1.本发明属于医用止血材料领域，涉及一种抗氧化高吸液倍率止血海绵的制备方法。
背景技术：
2.不可控性出血是目前人们生活中面临的一种生命威胁，也是医院急救人员所面临的挑战之一，因而制备具有安全高效止血性能的材料具有很强的现实意义。明胶具有抗原性低、生物相容性好、生物降解性好、成本相对低廉的优势，作为止血材料受到广泛的关注，然而明胶类制品的机械强度差，需要与其它机械强度高的材料进行复合或是通过交联来增加它的强度。以金陵海绵为代表的一类市面上常见的明胶海绵通常是通过甲醛、戊二醛等小分子醛类进行交联的，吸液很慢，止血性能一般，而且醛类具有一定的生物毒性，因而开发高效吸液、快速止血、生物安全性更高的明胶基止血材料迫在眉睫。
3.天然多酚是一类以苯酚作为基本骨架，苯环上的多羟基取代为特征的植物次生代谢产物的总称，它们具有抗氧化、抗肿瘤等多种功能，而伤口在愈合阶段常会面临感染、发炎等风险，因而多酚的抗氧化特性使得它在减弱机体的炎症反应方面具有潜在的应用。lan等通过在壳聚糖、明胶的混合搅拌过程中加入单宁酸进行交联，提高了海绵的强度，且海绵的止血性能进一步提高[colloids and surfaces b:biointerfaces 136(2015)1026
–
1034]，其方法缺陷在于单宁酸在酸性条件下加入，只能发生单宁酸与壳聚糖/明胶的氢键交联作用，不能发生化学交联
‑
席夫碱反应，使得海绵的机械强度一般，吸液倍率不高(<25倍)，不利于止血；此外，搅拌过程转速对明胶基海绵性能的影响也没有关注。
技术实现要素：
[0004]
有鉴于此，本发明提供一种抗氧化高吸液倍率止血海绵的制备方法。本发明具体提供了如下的技术方案：
[0005]
一种抗氧化高吸液倍率止血海绵的制备方法，包括以下步骤：
[0006]
1)配置壳聚糖的醋酸溶液，将明胶溶于热水中，然后加入到上述溶液中，经过低速搅拌进行混合交联，一段时间后，提升转速，进行高速发泡，直到获得均匀稳定的泡时，停止发泡；将发泡液倒入模具中，经过低温冷冻干燥后，获得发泡海绵，将发泡海绵浸泡在无水乙醇溶液中洗涤醋酸，然后进行真空干燥；所述的明胶与壳聚糖的质量比为1：(1.5～10)；
[0007]
2)配置天然多酚的碱性溶液，浓度为1～10mg/ml，ph调节至8～10，将步骤1)真空干燥后的发泡海绵浸泡在天然多酚的碱性溶液中进行交联，然后取出发泡海绵，用去离子水进行洗涤，洗涤后将发泡海绵低温冷冻，进行二次冷冻干燥。
[0008]
进一步，步骤1)所的低速搅拌的温度为30
‑
55℃。
[0009]
进一步，步骤1)所述的壳聚糖和明胶混合后溶液浓度为10～100mg/ml，低速搅拌的转速为100
‑
600rpm，所述的交联的时间为5
‑
120min。
[0010]
进一步，步骤1)所述的壳聚糖的脱乙酰度为75％
‑
95％，数均分子量为2
‑
100万。
[0011]
进一步，步骤1)所述的明胶的动力100
‑
300ps，数均分子量5万
‑
100万。
[0012]
进一步，步骤1)所述的高速发泡时间为10min
‑
120min，高速发泡的转速为700
‑
1800rpm。
[0013]
进一步，步骤1)所述的明胶和壳聚糖的质量比为1:9
‑
3:7。
[0014]
进一步，步骤2)所述的天然多酚为茶多酚、原花青素、单宁酸、鞣花酸中的一种或几种。
[0015]
进一步，步骤2)所述的浓度为2
‑
4mg/ml。
[0016]
进一步，步骤2)所述的交联的时间为10
‑
200min。
[0017]
本发明的有益效果在于：本发明采用天然多酚交联的壳聚糖/明胶混合反应制得的复合止血海绵，控制高速搅拌速度、时间和壳聚糖与明胶比例、浓度可实现溶液在搅拌下发泡，同时发泡后冻干形成的海绵吸液后更柔软，易贴附创面，利于止血。第二步加入天然多酚，一方面选择碱性条件下的酚羟基可与明胶/壳聚糖中的氨基进行希夫碱交联反应，使得制得的海绵形成更为稳定交联的网络结构，大大增强了明胶海绵的吸液倍率，使海绵的机械强度大大增强。另一方面，第二步引入的大量天然多酚还可以提供止血海绵抗氧化性能，有利于伤口的抗氧化消炎，进而促进伤口愈合。
