一种同时过表达N个miRNA的方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种n个mirna同时过表达载体的构建及应用。
背景技术：
：植物microrna(mirna)是植物中广泛存在的一种长度为20～22nt的srna，其前体基因pri-mirna经过dicer-liker1(dcl1)两步剪切，分别形成pre-mirna和mirnaduplex后，其中mirna*被降解，另一条成熟mirna进入ago蛋白形成rna沉默复合物(rna-inducedsilencingcomplexes，riscs)，行使沉默靶标功能。研究发现证实植物保守的mirna通过靶标各类转录因子和信号转导的基因调控植物生长发育和抵御逆境的胁迫。mirna-riscs对mrna的作用主要取决于复合体与靶基因转录序列的互补程度，通常一个mirna可以标靶多个基因，而几个mirna也可以同时调节一个靶基因，基于这种复杂的调节网络，通过一个mirna来调控多个基因的表达，也可以通过几个mirna的组合来精细调控某个基因的表达。对水稻mirna基因的过量表达是研究其生物学功能的重要策略之一。目前常用的方法是将目的mirna的前体序列克隆到特定的启动子驱动的双元载体后转化，进而研究mirna的功能[陈志文，水稻六个mirna表达载体的构建和遗传转化，2013年4月]。该方法只能对单个水稻mirna进行研究，无法对多个可能调控同一生物学过程的mirna同时进行研究。上述方法还因为在载体中常用的启动子为35s启动子而在水稻中表达效果较弱，对mirna功能研究产生较大限制。因此有必要对以上不足加以改进和创新突破。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种可同时表达多个mirna的方法，以实现多个mirna同时高效过表达，用于对某一类生理进程具有共同响应的多个mirna的功能研究。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种同时过表达n个mirna的方法，2≤n≤4，包括以下步骤：s1、针对目标mirna，设计pcr引物，以基因组dna为模板，pcr扩增获得包括编码目标mirna茎环结构以及茎环结构前端160～220bp序列和茎环结构后端160～220bp序列的前体序列片段；s2、将n个mirna的前体序列片段进行拼接，得到拼接序列；s3、将拼接序列插入到表达质粒的多克隆位点，得到过表达载体；s4、将过表达载体转入受体材料中，n个mirna同时过表达。步骤s1中，针对每个目标mirna，对应其前体基因，设计pcr引物，利用pcr扩增技术获得前体基因片段。本发明研究发现，构建多个mirna过表达载体时，能否实现多个mirna同时成功表达，对于mirna前体序列长度的选择至关重要，保留pre-mirna即茎环结构前后160～220bp序列，多个mirna得以同时表达。优选的，步骤s1中，前体序列编码目标mirna茎环结构以及茎环结构前端190～210bp序列和茎环结构后端190～210bp序列。步骤s2中，采用分子生物学技术手段对n个mirna的前体序列片段进行拼接。优选的，利用重叠pcr技术对n个mirna的前体序列片段进行拼接。步骤s3中，采用分子生物学技术手段将拼接序列插入到表达质粒的多克隆位点，以获得启动子-拼接序列-终止子的双元载体。具体的，采用双酶切连接技术构建重组质粒，该方法操作简便易行。优选的，所述表达质粒的启动子为ubi，相比于camv35s启动子，玉米泛素基因的植物启动子ubi在水稻中具有更高表达活性。终止子为nos终止子。更为优选，所述表达质粒为pcubi1390双元载体，有利于后续转基因实验。进一步的，n个mirna为水稻mir-397a、mir-398a、mir-408、mir-528中的至少2种。研究表明，上述4个mirna调控于同一生理途径，因此，构建同时表达这4个mirna的表达载体，应用于水稻功能研究。优选的，编码mir-397a的前体序列的核苷酸序列如seqidno.1所示，编码mir-398a的前体序列的核苷酸序列如seqidno.2所示，编码mir-408的前体序列的核苷酸序列如seqidno.3所示，编码mir-528的前体序列的核苷酸序列如seqidno.4所示。具体的，n个mirna为水稻mir-397a、mir-398a、mir-408、mir-528，所述过表达载体包括双元载体pcubi1390以及插入在pcubi1390多克隆位点的核苷酸序列如seqidno.5所示的拼接序列。本发明提供了一个同时表达水稻mir-397a、mir-398a、mir-408、mir-528的方法，将上述过表达载体转入通过农杆菌介导过表达载体转入受体水稻中，培育，上述4个mirna同时过表达。本发明具备的有益效果：本发明将多个mirna的前体序列进行拼接，再将连接片段连至双元载体中，构建过表达载体以实现在植物中的转化表达，每个mirna的前体序列中包含了mirna的茎环结构，表达的mirna能够发挥其功能，前体序列还包含了茎环结构前后160～220bp序列，使得多个mirna得以同时正常表达，可对多个mirna同时进行功能研究。本发明方法构建的过表达载体在实现mirna调控水稻等作物农艺性状研究中具有重要应用价值。附图说明图1为mir397a、mir398a、mir408、mir528基因的克隆。图2为过表达载体pcubi1390质粒图谱。图3为mir397a、mir398a、mir408、mir528基因片段连接流程图。图4为mir397a与mir398a基因片段通过重叠pcr连接，mir408、mir528基因片段通过重叠pcr连接。图5为mir397a、mir398a、mir408和mir528基因片段通过重叠pcr整合为一条片段。图6为pcubi1390-mirs过表达质粒在烟草瞬时表达，验证mir397a、mir398a、mir408和mir528的表达情况。