一种地衣芽孢杆菌及其应用

本发明属于家畜饲料中的微生物发酵
技术领域：
，具体公开了一种地衣芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
：我国的优质牧草产量远远不能满足草食动物发展的需求，以草为主的粗饲料保障问题一直是制约牛羊产业发展的瓶颈。就农区地域环境和资源特点来说，秸秆资源饲料化是解决饲草来源的重要途径。由于秸秆资源低蛋白、低能量、高纤维等特点，直接作为饲料存在适口性差、利用率低，在瘤胃中的降解率也较低，限制了其在反刍动物粗饲料上的应用。全混合日粮(totalmixedrationstmr)是根据家畜的营养配方，将含有干草、秸秆或其它农副产品等粗饲料、精饲料、矿物质以及维生素等均匀混合而成的一种营养平衡日粮。全混合日粮便于规模化、集约化生产，饲养管理省工、省时；有效利用糟粕、秸秆等粗饲料，通过精粗比例来优化饲料配方，发挥反刍动物生长的遗传潜力，在反刍动物生产中已广泛应用。但tmr在实际应用过程中也存在一些问题：一方面饲料含水量在35％-50％，tmr容易霉烂变质，需现配现用；另一方面，秸秆坚硬粗糙，粗蛋白质含量低，半纤维素和纤维素被木质素包裹，使秸秆适口性差，影响了反刍动物的消化吸收。发酵饲料作为一种绿色、环保的新型健康饲料，由于微生物发酵可以产生大量代谢产物，在饲粮的长期保存、饲粮品质的提升以及改善动物机体代谢等方面发挥重要作用。邓雪娟在“我国生物发酵饲料研究与应用进展”(《动物营养学报》，2019，31(5))中指出，小肽、氨基酸是促进机体健康和免疫的重要代谢产物，酸溶蛋白、洗涤纤维是评价发酵饲料质量和代谢产物的重要指标。在tmr发酵饲料中，中国专利文献cn111387355a“一种可长期保存的高品质热带黑山羊用发酵型全混合日粮”和中国专利文献cn110973366a“一种反刍动物发酵全混合日粮及其制备方法”分别公开了使用外源乳酸菌和附生乳酸菌厌氧发酵tmr，能够显著提高乳酸等含量，利于tmr饲料的长期保存，但是并未提及能够改善秸秆tmr饲料的营养品质和发酵品质。在菌株筛选方面，胡爽在“青贮饲料中产纤维素酶细菌的筛选、发酵和产酶条件优化及酶学性质初探”(石河子大学，2008硕士论文)中初步筛选了一株产纤维素酶的地衣芽孢杆菌，探讨了其产酶性质，但并未研究在青贮饲料中的应用效果，也未提及其能够提高青贮饲料中的小肽和氨基酸含量及降低洗涤纤维含量。中国专利文献cn110157636a“一种地衣芽孢杆菌、筛选方法、应用及含有该地衣芽孢杆菌的饲料”中公开了使用地衣芽孢杆菌能够提高饲料桑的粗蛋白含量，降低粗纤维含量，但是只针对饲料桑秸秆，未提及其能够提高青贮饲料中的小肽和氨基酸含量及降低洗涤纤维含量。因此，基于tmr原料特性，筛选微生物菌株，开展tmr发酵菌株和发酵工艺的研究，利用微生物技术提高tmr饲料的含碳和含氮有机物的转化，提高tmr饲料的营养和发酵品质，是促进秸秆资源化高效利用，提高反刍动物生产性能的重要保证。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，其目的在于提供一种地衣芽孢杆菌及其应用。本发明的第一个发明目的是提供一种地衣芽孢杆菌ey37(bacilluslicheniformisey37)，其保藏编号为cctccno：m2021165。所述的地衣芽孢杆菌ey37(bacilluslicheniformisey37)是从草食动物肠道中筛选出来的，是具有高产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的芽孢杆菌。菌株特征：地衣芽孢杆菌ey37(bacilluslicheniformisey37)革兰氏阳性菌，杆状，产芽孢，有鞭毛；在营养琼脂培养基上培养，菌落呈圆形，边缘锯齿状，在起始ph值为4.0-8.0的培养基上能生长，在20℃-45℃条件下生长状况良好。本发明的第二个发明目的是提供所述的地衣芽孢杆菌在制备tmr发酵饲料中的应用。进一步地，所述的地衣芽孢杆菌ey37在制备tmr发酵饲料时与植物乳杆菌zrr联合使用。所述植物乳杆菌zrr为中国专利cn106148249a中的植物乳杆菌l.plantarumzrr，保藏号为cctccno:m2016281。此菌株在中国专利cn106148249a公布，并且已经保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，属于公众可以得到的材料。