[0018]
天然多酚/明胶/壳聚糖复合发泡止血海绵是植物多酚类物质、生物基的胶原降解产物和多糖的有机结合，三者之间的混合交联既可以充分发挥了明胶发泡体系的高吸液倍率，又可以改善明胶制品机械强度差的劣势(acs appl.mater.interfaces 9(2017)29457
–
29468.)，而且正电性壳聚糖的加入可以进一步增强了海绵的止血性能；天然多酚具有抗氧化性能，这使得所制备的天然多酚/明胶/壳聚糖复合发泡止血海绵在止血后防止促进伤口消炎，加速伤口的愈合。本发明按上述方法制备的高吸液倍率抗氧化复合止血海绵，是一种具有优异的止血性能、良好的生物相容性、良好抗氧化性能的高效止血材料，有望应用于临床。
具体实施方式
[0019]
下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。
[0020]
实施例1
[0021]
1)称取1g明胶溶于50ml去离子水中；称取1g壳聚糖溶于50ml醋酸/水混合溶液中。40度水浴条件下将明胶和壳聚糖溶液以1:9质量比混合，然后200rpm低速搅拌10min进行混匀交联，然后提升转速至1100rpm进行发泡，发泡35min后倒入培养皿，低温冷冻，然后进行冷冻干燥。将冷冻干燥后的海绵用乙醇洗涤醋酸，多次洗涤后，进行真空干燥。
[0022]
2)将单宁酸溶于tris缓冲液(ph＝9)，浓度5mg/ml，将上述得到的海绵浸泡单宁酸15min，然后取出海绵进行洗涤，用去离子水洗涤三次后，低温冷冻，然后进行二次冻干。
[0023]
实施例2
[0024]
1)称取1g明胶溶于50ml去离子水中；称取1g壳聚糖溶于50ml醋酸/水混合溶液中。40度水浴条件下将明胶和壳聚糖溶液以3:7质量比混合，然后200rpm低速搅拌15min进行混匀交联，然后提升转速至1300rpm进行发泡，发泡25min后倒入培养皿，低温冷冻，然后进行冷冻干燥。将冷冻干燥后的海绵用乙醇洗涤醋酸，多次洗涤后，进行真空干燥。
[0025]
2)将原花青素溶于tris缓冲液(ph＝8.5)，浓度3mg/ml，将上述得到的海绵浸泡该
溶液中0min，然后取出海绵进行洗涤，用去离子水洗涤三次后，低温冷冻，然后进行二次冻干。
[0026]
对比例1
[0027]
称取1g明胶溶于50ml去离子水中；称取1g壳聚糖溶于50ml醋酸/水混合溶液中，均配成20mg/ml溶液，然后倒入培养皿，40度水浴条件下将上述溶液以4:6质量比混合，然后600rpm低速搅拌30min进行混匀交联，直接低温冷冻，然后进行冷冻干燥。将冷冻干燥后的海绵用乙醇洗涤醋酸，多次洗涤后，进行真空干燥。
[0028]
对比例2
[0029]
1)称取1g明胶溶于50ml去离子水中；称取1g壳聚糖溶于50ml醋酸/水混合溶液中，均配成20mg/ml溶液。40度水浴条件下将上述溶液以3:7质量比混合，然后600rpm低速搅拌60min进行混匀交联，然后提升转速至2000rpm进行发泡，发泡65min后倒入培养皿，低温冷冻，然后进行冷冻干燥。将冷冻干燥后的海绵用乙醇洗涤醋酸，多次洗涤后，进行真空干燥。
[0030]
2)将原花青素溶于tris缓冲液(ph＝8.5)，浓度3mg/ml，将上述得到的海绵该溶液15min，然后取出海绵进行洗涤，用去离子水洗涤三次后，低温冷冻，然后进行二次冻干。
[0031]
对比例3
[0032]
1)称取1g明胶溶于50ml去离子水中；称取1g壳聚糖溶于50ml醋酸/水混合溶液中，均配成20mg/ml溶液。40度水浴条件下将明胶和壳聚糖溶液以6:4质量比混合，然后600rpm低速搅拌60min进行混匀交联，然后提升转速至1300rpm进行发泡，发泡65min后倒入培养皿，低温冷冻，然后进行冷冻干燥。将冷冻干燥后的海绵用乙醇洗涤醋酸，多次洗涤后，进行真空干燥。
[0033]
2)将单宁酸溶于去离子水中，浓度为3mg/ml，将上述得到的海绵浸泡该溶液30min，然后取出海绵进行洗涤，用去离子水洗涤三次后，低温冷冻，然后进行二次冻干。
[0034]
对比例4
[0035]