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1(1)水稻mir397a(内含pre-mir397a序列)、mir398a(内含pre-mir398a序列)、mir408(内含pre-mir408序列)、mir528(内含pre-mir528序列)基因的克隆。根据mir397a、mir398a、mir408、mir528序列，设计pcr扩增引物，如表1所示，以水稻日本晴材料dna为模板，pcr扩增，获得mir397a、mir398a、mir408、mir528前体基因，核苷酸序列分别如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4所示。表1mir397a-fttctaattttagcgtgaactaaacamir397a-rgaattgctatgtgcaaactacggagmir398a-facatggatgatctttttccttctccmir398a-rgaataaatattacccaaatttatgamir408-fgggcaaattggcaggctatgagatgmir408-rgccgaatgaaatgcatgttttgagcmir528-fgctgaaagccatagtacactgatgamir528-rgacatacctgtagacagaattagtgpcr反应体系如下：pcr反应程序：(1)98℃5min；(2)98℃15s，55℃15s，72℃30s，30-35个循环；(3)72℃10min；(4)4℃forever。克隆结果如图1所示。(2)水稻mir397a、mir398a、mir408、mir528基因片段通过重叠pcr连接将本实施例(1)中的pcr产物(图1)进行胶回收纯化之后，进行下一步重叠pcr连接。具体操作如下：①设计桥接引物，确定各个目标片段序列以及其互补序列，设计带有接头的引物，实现前后两个pre-mirna片段的桥接。如mir397a末端25bp长度碱基序列为ctccgtagtttgcacatagcaattc，mir398a前端25bp长度碱基序列为acatggatgatctttttccttctcc，则选取合适长度重叠片段，将后一个基因的正向引物前15个碱基序列反向互补，添加在前一个基因的反向引物上，并将前一个基因的反向引物前15个碱基序列反向互补，添加在后一个基因的正向引物上。②添加酶切位点，使用pcubi-1390载体，载体图谱如图2所示，使用kpnⅰ以及speⅰ作为酶切位点。构建所需内切酶购自thermoscientific公司，所需连接酶购自takara公司，采用其推荐的酶切和连接体系进行相关反应。③使用重叠pcr方法连接mir397a、mir398a、mir408、mir528，在获得本实施例(1)中的pcr产物之后，对pcr克隆产物进行下一步的重叠pcr实验，使四个片段整合为一条序列。首先将mir397a和mir398a，mir408和mir528连接，通过将mir397a反向引物替换为mir397a-rov，mir398a正向引物替换为mir398a-fov；将mir408反向引物替换为mir408-rov，mir528正向引物替换为mir528-fov，如图3步骤(1)所示，从而使mir397a序列末端和mir398a的序列前端有30bp的相同序列；mir408序列末端和mir528的序列前端有30bp的相同序列。进行第一次重叠pcr，如图3步骤(2)所示，将添加了重叠片段的mir397a和mir398a胶回收产物各取2.5μl作为反应底物，使用mir397a-f-kpnⅰ作为正向引物，mir398a-rov作为反向引物进行pcr扩增；将添加了重叠片段的mir408和mir528胶回收产物各取2.5μl作为反应底物，使用mir408-fov作为正向引物，mir528-r-speⅰ作为反向引物进行pcr扩增。得到的重叠pcr克隆产物经过胶回收之后，进行第二次重叠pcr，如图3步骤(3)所示，将添加了重叠片段的mir397a+mir398a和mir408+mir528胶回收产物各取2.5μl作为反应底物，使用mir397a-f-kpnⅰ作为正向引物，mir528-r-speⅰ作为反向引物进行pcr扩增，最终得到总长2148bp的mir397a、mir398a、mir408、mir528连接产物。表2注：列表所示引物中，粗体字碱基表示前后两个基因片段桥接序列片段。mir397a-f-kpnⅰ和mir528-r-speⅰ引物带有酶切位点用于构建载体，其中ggtacc表示为kpnⅰ酶切位点，actagt表示为speⅰ酶切位点。第一次重叠pcr反应体系如下：pcr反应程序：(1)98℃5min；(2)98℃15s，55℃15s，72℃1min，30-35个循环；(3)72℃10min；(4)4℃forever。克隆结果如图4所示。第二次重叠pcr反应体系如下：pcr反应程序：(1)98℃5min；(2)98℃15s，55℃15s，72℃2min，30-35个循环；(3)72℃10min；(4)4℃forever。克隆结果如图5所示。(3)基于ubi启动子的水稻多mirna同时过表达载体的构建将本实施例(2)中的pcr产物(图5)进行胶回收纯化之后，进行下一步过表达载体的构建。pcubi1390载体(图2)分别进行kpni和spei双酶切；酶切体系如下：酶切程序：37℃，15min。将酶切后的各产物回收纯化后进行连接；连接体系如下：连接程序：4℃过夜；连接产物转化大肠杆菌dh5α，并在其中扩繁，经过菌落pcr及测序筛选获得阳性克隆，送样测序，其dna序列如seqidno.5所示。(4)烟草中水稻多mirna同时过表达载体功能验证获得步骤(3)中的pcubi-1390-mirs过表达质粒后，分别使用pcubi-1390-mirs过表达质粒与pcubi-1390空载质粒转化农杆菌(eha-105)实现对烟草侵染。