本发明的第三个发明目的是提供使用所述的地衣芽孢杆菌ey37制备tmr发酵饲料的方法，所述的tmr发酵饲料的制备方法，包括两步发酵，第一步是在精饲料中接种ey37进行好氧发酵，第二步是在精饲料好氧发酵后，加入粗饲料混合制成tmr饲料，再接种zrr进行厌氧发酵，得到tmr发酵饲料。进一步地，所述的精饲料和粗饲料的重量比为1：2。其中，所述的精饲料配方为：压片玉米15％，玉米粉26.3％，豆粕12.5％，棉粕7.5％，碳酸钙0.625％，预混料0.625％，糖蜜5.7％，豆渣17％，水14.75％。所述的粗饲料配方为：青贮玉米73％，燕麦干草21.3％，小麦麦秸5.7％。本发明中配方涉及的含量百分比％均为重量百分比％w/w。更进一步地，所述的tmr发酵饲料的制备方法，包括如下步骤：1)先将精饲料各组分混合，然后将ey37均匀喷洒到精饲料，ey37在精饲料中的含量为5×109cfu/kg；35℃培养24h，在第13-24h，每隔2小时翻料1次；2)精饲料好氧发酵24h后，将精饲料与粗饲料混合成tmr饲料，再将zrr均匀喷洒到tmr饲料上，zrr在tmr饲料中的含量为2.5×108cfu/kg，装入带有呼吸阀的袋中厌氧发酵14d。本发明的发明人根据微生物对生境的适应性和特异性原理，从草食动物肠道中筛选出提高tmr营养和发酵品质的专属发酵菌：地衣芽孢杆菌ey37(bacilluslicheniformisey37)。具体来说，本发明的地衣芽孢杆菌，具有下述的积极效果：(1)从实施例2的酶活测定结果可以看出，本发明的菌株ey37兼性厌氧生长，是具有高产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的芽孢杆菌。(2)从实施例3对照试验可以看出，本发明的菌株在制备tmr发酵饲料时，通过两步发酵工艺，ey37配伍zrr使用，能降低tmr发酵饲料中纤维素、半纤维素、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素的含量，有效提高tmr饲料的营养品质，促进动物碳水化合物的吸收。表明本发明有效提高了tmr饲料的碳营养品质。(3)从实施例3对照试验可以看出，本发明的菌株在制备tmr发酵饲料时，通过两步发酵工艺，ey37配伍zrr使用，能显著降解大蛋白分子，显著提高tmr饲料的酸溶蛋白、游离氨基酸和小肽等小分子有机氮含量，利于动物的蛋白吸收。表明本发明有效提高了tmr饲料的氮营养品质。(4)从实施例3对照试验可以看出，本发明的菌株在制备tmr发酵饲料时，通过两步发酵工艺，ey37配伍zrr使用，显著提高了乳酸和乙酸的含量。表明本发明有效改善发酵tmr的适口性，提高tmr饲料的发酵品质和有氧稳定性。(5)从实施例3对照试验可以看出，本发明的菌株在制备tmr发酵饲料时，通过两步发酵工艺，ey37配伍zrr使用，显著提高发酵饲料中芽孢杆菌的含量，tmr发酵饲料富含乳酸菌、芽孢杆菌等益生菌，促进动物的肠道健康。表明本发明有效促进了反刍动物肠道健康。因此，本发明的地衣芽孢杆菌ey37兼性厌氧生长，高产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，联合植物乳杆菌zrr从碳营养、氮营养、益生菌、有机酸等方面提升tmr发酵饲料的品质，具有利于动物消化吸收，促进动物肠道健康等优点，可广泛应用于发酵tmr饲料的制备领域。本发明涉及到的微生物的保藏信息如下：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；保藏单位地址：中国武汉；分类命名：地衣芽孢杆菌ey37(bacilluslicheniformisey37)；保藏编号为cctccno：m2021165；保藏日期为：2021年1月27日。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步说明，以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用的培养基购自北京奥博星生物技术有限公司。其他试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1地衣芽孢杆菌ey37(bacilluslicheniformisey37)的分离与鉴定1、分离纯化从草食动物肠道中分离纯化，得到地衣芽孢杆菌ey37，具体如下：称取1g肠道食糜加入灭菌的99ml蒸馏水中，利用恒温摇床震荡1h，然后10倍梯度稀释，分别取10-3、10-4样品稀释液，稀释液经80℃水浴10min后，取0.1ml涂布于营养琼脂，37℃培养24h，然后将其取出，依据菌落的大小、形态和颜色，挑取营养琼脂上生长的单菌落，进行革兰氏染色镜检。