一株四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌FD4-8及应用

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8及应用。

背景技术：

解有机磷细菌是指能够分解有机磷化合物的细菌，其种类多种多样，不同细菌的解磷机制各有不同。微生物对有机磷的降解机制一般认为与其分泌的酶有关，解有机磷细菌通过分泌胞外磷酸酶对有机磷进行酶解。当磷元素成为微生物生长的主要限制因子时，微生物就会释放出胞外磷酸酶，将有机磷水解为有效磷，与此同时，微生物胞内碱性磷酸酶会被诱导合成并不断积累。

杰氏假单胞菌(pseudomonasjessenii)，属于假单胞菌属中的一种。目前尚未见将此菌株用于降解有机磷的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于为了丰富微生物降解有机磷的菌种，提供一株四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8及应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8，所述杰氏假单胞菌的拉丁文为pseudomonasjessenii，16srdna的序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8在解有机磷方面的应用。

作为优选，所述有机磷为植酸钙。

本发明还提供了四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8解有机磷的方法，包括如下步骤：

(1)将杰氏假单胞菌fd4-8进行扩大培养，得到扩大培养的解有机磷的菌株；

(2)将得到的扩大培养的解有机磷的菌株进行处理，制成解有机磷的菌液；

(3)将解有机磷的菌液接种于有机磷液体培养基中进行培养，降解有机磷。

作为优选，步骤(1)中扩大培养的培养基为lb培养基。

作为优选，步骤(1)中扩大培养的条件为：培养温度为35～39℃，培养转速为160～200r/min，培养时间为18～22h。

作为优选，步骤(2)中所述解有机磷的菌液的od值为0.5～0.7。

作为优选，步骤(2)中制成解有机磷的菌液的溶剂为质量分数为0.8～0.9％的nacl溶液。

作为优选，步骤(3)中的培养条件为：培养温度为35～39℃，培养转速为160～200r/min，培养时间为10～14h。

本发明提供的菌株可以从植酸钙中活化出的速效磷含量为4.96mg/l，对植酸钙的活化率达到59.66％。本发明丰富了降解有机磷的菌种类型。

附图说明

图1为杰氏假单胞菌fd4-8在有机磷培养基上形成的溶磷圈。

具体实施方式

本发明提供了一株四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8，所述杰氏假单胞菌的拉丁文为pseudomonasjessenii，16srdna的序列如seqidno.1所示。

在本发明中，所述四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8，采自河南省洛阳市河南科技大学开元校区试验农场的四年生油用牡丹根际土壤中。

在本发明中，所述四年生油用牡丹根际土壤的采集方法为：先将土壤表层可见的杂物去除，根据五点采样法，在距离植株8～12cm处利用土钻收集根际土壤，装入无菌袋中，置于冰盒内保存。到达实验室后用毛刷将附着在根系上的土壤刷下来，收集后混匀，放于4℃冰箱中冷藏保存、备用。

在本发明中，所述四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8的分离步骤包括如下步骤：

(1)称取采集得到的四年生油用牡丹根际土壤，放入无菌离心管中，用无菌水定容后，混匀，得到混合均匀的根际土壤溶液；

(2)将混合均匀的根际土壤溶液依次进行梯度稀释，得到稀释的根际土壤溶液；

(3)将稀释的根际土壤溶液均匀涂布于有机磷固体培养基上，培养并纯化，得到四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8。

在本发明中，所述四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8的分离步骤在超净工作台中进行的。

在本发明中，所述无菌离心管中放入的四年生油用牡丹根际土壤的质量为4～6g，优选为5g。

在本发明中，所述无菌水定容的体积为40～60ml，优选为50ml。

在本发明中，所述混匀为振荡器混匀。

在本发明中，所述混匀的时间为15～25min，优选为20min。

在本发明中，所述根际土壤溶液依次进行梯度稀释的梯度为10倍梯度。

在本发明中，所述涂布的稀释根际土壤溶液的稀释度为10^-6-10^-4。

在本发明中，所述涂布的稀释根际土壤溶液的体积为100μl。

在本发明中，所述有机磷固体培养基为改良的国际植物研究所磷酸盐生长培养基nbrip。

在本发明中，所述nbrip培养基中的磷酸三钙替换为植酸钙。

在本发明中，所述植酸钙的用量为2g/l。

在本发明中，所述培养温度为26～30℃，优选为28℃。

在本发明中，所述培养为倒置培养。

在本发明中，所述纯化方式为z字形划线纯化。

在本发明中，所述纯化得到的菌株保存在2～6℃的冰箱中，优选为4℃。

在本发明中，所述纯化步骤在超净工作台中进行。

在本发明中，所述四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8的鉴定包括如下步骤：

(1)提取已纯化菌株的基因组dna，得到基因组dna；

(2)将基因组dna进行pcr扩增，得到pcr产物；

(3)将pcr产物进行纯化，得到纯化的pcr产物；

(4)通过对纯化的pcr产物进行测序，分析鉴定得到四年生油用牡丹根际的菌株fd4-8为杰氏假单胞菌。

在本发明中，所述提取纯化菌株基因组dna的方式为：利用axyprep细菌基因组dna小量制备试剂盒进行提取。

在本发明中，所述pcr扩增的引物为：

27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’