1)称取1g明胶溶于50ml去离子水中；称取1g壳聚糖溶于50ml醋酸/水混合溶液中，均配成20mg/ml溶液。40度水浴条件下将明胶和壳聚糖溶液以5:5质量比混合，然后600rpm低速搅拌45min进行混匀交联，然后提升转速至1300rpm进行发泡，发泡35min后倒入培养皿，低温冷冻，然后进行冷冻干燥。将冷冻干燥后的海绵用乙醇洗涤醋酸，多次洗涤后，进行真空干燥。
[0036]
2)将单宁酸溶于去离子水中，浓度为0.1mg/ml，将上述得到的海绵浸泡该溶液30min，然后取出海绵进行洗涤，用去离子水洗涤三次后，低温冷冻，然后进行二次冻干。
[0037]
对比例5
[0038]
称取1g明胶溶于50ml去离子水中；称取1g壳聚糖溶于50ml醋酸/水混合溶液中，均配成20mg/ml溶液。40度水浴条件下将上述溶液以5:5质量比混合，同时加入5ml配置好的10mg/ml原花青素溶液，然后600rpm低速搅拌60min进行混匀交联，然后提升转速至1300rpm进行发泡，发泡65min后倒入培养皿，低温冷冻，然后进行冷冻干燥。将冷冻干燥后的海绵用乙醇洗涤醋酸，多次洗涤后，进行真空干燥。
[0039]
对比例6
[0040]
市售金陵可吸收明胶海绵
[0041]
测试例1
对比例160
±
3对比例256
±
1对比例354
±
2对比例455
±
4对比例550
±
1对比例663
±2[0056]
测试例3
[0057]
将本发明制备的抗氧化高吸液倍率止血海绵和对比例1和4的明胶止血海绵进行抗氧化性能对比实验。
[0058]
检测方法：此实验需要在完全避光的条件下进行：首先配制含有20μm维生素b2、12.5mm dl
‑
蛋氨酸、75μm亚硝基四唑蓝的pbs(ph＝7.4，25mm)溶液，与海绵粉末混合后(海绵分散液浓度为2mg/ml)，紫外光照15min。照射后混合物的吸光度(560nm)为阳性对照(a
p
)，照射前为阴性对照(a
n
)，照射后含海绵粉末混合物的吸光度为(a0)，计算超氧自由基的清除效率。
[0059]
o2·
scavenging rate(％)＝1
‑
(a0‑
an/ap
‑
an)
×
100％％
ꢀꢀꢀ
(3
‑
3)
[0060]
材料对超氧自由基清除率越高，则代表材料的抗氧化性越好。
[0061]
表3各实施例及对比例样品的止血实验结果
[0062]
分组超氧自由基清除率(％)实验例146
±
3实验例250
±
4对比例110
±
2对比例421
±2[0063]
从表1
‑
表3中可以看出，本发明实施例1和2的吸液倍数远高于对比例1
‑
6，凝血指数低于对比例1
‑
6，超氧自由基清除率也高于对比例1和4，原因如下：
[0064]
本发明实施例1和实施例2，通过控制壳聚糖和明胶的复合比例、发泡转速来调控第一步复合海绵的性能，通过控制二次交联过程中多酚交联的ph，以及交联多酚的量，使得适量的多酚交联负载到了海绵上，来调控第二步复合海绵的性能，从而提高吸液倍率和止血性能，也具有较好的抗氧化性能。
[0065]
对比例1没有加多酚，由于没有多酚的交联，海绵的机械强度低，因而会产生吸液后海绵塌陷的问题，吸液倍率下降，并且因为没有多酚的负载，海绵的止血性能差，抗氧化性差。
[0066]
对比例2发泡转速过高，产生了过度发泡，海绵的自身机械强度降低，因而会产生吸液后海绵塌陷的问题，导致吸液倍率下降。
[0067]
对比例3明胶含量高，使得交联不够，发泡较多，泡孔变大变多，使得海绵的机械性更变差，由于没有控制碱性反应条件进行二次交联，使得只有少部分多酚以氢键形式负载到海绵上，并不能有效提高其机械强度，因而会产生吸液后海绵塌陷的问题，导致吸液倍率下降，因为极少多酚的负载，导致海绵的止血性能差。
[0068]
对比例4是多酚的浸泡浓度小于1mg/ml，明胶含量高，多酚负载量少，吸液倍数低，止血性能差，抗氧化性差。
[0069]
对比例5是一步法混合，壳聚糖溶液是酸性，在酸性条件下，多酚上的酚羟基和明胶、壳聚糖只能进行氢键这种物理交联，造成吸液倍数低，止血性能差。
[0070]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。