将革兰氏染色阳性者且镜检有芽孢，呈杆状的细菌暂定为芽孢杆菌，于营养琼脂上继续划线纯化2次。-80℃保存于含25％v/v甘油的营养肉汤液体培养基中，菌株命名为ey37。2、生理生化检测地衣芽孢杆菌ey37在起始ph值为3.0-8.0的培养基上能生长，在20℃-45℃条件下生长状况良好。本发明地衣芽孢杆菌v-p反应呈阳性，可分解葡萄糖产酸，能够分解l-阿拉伯糖、甘油、麦芽糖、纤维二塘、d-木糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、d-松二糖、甘露醇和山梨醇。3、分子鉴定将固体平板上培养24h的地衣芽孢杆菌ey37，采用菌落pcr扩增，进行16rrna基因序列鉴定。引物选用细菌的16srrna基因扩增通用引物：27f和1492r。pcr反应体系为50μl：premixtaq25μl，27f和1492r(均为20μm)1μl，补充灭菌蒸馏水至50μl，直接将菌落加入反应体系，进行pcr扩增，得到pcr产物。将pcr产物纯化后送去测序，结果为序列表中seqno.1所示。经过上述鉴定，地衣芽孢杆菌ey37于2021年1月27日，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，分类命名：地衣芽孢杆菌ey37(bacilluslicheniformisey37)，保藏号：cctccno：m2021165，保藏日期为：2021年1月27日。实施例2地衣芽孢杆菌ey37(bacilluslicheniformisey37)的酶活测定菌株活化：将冷冻保存的地衣芽孢杆菌ey37(bacilluslicheniformisey37)(以下简称ey37)划线于营养琼脂，在温度37℃下培养24h，如此传代培养2次得到ey37的单菌落。配置测定酶活的培养基，蛋白酶活分别用酪蛋白培养基和牛奶培养基测定，纤维素酶活用cmc刚果红培养基测定，淀粉酶活用淀粉酶培养基测定。酪蛋白培养基的配方：10g酪蛋白，5g蛋白胨，2.5g酵母粉，0.3g磷酸二氢钾，0.5g硫酸镁，1g氯化钠，20g琼脂粉，1000ml水；牛奶培养基的配方：30g脱脂奶粉，15g琼脂粉，100ml水；cmc刚果红培养基的配方：2g硫酸铵，0.5g硫酸镁，1g磷酸氢二钾，0.5g氯化钠；4g羧甲基纤维素钠，0.2g刚果红，20g琼脂粉，1000ml水。四种培养基分别在115℃灭菌20min，倒平板。淀粉培养基：10g蛋白胨，5g氯化钠，5g牛肉膏，10g可溶性淀粉，20g琼脂粉，1000ml水。采用接种针分别将ey37的单菌落点接到四种平板上，37℃下培养48h，淀粉酶培养基培养后用碘液染色后测定水解圈，其他酶活的水解圈直接测定。结果如表1所示。表1：地衣芽孢杆菌ey37(bacilluslicheniformisey37)的酶活测定培养基透明圈直径d(mm)菌落直径d(mm)d/d酪蛋白培养基18.94.24.5牛奶培养基21.74.15.3cmc刚果红培养基27.62.610.6淀粉培养基18.23.84.79从表1可以看出：ey37对酪蛋白和乳蛋白都有降解，透明圈直径分别为18.9mm和21.7mm，对cmc钠等纤维素的降解圈为27.6mm，对淀粉的降解透明圈为18.2mm，该结果表明ey37产蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶。实施例3地衣芽孢杆菌ey37(bacilluslicheniformisey37)在发酵tmr饲料中的应用地衣芽孢杆菌ey37菌液的制备：将实施例1所述的冷冻保存的ey37接种于营养肉汤中，在温度37℃下培养24h，得到所述的活化ey37菌液。将活化的菌液接种营养肉汤培养基中，每个1l的瓶中装培养基300ml，置于摇床上37℃振荡培养48h，使菌液的活菌数达到2.5×109cfu/g以上。植物乳杆菌zrr菌粉的制备：将冷冻保存的zrr接种于mrs液体培养基中，在温度37℃下培养24h，得到所述的活化zrr菌种。将活化的菌种接种在mrs液体培养基中37℃培养，菌液经离心，冷冻干燥、粉碎、辅料混合制成zrr的冻干粉，使植物乳杆菌冻干粉的活菌数达到1×1010cfu/g。植物乳杆菌的菌株为l.plantarumzrr,保藏号为cctccno:m2016281。此菌株在中国专利cn106148249a公布，并且已经保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，属于公众可以得到的材料。