和1492r：5’-ctacggctaccttgttacga-3’

在本发明中，所述将pcr产物进行纯化是采用axyprepdna凝胶回收试剂盒进行纯化。

在本发明中，所述对纯化的pcr产物进行测序，是在上海派森诺生物科技股份有限公司的abi3730-xl测序仪上进行双向测序。

在本发明中，所述对菌株的分析鉴定步骤为：用chromaspro软件截去无效序列，利用bioedit软件对双端有效序列进行拼接，然后将有效序列在ncbi数据库中利用blast程序，与ncbi数据库中的参考序列进行比对，获得与待测菌株序列相似性最大的菌株信息，即为鉴定结果。

本发明还提供了四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8在解有机磷方面的应用。

在本发明中，所述有机磷为植酸钙。

在本发明中，所述菌株解磷能力的定性检测方法为溶磷圈测定法。

在本发明中，所述溶磷圈测定法为：将纯化得到菌株点接于有机磷固体培养基中，培养，测量溶磷圈和菌落的大小并计算两者的比值。

本发明还提供了四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8解有机磷的方法，包括如下步骤：

(1)将杰氏假单胞菌fd4-8进行扩大培养，得到扩大培养的解有机磷的菌株；

(2)将得到的扩大培养的解有机磷的菌株进行处理，制成解有机磷的菌液；

(3)将解有机磷的菌液接种于有机磷液体培养基中进行培养，降解有机磷。

在本发明中，所述步骤(1)扩大培养的培养基为lb培养基。

在本发明中，所述步骤(1)扩大培养的温度为35～39℃，优选为36～38℃，进一步优选为37℃。

在本发明中，所述步骤(1)扩大培养的转速为160～200r/min，优选为180r/min。

在本发明中，所述步骤(1)扩大培养的时间为18～22h，优选为19～21h，进一步优选为20h。

在本发明中，所述步骤(2)中解有机磷的菌液的od值为0.5～0.7，优选为od值为0.6。

在本发明中，所述步骤(2)中制成解有机磷的菌液的溶剂为质量分数为0.8～0.9％的nacl溶液，优选为质量分数为0.85％的nacl溶液。

在本发明中，所述制成的解有机磷的菌液的体积为15ml。

在本发明中，所述解有机磷的菌液取0.5～1.5ml接种于有机磷液体培养基中，优选为取1.0ml的量进行接种。

在本发明中，所述步骤(3)的培养温度为35～39℃，优选为36～38℃，进一步优选为37℃。

在本发明中，所述步骤(3)的培养转速为160～200r/min，优选为180r/min。

在本发明中，所述步骤(3)的培养时间为10～14h，优选为11～13h，进一步优选为12h。

在本发明中，所述测定培养液中速效磷含量的方法为钼锑抗比色法。

在本发明中，所述钼锑抗比色法测定的液体为：降解有机磷后得到液体的上清液。

在本发明中，所述得到上清液采用的方法为离心法。

在本发明中，所述离心的转速为10000～14000r/min，优选为12000r/min。

在本发明中，所述离心时间为1～3min，优选为2min。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1一株四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8的分离纯化

先将河南省洛阳市河南科技大学开元校区试验农场种植的四年生油用牡丹根际土壤表层可见的杂物去除，根据五点采样法，在距离植株10cm处利用土钻收集根际土壤，装入无菌袋中，置于冰盒内保存。到达实验室后用毛刷将附着在根系上的土壤刷下来，在超净工作台中称取新鲜土壤样品5g于无菌离心管中，用无菌水定容至50ml，振荡20min，然后按10倍梯度依次进行稀释，用移液枪吸取10^-6～10^-4三个稀释度样品各0.1ml，均匀涂布于有机磷固体培养基上，每个梯度重复三次。最后在28℃恒温箱中倒置培养。

