactccgaagacaaatg(如seq id no.8所示)；
52.cscrc-rnai-2-r：
53.cgggatcccggggggtttgacaacaaaatt(如seq id no.9所示)。
54.pcr反应体系如表1所示。pcr反应程序如表2所示。
55.表1目的基因cscrc开放阅读框全长序列扩增体系
56.组分体积5
ⅹ
prime star缓冲液10μldntp4μl引物(10μm)上下游各1μl模板cdna2μl
prime star hs dna polymerase0.5μlddh2o31.5μl总计50μl
57.表2 pcr反应程序
58.预变性95℃，5min变性95℃，30s退火57℃，30s延伸72℃，1min延伸72℃，5min
59.备注：从变性到第一个延伸进行35次循环。
60.5、pcr产物的检测
61.pcr产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，切下符合目标基因长度的条带(图1-图2)，利用胶回收试剂盒进行胶回收，将胶回收产物进行测序。cscrc基因核苷酸序列如seq id no.1所示，蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示，rnai干扰载体中发卡结构的核苷酸序列如seq id no.3所示(利用rnai技术沉默cscrc基因表达的沉默载体中发卡结构的核苷酸序列)。
62.实施例2 cscrc基因在调控黄瓜果实伸长中的应用
63.1、构建cscrc表达载体
64.为了鉴定cscrc基因在调控黄瓜果实伸长中的功能，本发明将实施案例1中获得的cscrc编码序列(如seq id no.1所示)连接到过表达载体pbi121中，构建cscrc基因过表达载体，转化感受态农杆菌gv3101，遗传转化黄瓜品种wi7237_fs5.2(nil)。将实施例1中获得的cscrc干扰正义片段及干扰反义片段克隆入rnai干扰载体pfgc1008中，转化感受态农杆菌gv3101，遗传转化黄瓜品种r1461号。具体步骤如下：
65.(1)将测序正确的克隆基因质粒和过表达载体pbi121用限制性内切酶xbaⅰ和bamhⅰ运用表3酶切体系进行双酶切；将测序正确的干扰片段质粒和干扰载体pfgc1008用限制性内切酶speⅰ和swaⅰ进行双酶切。
66.表3酶切体系
67.组分体积cutsmart buffer5μl酶各1μl回收片段1μgddh2o至50μl总计50μl
68.(2)37℃过夜酶切后，回收目的片段，按照表4反应体系进行连接。目的片段与表达载体片段进行16℃连接过夜。将连接好的目的片段-表达载体重组质粒转化大肠杆菌，通过pcr鉴定选择阳性菌液送华大公司测序。
69.表4载体连接体系
70.组分体积
solutionⅰ5μl载体片段2μl基因片段3μl总计10μl
71.2、重组载体转化农杆菌后侵染黄瓜
72.测序正确的菌株，进行质粒提取。用化转法进行转化农杆菌感受态gv3101，在28℃培养36h到48h后菌落pcr鉴定筛选，加50％甘油后于-80℃冰箱保存。
73.利用农杆菌介导法，将发芽后2天的黄瓜子叶切除生长点进行侵染，然后进行共培养2天，再转移至分化培养基上培养至发生不定芽，切下不定芽诱导生根至长成再生植株。将再生植株移栽至营养土中。
74.3、鉴定转基因植株
75.(1)提取dna进行pcr鉴定：提取已移栽的幼苗叶片dna作为模板进行pcr鉴定。不同重组表达载体鉴定引物如下：
76.pbi121-f：gctcctacaaatgccatcattg(如seq id no.10所示)；
77.pbi121-r：cgaaaccaatgcctaaagagag(如seq id no.11所示)。
78.pfgc1008-f：cgtcttcaaagcaagtggatt(如seq id no.12所示)；
79.pfgc1008-r：cgaaaccaatgcctaaagagag(如seq id no.13所示)。
80.pcr验证结果如图3和图4。
81.(2)提取rna进行qrt-pcr鉴定：
82.提取对照植株与经pcr鉴定后的转基因阳性植株(oe-14、oe-36和ci10、ci37、ci119)幼嫩果实rna，进行qrt-pcr鉴定。qrt-pcr反应体系见表5。所用引物如下：
83.cscrc-rt-f：cactgttcttgcggttggg(如seq id no.14所示)；
84.cscrc-rt-r：ctgagactgaaaagttagaggatg(如seq id no.15所示)。
85.表5 qrt-pcr反应体系
86.组分体积sybr premix ex taq5μl引物各0.5μlcdna模板1μlddh2o3μl总计10μl
87.验证结果如图5中的c和图6中的c所示。
88.4、转基因株系黄瓜果实长度测定
89.选取经过pcr和qrt-pcr验证的过表达转基因株系oe-14和oe-36，及rnai干扰株系ci-10、ci-37和ci-119。对野生型黄瓜幼苗及转基因株系黄瓜果实进行果实长度测定。在同一种植环境下，生长期和长势相同的对照植株和代表性的转基因株系上选取统一节位(10-20)的果实(n＝15)进行了表型观察与统计分析。结果参见图5和图6中的a、b、d、e。
90.从图5和图6中可知，在过表达转基因株系中，cscrc的表达量增加了约两倍，导致商品期10daa的果长在oe-14(18.9
±
0.7cm)和oe-36(20.1
±
1.1cm)中显著长于对照nil(13.6
±
1.4cm)，果长增加了约47.8％。在基因沉默转基因株系中，cscrc的表达量下降至
0.3倍，导致商品期10daa的果长在对照wt r1461植株的平均果长为35.6
±
3.2cm，而转基因株系ci10的平均果长为27.7
±
1.7cm，降幅约为22.2％。从而证明过表达cscrc基因的转基因植株中果实长度显著增加，cscrc基因的rnai干扰转基因植株果实长度显著下降。
91.4、cscrc基因的表达模式分析
92.为了研究黄瓜cscrc的表达模式，从野生型黄瓜r1461上取样(根、茎、叶、雄花冠、雌花冠、雄花芽、雌花芽、小果(果1为1cm小果，果2为2cm小果，果3为3cm小果，果5为5cm小果)、蜜腺、花萼、花瓣和心皮(花柱))进行实时荧光定量，并且取不同时期的顶点固定后进行原位杂交(结果参见图7)。荧光定量结果显示，cscrc在黄瓜蜜腺中的表达量极其高，其次是雌花芽和1cm小果。原位杂交结果显示，cscrc在sam和早期花芽分化过程中无表达，在花芽分化时期即将起始雌蕊原基的细胞中开始表达。在雄花芽分化过程中，从雌蕊原基起始到终止发育都在其远轴端稳定表达。在雌花芽分化时，心皮发育过程中在心皮原基和中果皮内表达强烈。果实纵切中发现，在子房发育的后期随着果实成熟，cscrc在中果皮内的信号逐渐减弱，蜜腺内cscrc表达依然强烈。幼嫩果实的横切中发现，cscrc信号集中在中果皮果肉细胞内，却不在周缘维管束中表达。
93.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。