tmr发酵饲料的制备：精饲料配方为：压片玉米15％，玉米粉26.3％，豆粕12.5％，棉粕7.5％，碳酸钙0.625％，预混料0.625％，糖蜜5.7％，豆渣17％，水14.75％。粗饲料配方为：青贮玉米73％，燕麦干草21.3％，小麦麦秸5.7％。精饲料和粗饲料的重量比为1：2。设置三个试验组，三个试验组中所用精粗饲料的配方和精粗饲料的重量比均同上。试验组1：为未添加植物乳杆菌进行tmr饲料的厌氧发酵，将精粗料的各个成分混合后制成tmr饲料，装入带有呼吸阀的袋中厌氧发酵14d。试验组2：为添加植物乳杆菌zrr进行tmr饲料的厌氧发酵；将精粗料的各个成分混合后制成tmr饲料，然后zrr均匀喷洒到tmr饲料上，zrr在tmr饲料中的含量为2.5×108cfu/kg，装入带有呼吸阀的袋中厌氧发酵14d。试验组2的植物乳杆菌zrr与试验组3的植物乳杆菌zrr相同。试验组3：制备工艺分为两步发酵，一是接种ey37进行精饲料的好氧发酵，二是好氧发酵后添加粗饲料混合制成tmr饲料，接种乳酸菌进行厌氧发酵。具体如下：精料各组分混合后，将ey37均匀喷洒到精饲料，ey37在精饲料中的含量为5×109cfu/kg。35℃培养24h，在第13-24h每隔2小时翻料1次。24h后好氧发酵后，将精饲料与粗饲料混合成tmr饲料，zrr均匀喷洒到tmr饲料上，zrr在tmr饲料中的含量为2.5×108cfu/kg，装入带有呼吸阀的袋中厌氧发酵14d。对试验组1-3制备的tmr发酵饲料分别进行营养、发酵品质、有机酸和微生物的检测分析，分析方法如下：酸溶蛋白、游离氨基酸、小肽的测定参照《大豆肽粉》gbgb/t22492-2008中的方法，其中蛋白的检测使用kjeltectm2300型全自动凯氏定氮仪测定，氨基酸的测定使用la8080全自动氨基酸分析仪测定。中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、纤维素、半纤维素、酸性洗涤木质素采用ankom全自动滤袋技术测定。有机酸(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸)的测定采用高效液相色谱仪(安捷伦1260型；德国安捷伦科技有限公司)测定，配备示差检测器和色谱柱(流动相：2.5mmol/lh2so4；流速：0.5ml/min；温度：55℃；美国赛分科技有限公司)。微生物计数：采用平板培养法进行微生物计数。用0.9％无菌生理盐水进行梯度稀释，选择3个合适的梯度涂板。乳酸菌，酵母菌分别采用mrs琼脂培养基和孟加拉红琼脂培养基培养计数。稀释液80℃水浴10min，用营养琼脂培养基计数芽孢杆菌。结果见表2-5。表2：tmr饲料的氮素发酵品质(％)组别酸溶蛋白游离氨基酸小肽试验组14.09a0.97a3.13a试验组24.41b1.07b3.34b试验组34.82c1.31c3.52csem0.110.050.06p-value0.0000.0000.003表3：tmr发酵饲料的碳素营养品质(％)表4：tmr发酵饲料的有机酸(％)组别乳酸乙酸试验组13.45a0.58a试验组23.82b0.75b试验组34.46c1.13csem0.150.08p-value0.0000.000表5：tmr发酵饲料的微生物组成(logcfu)组别乳酸菌芽孢杆菌试验组17.79a3.80a试验组28.23b4.07a试验组38.30b5.19bsem0.100.27p-value0.0290.000由表2可知，和试验组1及试验组2相比，试验组3的酸溶蛋白、游离氨基酸、小肽的含量分别为4.82,％，1.31％，3.52％，显著高于其他两组，表明ey37配伍zrr使用能显著降解大蛋白分子，显著提高tmr饲料的酸溶蛋白、游离氨基酸和小肽等小分子有机氮含量，利于动物的蛋白吸收。由表3可知，试验组3的中性洗涤纤维为32.09％，显著低于试验组1和试验组2，表明ey37配伍zrr使用能显著降解纤维素类物质；另外试验3组的纤维素、半纤维素的含量分别为14.59％,16.01％，低于其他两组，表明ey37配伍zrr使用，能够降低tmr发酵饲料中纤维素、半纤维素、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素的含量，有效提高tmr饲料的营养品质，促进动物碳素营养的吸收。由表4可知，不同试验组的有机酸主要含乳酸和乙酸，丙酸和丁酸都未检出，试验组3的乳酸和乙酸含量分别为4.46％，1.13％，显著提高于试验1和试验2组，表明菌株ey37促进了tmr饲料中碳水化合物的分解，有助于zrr产酸量的增加，有利于改善发酵tmr的适口性，提高tmr饲料的发酵品质和有氧稳定性。