用接种环挑取具有溶磷圈且未发生重叠的菌落，在新的有机磷固体培养基上按照z字形划线进行纯化，28℃恒温箱中倒置培养，直至得到纯菌株，然后置于4℃冰箱中保存。

实施例2四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8的鉴定

采用axyprep细菌基因组dna小量制备试剂盒提取细菌的基因组dna。利用细菌通用引物27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’和1492r：5’-ctacggctaccttgttacga-3’对基因组dna进行扩增，得到pcr产物。将pcr产物用axyprepdna进行纯化。将纯化的pcr产物，在上海派森诺生物科技股份有限公司使用abi3730-xl测序仪进行双向测序。用chromaspro软件截去无效序列后，利用bioedit软件对双端有效序列进行拼接，然后将有效序列在ncbi数据库中利用blast程序，与ncbi数据库中的参考序列进行比对，获得与待测菌株序列相似性最大的菌株为pseudomonasjessenii，同源性为：99％。

应用实施例1四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8的定性解磷能力分析

将分离纯化得到的菌株点接于有机磷固体培养基上，置于28℃恒温箱中倒置培养3d，观察溶磷圈产生情况，并选取两个或多个互相垂直的方向分别测量溶磷圈直径(d)和菌落直径(d)，根据d/d比值对各菌株的解磷能力进行初步判断。杰氏假单胞菌fd4-8在有机解培养基上形成的溶磷圈见图1。杰氏假单胞菌fd4-8的解磷能力见表1。

应用实施例2四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8的定量解磷能力检测

将筛选得到的菌株接种于lb液体培养中，于37℃、180r/min振荡培养20h，测量菌液的od值，使其od值＝0.6，然后在5000r/min下离心3min，弃上清液后，用0.85％的nacl溶液清洗菌体三次，再用0.85％的nacl溶液定容至15ml，充分摇匀后用移液枪从中吸取1ml加到有机磷液体培养基中，每个菌株重复三次，于37℃、180r/min振荡培养12h。随后摇匀并用移液枪吸取1.5ml菌液于无菌的1.5ml离心管中，12000r/min离心2min，吸取1ml上清液作为待测液，采用钼锑抗比色法测定培养液中速效磷的含量。检测结果见表1。

表1杰氏假单胞菌fd4-8解磷能力分析

由以上实施例可知，本发明提供了一株四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8及应用。本发明提供的菌株可以从植酸钙中活化出的速效磷含量为4.96mg/l，对植酸钙的活化率达到59.66％。丰富了降解有机磷的菌种类型。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>河南科技大学

<120>一株四年生油用牡丹根际杰氏假单胞菌fd4-8及应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1440

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggtaccgtcctcccgaaggttagactagctacttctggtgcaacccactcccatggtgtg60

acgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcgacattctgattcgcgattac120

tagcgattccgacttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccggactacgatcggtttt180

gtgggattagctccacctcgcggcttggcaaccctctgtaccgaccattgtagcacgtgt240

gtagcccaggccgtaagggccatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccggtttgt300

caccggcagtctccttagagtgcccaccataacgtgctggtaactaaggacaagggttgc360

gctcgttacgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcac420

ctgtctcaatgttcccgaaggcaccaatccatctctggaaagttcattggatgtcaaggc480

ctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcc540

cccgtcaattcatttgagttttaaccttgcggccgtactccccaggcggtcaacttaatg600

cgttagctgcgccactaagagctcaaggctcccaacggctagttgacatcgtttacggcg660

tggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcacctcagtgtcagta720

tcagtccaggtggtcgccttcgccactggtgttccttcctatatctacgcatttcaccgc780

tacacaggaaattccaccaccctctaccatactctagcttgtcagttttgaatgcagttc840

ccaggttgagcccggggctttcacatccaacttaacaaaccacctacgcgcgctttacgc900

ccagtaattccgattaacgcttgcaccctctgtattaccgcggctgctggcacagagtta960

gccggtgcttattctgtcggtaacgtcaaaattgcaacgtattaatttactgcccttcct1020

cccaacttaaagtgctttacaatccgaagaccttcttcacacacgcggcatggctggatc1080

aggctttcgcccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctggaccgtg1140

tctcagttccagtgtgactgatcatcctctcagaccagttacggatcgtcgccttggtga1200

gccattacctcaccaactagctaatccgacctaggctcatctgatagcgcaaggcccgaa1260

ggtcccctgctttctcccgtaggacgtatgcggtattagcgttcctttcgaaacgttgtc1320

ccccactaccaggcagattcctaggcattactcacccgtccgccgctgaattcaggagca1380

agctcctgtcatccgctcgacttgcatgtgttaggcctgccgccagcgttcaatctgagc1440