农杆菌侵染烟草体系如下：具体操作如下：1)将检测成功的农杆菌菌液过夜扩摇，28℃，200rpm；2)取5ml菌液，加到灭菌的10ml离心管中；3)离心机设定5000g，5min，沉淀菌体(室温)，弃上清，加10ml渗透液，重悬菌体；4)重复步骤3)，进一步去除少量的抗生素；5)确定悬浮菌液对渗透液的滴定度，计算稀释系数，使得最终悬浮菌液(用于侵染)为5ml，od600为0.4-0.6；6)侵染前，将烟草放于白色荧光灯下1h，有利于气孔张开；7)选择倒三叶和倒四叶，用于侵染(于两叶脉之间侵染)，一株选两叶，侵染一种菌液，用记号笔标记待转区域将侵染后的烟草放回到培养室；8)培养48小时后，取侵染部位组织，使用takara公司rna提取试剂rnaisoplus(codeno.9108q)提取总rna，利用stem-loop方法检测四种mirna表达情况，结果如图6所示，该种载体构建技术可使水稻四种mirna同时过表达，空载质粒农杆菌无四种水稻mirna表达。序列表<110>海南浙江大学研究院<120>一种同时过表达n个mirna的方法<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>527<212>dna<213>水稻(oryzasativa)<400>1ttctaattttagcgtgaactaaacacacccctatgctaatcacttggcagtagtacaagc60tcgatctaacacacgaaagttgcagcagctgtagtacagtagtacacgcagtaccacttg120ttcaagcttggatccagtgttttccagagcgcacactattatataacgagatgcagatca180tgtcagaggggacaagtcggtatggaaacagagaatcaaatgcatcattgagtgcagcgt240tgatgaacaacggtaaccggtccatgttgatgcgcatttggccggtgatctgatcatcat300cagcgcttcactcaatcatgcgtttggcatctctgccatgcaaccactactaccaagcac360taacaacaatgcagcaactcagttatggttagaactaaagattctttttttttgtttatt420tctgttgcaacagatgatgaacacccaacagagaagaggtaattaattccgtgcaacaat480cgcatcatcttgttgatttttactccgtagtttgcacatagcaattc527<210>2<211>504<212>dna<213>水稻(oryzasativa)<400>2acatggatgatctttttccttctcctagatcatgtttatgccctatatataaattctctc60caaccatcttcttgtgttcatgactcttctcaatctaaccatatgcatcaacaatactag120cctaatggagaagctggcagtaaccactgacattatctgaagaaattacttgccggttac180agcaatgaagagaagctgaacccagaggagtggtactgagaacacaggtgccaatacaat240gtatggtgagctactgtataatggagtaattctgtaactgtgttctcaggtcaccccttt300gggtttcttctcatgattctttgtccaatttgagatagtggtatacttgaatgattagat360tggtttatcttgattcatgagcaaggatatgtctatatactagggttagacatttcggac420cgaaattcccctccgatacgatattattccggctgaatttctttaatttttcaaaatttt480cataaatttgggtaatatttattc504<210>3<211>613<212>dna<213>水稻(oryzasativa)<400>3gggcaaattggcaggctatgagatgtggtactagctagtactactgtactagcagtggaa60tggttcaaggcaaagacattgcgttgcgtgtgtatatatacatctcccatgtttcttgaa120tcttgacgatgatggcgttggcctaaccggatttgcagtgcatcaggtaagggaaaaagg180atggttagatagagagaaggggagttctgtgattggagaggagaggagacagggatgagg240cagagcatgggatggggctatcaacagatgtagattattccttgcacaagagatgatgat300gagctgtgaatgagttctgagagatggctggtgttgttgttgctccctcccctgcactgc360ctcttccctggctcccctgcacacctctctctctctctctctctctctgtgtgttagtat420attgtttttatgttttagtaattattttccttccataagtgatacggtatttgtagcatg480taggtagaaaaaaaaatgaaactagagtgatgtgacacttcaagggctgttgcaaattaa540cacattttaaaatggaccaagcgtactatttctcagcatgtggttctagctcaaaacatg600catttcattcggc613<210>4<211>504<212>dna<213>水稻(oryzasativa)<400>4gctgaaagccatagtacactgatgatatttgcaagcctgaagtacaagccgcccctaacg60atctcccccccatatgtactgcagctaacttgtactactaccagtgcaccatggccgggg120tacaaatatgccacccttcaccaatggatgcatcagcagcagccacagcaaaatttggtt180tgggataggtaggtgttatgttaggtctggttttttggctgtagcagcagcagtggaagg240ggcatgcagaggagcaggagattcagtttgaagctggacttcacttttgcctctctctcc300tgtgcttgcctcttccattcctgctgctaggctgttctgtggaagtttgcagagtttata360ttatgggtttaatcgtccatggcatcagcatcagcagcggtaggagaaacttttctgtta420ttgcaccaaactctcaacatttcggtcattctgctccaggtctgaattcatatccatttc480actaattctgtctacaggtatgtc504<210>5<211>2148<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ttctaattttagcgtgaactaaacacacccctatgctaatcacttggcagtagtacaagc60tcgatctaacacacgaaagttgcagcagctgtagtacagtagtacacgcagtaccacttg120ttcaagcttggatccagtgttttccagagcgcacactattatataacgagatgcagatca180tgtcagaggggacaagtcggtatggaaacagagaatcaaatgcatcattgagtgcagcgt240tgatgaacaacggtaaccggtccatgttgatgcgcatttggccggtgatctgatcatcat300cagcgcttcactcaatcatgcgtttggcatctctgccatgcaaccactactaccaagcac360taacaacaatgcagcaactcagttatggttagaactaaagattctttttttttgtttatt420tctgttgcaacagatgatgaacacccaacagagaagaggtaattaattccgtgcaacaat480cgcatcatcttgttgatttttactccgtagtttgcacatagcaattcacatggatgatct540ttttccttctcctagatcatgtttatgccctatatataaattctctccaaccatcttctt600gtgttcatgactcttctcaatctaaccatatgcatcaacaatactagcctaatggagaag660ctggcagtaaccactgacattatctgaagaaattacttgccggttacagcaatgaagaga720agctgaacccagaggagtggtactgagaacacaggtgccaatacaatgtatggtgagcta780ctgtataatggagtaattctgtaactgtgttctcaggtcacccctttgggtttcttctca840tgattctttgtccaatttgagatagtggtatacttgaatgattagattggtttatcttga900ttcatgagcaaggatatgtctatatactagggttagacatttcggaccgaaattcccctc960cgatacgatattattccggctgaatttctttaatttttcaaaattttcataaatttgggt1020aatatttattcgggcaaattggcaggctatgagatgtggtactagctagtactactgtac1080tagcagtggaatggttcaaggcaaagacattgcgttgcgtgtgtatatatacatctccca1140tgtttcttgaatcttgacgatgatggcgttggcctaaccggatttgcagtgcatcaggta1200agggaaaaaggatggttagatagagagaaggggagttctgtgattggagaggagaggaga1260cagggatgaggcagagcatgggatggggctatcaacagatgtagattattccttgcacaa1320gagatgatgatgagctgtgaatgagttctgagagatggctggtgttgttgttgctccctc1380ccctgcactgcctcttccctggctcccctgcacacctctctctctctctctctctctctg1440tgtgttagtatattgtttttatgttttagtaattattttccttccataagtgatacggta1500tttgtagcatgtaggtagaaaaaaaaatgaaactagagtgatgtgacacttcaagggctg1560ttgcaaattaacacattttaaaatggaccaagcgtactatttctcagcatgtggttctag1620ctcaaaacatgcatttcattcggcgctgaaagccatagtacactgatgatatttgcaagc1680ctgaagtacaagccgcccctaacgatctcccccccatatgtactgcagctaacttgtact1740actaccagtgcaccatggccggggtacaaatatgccacccttcaccaatggatgcatcag1800cagcagccacagcaaaatttggtttgggataggtaggtgttatgttaggtctggtttttt1860ggctgtagcagcagcagtggaaggggcatgcagaggagcaggagattcagtt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