由表5可知，和试验组1、试验组2相比，试验组3显著提高了发酵饲料中芽孢杆菌的含量，试验组2和试验3组的乳酸菌含量显著高于试验1组，tmr发酵饲料富含乳酸菌、芽孢杆菌等益生菌，促进了动物的肠道健康。以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。序列表<110>江苏省农业科学院<120>一种地衣芽孢杆菌及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1413<212>dna<213>地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)<400>1ggctggctccaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgg60gcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagc120gattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgg180gattggcttagcctcgcggcttcgctgccctttgttctgcccattgtagcacgtgtgtag240cccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcacc300ggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgt360tgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtca420ctctgcccccgaaggggaagccctatctctagggttgtcagaggatgtcaagacctggta480aggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtc540aattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgtttg600ctgcagcactaaagggcggaaaccctctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggac660taccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagttacaga720ccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacac780gtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccgg840ttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgcgcgctttacgcccaat900aattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgt960ggctttctggttaggtaccgtcaaggtaccgccctattcgaacggtacttgttcttccct1020aacaacagagttttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagac1080tttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctc1140agtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgttgccttggtgagccg1200ttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagctaaaagccac1260cttttataattgaaccatgcggttcaatcaagcatccggtattagccccggtttcccgga1320gttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatc1380agggagcaagctcccatctgtccgctcgactgc1413当前第1页12